董秀娟， 曹若愚， 于洪基， 竇素棉

(河北省滄州市中心醫(yī)院產(chǎn)科， 河北 滄州 061000)

EMs是最常見的婦科疾病之一，與育齡期女性50%的不孕癥及80%的痛經(jīng)有關(guān)，并且EMs作為一種良性疾病，卻具有惡性腫瘤般侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的能力，給女性造成極大的生理和心理負(fù)擔(dān)[1]。EMs發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，有研究發(fā)現(xiàn)腹腔局部乏氧及炎性微環(huán)境在EMs疾病進(jìn)展過程中發(fā)揮著重要作用[2]。磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/核因子E2相關(guān)因子2(PI3K/Akt/Nrf2)通路對(duì)機(jī)體氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)發(fā)揮著重要調(diào)控作用[3]。大蒜素是由百合科蔥屬植物大蒜的鱗莖中提取的一種二烯丙基三硫化物，具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫力等多種藥理學(xué)作用[4]；并且大蒜素能夠通過調(diào)控PI3K/Akt通路抑制燒傷創(chuàng)面氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[5]。本研究通過自體內(nèi)膜移植的方法制備大鼠EMs模型，探討大蒜素對(duì)EMs大鼠的治療作用以及對(duì)PI3K/Akt/Nrf2通路的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF級(jí)雌性SD大鼠45只，7周齡，體質(zhì)量170g～200g，購自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK(冀)2018-004]。分籠飼養(yǎng)于滄州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(冀)2019-006]，飼養(yǎng)環(huán)境溫度23℃～25℃、相對(duì)濕度50%～70%、光照時(shí)間12h，實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)滄州市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2藥物與試劑:大蒜素注射液購自上海禾豐制藥有限公司(批號(hào)：20200416)；PI3K特異性抑制劑LY294002購自英國(guó)Abcam公司(批號(hào)：ab120725)；戊酸雌二醇片購自拜耳醫(yī)藥保健有限公司(批號(hào)：J20190812)。HE試劑盒購自河北博海生物有限公司(批號(hào)：20200104)；腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)、干擾素γ(Interferon-γ，IFN-γ)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司(批號(hào)：SEKR-0009、SEKR-0002、SEKR-0005、SEKRT-0008)；丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、髓過氧化物酶(Myeloperoxidase，MPO)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(Catalase，CAT)試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司(批號(hào)：BC0020、SEKR-0073、BC0170、BC0200)；兔源Akt、磷酸化(p-Akt)、Nrf2、血紅素加氧酶-1(Heme oxygenase-1，HO-1)、核因子-κB(Nuclear factor-κB，NF-κB)、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體和羊抗兔IgG二抗購自北京博奧森生物科技有限公司(bsm-52010R、bsm-52129R、bs-1074R、bs-23397R、bs-23217R、bs-0061R、bs-0295G)；ECL超敏發(fā)光試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司(批號(hào)：SW2030)。

1.3主要儀器:Vevo2100型小動(dòng)物超聲儀(加拿大Visual Sonics公司)；UV2000型分光光度計(jì)(上海尤尼柯公司)；Varioskanlux型多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Scientific公司)；RM2125型石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)；AI09型光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；VE180型電泳槽、VE186型轉(zhuǎn)膜儀(上海天能科技有限公司)；GelDoc2000 凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó) Bio-Rad公司)。

1.4方 法

1.4.1EMs大鼠模型制備:取35只實(shí)驗(yàn)用大鼠，參照文獻(xiàn)[6]報(bào)道的自體內(nèi)膜移植法制備EMs大鼠模型：造模前3d開始1次/d灌胃給予戊酸雌二醇(0.1mg/kg)，以調(diào)節(jié)大鼠動(dòng)情周期使其同時(shí)發(fā)情；腹腔注射10%水合氯醛(3.5mL/kg)實(shí)施麻醉后，于尿道上端約2cm處開腹、暴露左側(cè)子宮，結(jié)扎左側(cè)子宮角并剪取約1cm長(zhǎng)度的子宮，置生理鹽水中并剪成0.5cm×0.5cm子宮內(nèi)膜組織塊，將其移植到右側(cè)腹壁皮下筋膜層、腹壁肌層之間，逐層縫合，常規(guī)飼養(yǎng)；假手術(shù)組行模型組相同的手術(shù)通路、結(jié)扎并切除左側(cè)子宮角，但不進(jìn)行自體移植。4周后，通過小動(dòng)物超聲儀檢測(cè)，腹壁下方可見暗灰色低回聲區(qū)，即為異位病灶，病灶內(nèi)黑色無回聲區(qū)則提示病灶內(nèi)有液體，通過圖像分割測(cè)量異位病灶體積≥50mm3，則認(rèn)為造模成功(圖1)。

圖1 EMs模型大鼠異位病灶超聲檢查結(jié)果

1.4.2分組與給藥:取30只模型大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組，大蒜素組和大蒜素+LY294002組；另10只大鼠設(shè)為假手術(shù)組。大蒜素組腹腔注射給予10mg/kg的大蒜素溶液(根據(jù)臨床人有效劑量折算大鼠用量)，大蒜素+LY294002組腹腔注射給予10mg/kg的大蒜素溶液加40mg/kg的LY294002溶液，假手術(shù)組和模型組腹腔注射給予生理鹽水，腹腔注射體積均為5mL/kg，給藥頻次均為1次/d，療程4周。

1.4.3子宮內(nèi)膜異位病灶體積的測(cè)量及盆腔粘連評(píng)分:末次給藥6h后，實(shí)施麻醉后開腹，取假手術(shù)組大鼠在位子宮內(nèi)膜組織及其它組大鼠內(nèi)膜異位病灶，用生理鹽水沖洗干凈后，通過卡尺測(cè)量異位病灶的長(zhǎng)(mm)、寬(mm)、高(mm)，然后按橢球體積計(jì)算公式計(jì)算病灶體積(V)，V(mm3)=0.52×長(zhǎng)×寬×高；根據(jù)Haber評(píng)分法進(jìn)行異位病變的盆腔粘連評(píng)分。

1.4.4HE染色法行子宮內(nèi)膜組織病理學(xué)檢查:取部分在位(假手術(shù)組)子宮內(nèi)膜組織或子宮內(nèi)膜異位病灶組織，置4%多聚甲醛溶液72h后，依次進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、5μm厚度切片、梯度乙醇脫蠟水化后行HE染色，用中性樹脂封片后通過光學(xué)顯微鏡觀察子宮內(nèi)膜組織或內(nèi)膜異位病灶組織病理學(xué)改變。

1.4.5ELISA法檢測(cè)子宮內(nèi)膜組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ含量:取部分在位(假手術(shù)組)子宮內(nèi)膜組織或子宮內(nèi)膜異位病灶組織，在冰上剪碎后勻漿，4℃、3000rpm離心10min后取上清液，然后按照ELISA試劑盒說明檢測(cè)子宮內(nèi)膜組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ含量。

1.4.6生化分析法檢測(cè)子宮內(nèi)膜組織中MDA含量和MPO、SOD、CAT活力:取“1.4.5”制備的組織勻漿上清液，按照試劑盒說明檢測(cè)子宮內(nèi)膜組織中MDA含量和MPO、SOD、CAT活力。

1.4.7Western blot法檢測(cè)子宮內(nèi)膜組織Akt、p-Akt、Nrf2、HO-1、NF-κB蛋白表達(dá):取每只大鼠約50mg在位子宮內(nèi)膜組織或子宮內(nèi)膜異位病灶組織，加入4℃預(yù)冷裂解液后勻漿，冰上靜置30min提取總蛋白，4℃、12000rpm離心20min后取上清液，BCA法檢測(cè)總蛋白濃度，每孔等量上樣后通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，濕法轉(zhuǎn)PVDF膜，加5%脫脂奶粉溶液室溫封閉2h，洗膜后滴加Akt(1∶1000)、p-Akt(1∶1000)、Nrf2(1∶800)、HO-1(1∶1000)、NF-κB(1∶1000)、β-actin(1∶3000)抗體4℃孵育過夜，洗膜后滴加IgG二抗(1∶5000)室溫孵育1.5h，洗膜后滴加ECL后通過凝膠成像系統(tǒng)顯示蛋白條帶，以目標(biāo)蛋白條帶灰度值與β-actin(內(nèi)參)條帶灰度值的比值半定量目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1大蒜素對(duì)EMs大鼠子宮內(nèi)膜異位病灶體積和盆腔粘連評(píng)分的影響:與模型組相比，大蒜素組和大蒜素+LY294002組子宮內(nèi)膜異位病灶體積明顯縮小、盆腔粘連評(píng)分降低(P<0.05)；與大蒜素組比較，大蒜素+LY294002組異位病灶體積增大、盆腔粘連評(píng)分升高(P<0.01)，見表1。

表1 大蒜素對(duì)EMs大鼠子宮內(nèi)膜異位病灶體積和盆腔粘連評(píng)分的影響±s)

2.2大蒜素對(duì)EMs大鼠子宮內(nèi)膜病理學(xué)改變的影響:假手術(shù)組在位子宮內(nèi)膜柱狀上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞排列整齊、致密；模型組子宮內(nèi)膜異位病灶柱狀上皮細(xì)胞排列整齊、間質(zhì)細(xì)胞致密、新生血管明顯增生等病理學(xué)改變；大蒜素組上皮細(xì)胞脫落、間質(zhì)疏松、新生血管明顯減少；與大蒜素組比較，大蒜素+LY294002組上皮細(xì)胞脫落、間質(zhì)疏松程度加重，新生血管明顯增多。見圖2。

圖2 大蒜素對(duì)EMs大鼠子宮內(nèi)膜病理學(xué)改變的影響(HE染色，×200倍)注：A.假手術(shù)組；B.模型組；C.大蒜素組；D.大蒜素+LY294002組

2.3大蒜素對(duì)EMs大鼠子宮內(nèi)膜組織TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ含量的影響:與假手術(shù)組在位子宮內(nèi)膜相比，模型組子宮內(nèi)膜異位病灶TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ含量升高(P<0.01)；與模型組相比，大蒜素組子宮內(nèi)膜異位病灶TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ含量降低(P<0.05或P<0.01)；與大蒜素組相比，大蒜素+LY294002組TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ含量降低(P<0.01)。見表2。

表2 大蒜素對(duì)EMs大鼠子宮內(nèi)膜組織TNF-α IL-1β IL-6 IFN-γ含量的影響 ±s)

2.4大蒜素對(duì)EMs大鼠子宮內(nèi)膜組織MDA含量和MPO、SOD、CAT活力的影響:與假手術(shù)組在位子宮內(nèi)膜相比，模型組子宮內(nèi)膜異位病灶MDA含量升高而MPO、SOD、CAT活力降低(P<0.01)；與模型組相比，大蒜素組和大蒜素+LY294002組子宮內(nèi)膜異位病灶MDA含量降低且MPO、SOD、CAT活力升高(P<0.05或P<0.01)；與大蒜素組相比，大蒜素+LY294002組MDA含量降低且MPO、SOD、CAT活力升高(P<0.01)。見表3。

表3 大蒜素對(duì)EMs大鼠子宮內(nèi)膜組織MDA含量和MPO SOD CAT活力的影響±s)

2.5大蒜素對(duì)EMs大鼠子宮內(nèi)膜組織Akt、p-Akt、Nrf2、HO-1、NF-κB蛋白表達(dá)的影響:與假手術(shù)組在位子宮內(nèi)膜相比，模型組子宮內(nèi)膜異位病灶p-Akt、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)下調(diào)且p-Akt/Akt降低(P<0.01)，NF-κB蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.01)，Akt表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組相比，大蒜素組和大蒜素+LY294002組子宮內(nèi)膜異位病灶p-Akt、Nrf2、HO-1表達(dá)上調(diào)且p-Akt/Akt升高(P<0.01)，NF-κB表達(dá)下調(diào)(P<0.01)，Akt表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與大蒜素組相比，大蒜素+LY294002組Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)下調(diào)且p-Akt/Akt降低(P<0.01)，NF-κB表達(dá)上調(diào)(P<0.01)，Akt表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3、表4。

圖3 大蒜素對(duì)EMs大鼠子宮內(nèi)膜組織Akt、p-Akt、Nrf2、HO-1、NF-κB蛋白表達(dá)的影響注：A.假手術(shù)組；B.模型組；C.大蒜素組；D.大蒜素+LY294002組

表4 大蒜素對(duì)EMs大鼠子宮內(nèi)膜組織Akt p-Akt Nrf2 HO-1 NF-κB蛋白表達(dá)及p-Akt/Akt的影響±s)

3 討 論

EMs是育齡期女性常見的婦科疾病之一，發(fā)病率約10%，病程反復(fù)、遷延難愈，是導(dǎo)致痛經(jīng)、盆腔痛甚至不孕的重要原因[7]。病理生理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)能夠促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞在腹腔黏附與生長(zhǎng)，在EMs的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[8,9]。

在中醫(yī)EMs屬“痛經(jīng)”、“癥瘕”、“月經(jīng)病”、“不孕”等范疇，瘀血阻滯、氣血運(yùn)行不暢是EMs的重要病理機(jī)制。大蒜為百合科蔥屬植物，其鱗莖可入藥，性溫、味辛甘，大蒜素是其主要活性成分，具有活血化瘀、益氣解毒、宣通溫補(bǔ)之功效。大鼠具有飼養(yǎng)成本低、動(dòng)情周期短、自發(fā)排卵等特點(diǎn)，移植造模法主要分為自體、同種異體、異種異體移植法，其中自體移植法具有與人體EMs病理特點(diǎn)接近、異位灶種植部位準(zhǔn)確等優(yōu)勢(shì)。本研究采用自體移植法制備EMs大鼠模型并給予大蒜素進(jìn)行治療，結(jié)果顯示，經(jīng)大蒜素治療后EMs大鼠異位病灶明顯縮小，粘連評(píng)分降低，異位病灶上皮細(xì)胞呈現(xiàn)脫落、間質(zhì)疏松且新生血管明顯減少，異位病灶中炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ含量明顯降低，抗氧化酶MPO、SOD、CAT活力明顯升高且MDA含量明顯降低，提示大蒜素對(duì)大鼠EMs具有一定的治療作用，其機(jī)制可能與抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激有關(guān)。

PI3K/Akt/Nrf2通路是細(xì)胞內(nèi)重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，在細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。PI3K由脂類和絲氨酸/蘇氨酸激酶組成，屬脂質(zhì)激酶家族成員，是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的第二信使。Akt是PI3K下游信號(hào)分子和靶激酶，能夠被PI3K誘導(dǎo)磷酸化(p-Akt)而被激活。p-Akt誘導(dǎo)Nrf2與Kelch樣ECH關(guān)聯(lián)蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein，Keap1)解離并促進(jìn)Nrf2核轉(zhuǎn)位，然后與抗氧化響應(yīng)元件(Antioxidant response element，ARE)結(jié)合而誘導(dǎo)抗氧化酶(SOD、CAT等)和HO-1轉(zhuǎn)錄表達(dá)，進(jìn)而抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)和線粒體損傷[10]。NF-κB核轉(zhuǎn)位后能夠誘導(dǎo)炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ等合成與釋放，抑制NF-κB表達(dá)則能夠明顯抑制細(xì)胞炎癥反應(yīng)，而HO-1對(duì)NF-κB表達(dá)與核轉(zhuǎn)位具有抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)大蒜素治療能夠明顯上調(diào)EMs大鼠異位病灶p-Akt、Nrf2、HO-1表達(dá)并提高Akt磷酸化比率(p-Akt/Akt)，下調(diào)NF-κB表達(dá)。此外，LY294002是一種具有細(xì)胞滲透性的小分子物質(zhì)，作用于酶的ATP結(jié)合位點(diǎn)，是P13K的高效選擇性抑制劑，本研究發(fā)現(xiàn)，LY294002能夠部分逆轉(zhuǎn)大蒜素降低EMs大鼠異位病灶體積和粘連評(píng)分、抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)PI3K/Akt/Nrf2通路相關(guān)蛋白表達(dá)的作用。提示大蒜素對(duì)大鼠EMs的治療作用可能與激活PI3K/Akt/Nrf2通路有關(guān)。

綜上所述，大蒜素對(duì)大鼠EMs具有一定的治療作用，其作用機(jī)制可能與激活PI3K/Akt/Nrf2通路，進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激有關(guān)。本研究結(jié)果為大蒜素做為EMs治療提供了理論支持。