蘇 娟， 張振忠， 張友佳

(1.新疆醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院麻醉科， 新疆 烏魯木齊 830000 2.新疆醫(yī)科大學第七附屬醫(yī)院麻醉科， 新疆 烏魯木齊 830000)

隨著外科手術的發(fā)展，孕期手術的適應癥增加，妊娠期接受外科手術的孕婦逐漸增多。七氟醚作為常用的吸入型麻醉劑，具有對呼吸道刺激小，血流動力學穩(wěn)定，麻醉/蘇醒較快的優(yōu)勢，在婦產(chǎn)科廣泛應用。然而，對于孕期婦女，七氟醚也會迅速通過胎盤到達胎兒體內，當胎兒反復或者長時間暴露于全麻藥物會造成神經(jīng)毒性[1]。2016年美國FDA也有指出，孕晚期重復或長時間(小于3h)暴露于全麻藥物可能會影響胎兒的大腦發(fā)育，造成兒童遠期的學習和記憶能力降低。然而，目前關于孕晚期母體暴露于七氟醚對子代大腦發(fā)育的影響研究較少，且機制仍待探索。對大鼠而言，七氟醚最低肺泡有效濃度值約為2.3%[2]，因此，本研究擬采用2.3%七氟醚麻醉孕晚期大鼠，觀察其對子鼠遠期大腦樹突棘發(fā)育和認知功能的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物:8只SD大鼠，由新疆醫(yī)科大學實驗動物中心提供。雌性，清潔級，3～4月齡，懷孕15～16d大鼠，體質量400～450g。分為對照組，七氟醚-1h組，七氟醚-3h組與七氟醚-6h組，每組2只。所有大鼠單籠飼養(yǎng)于22～24℃動物房中，自由進食、飲水，空氣流通且正常晝夜更替。

1.2材料與儀器:七氟醚(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；人工腦脊液(ACSF，上海碧云天生物科技有限公司)；高爾基染色試劑盒(美國HitoBiotec公司)；Anti-PSD-95抗體、Anti-BDNF抗體、Anti-β-actin抗體(武漢三鷹生物科技有限公司)；Anti-p-TrkB抗體、Anti-TrkB抗體(北京博鰲森生物科技有限公司)；HRP標記IgG(H+L)二抗(上海碧云天生物科技有限公司)；Morris水迷宮測試裝置(江蘇賽昂斯生物科技有限公司，型號：SA201)；顯微鏡(日本Olympus公司，型號：BX53)；激光掃描共聚焦顯微鏡(美國Thermo公司，型號：CX7 LZR Pro)；凝膠成像顯影儀(上海天能生物技術，型號：1600/1600R)。

1.3實驗方案:將孕晚期(19～21d)大鼠以2.3%七氟醚分別麻醉1h，3h與6h。所有大鼠單獨飼養(yǎng)，待幼鼠出生后31d(P31)，每組取12只P31幼鼠開展水迷宮訓練，第35d進行水迷宮實驗并以高濃度CO2處死，分離出全腦組織或海馬組織開展長時程電位測試、高爾基體染色與Western blot檢驗。

1.4Morris水迷宮實驗:水迷宮測試分為訓練期與測試期。訓練期將幼鼠自水迷宮各個象限依次投入水中，記錄幼鼠90s內尋找并登上逃生平臺時間，每天訓練4次，取平均時間記為逃避潛伏期，共4d。第5天進入測試期，撤去逃生平臺，將幼鼠自第I象限投入水中，記錄幼鼠首次到達平臺時間，穿越平臺次數(shù)和第Ⅲ象限停留時間。

1.5電生理測試:將P35幼鼠以CO2處死，取腦組織放入預冷的ACSF中，沿矢狀線切開大腦左右半球，固定于切片機，縱向切成約350μm厚的切片，轉移至ACSF中，30℃恒溫孵育2h。自海馬Schaffer側支處插入刺激電極，在海馬錐體神經(jīng)元CA1頂樹突區(qū)域插入記錄電極，充灌ACSF作為記錄電極內液。采用細胞外場電位模式刺激，不斷調整刺激強度和記錄電極的位置、深度，用0.05Hz的刺激頻率誘發(fā)場興奮性突觸后電位(field excitatory postsynaptic potential,fEPSP)，直到記錄出典型的場電位波形。調節(jié)刺激強度至最大響應，并以50%作為基線，固定刺激強度與記錄電極。在基線穩(wěn)定記錄20min后，應用高頻刺激誘發(fā)長時程增強(long term potentiation,LTP)，連續(xù)3串高頻脈沖，每串100Hz的100次刺激，連續(xù)記錄60min。統(tǒng)計誘導前后Slope并進行標準化計算，對長時程電位(Long-term potentiation,LTP)進行量化統(tǒng)計。

1.6高爾基體染色—樹突棘狀態(tài)評估:將P35幼鼠以CO2處死，取完整腦組織浸入預配置的溶液A、溶液B混合液，避光保存2周。轉移腦組織至溶液C中，避光保存3d。將腦組織放入預冷的異戊烷中冷凍，切成100μm厚切片。蒸餾水清洗切片后置入溶液D、溶液E混合液中反應10min，蒸餾水沖洗。將切片放在梯度酒精中脫水，再經(jīng)二甲苯I與二甲苯Ⅱ透化，最后用樹脂封片。激光掃描共聚焦顯微鏡下捕獲圖像，用Image J軟件統(tǒng)計樹突棘密度和長度(文中溶液A,B,C,D,E來自于高爾基染色試劑盒)。

1.7Western blot:將P35幼鼠以CO2處死，取海馬組織，加入RIPA裂解液研磨成單細胞懸液，靜置20min使蛋白完全裂解，離心后取上清，加入上樣緩沖液后沸水浴10min。取SDS-PAGE凝膠，每孔加入約10μg樣品與預染蛋白Marker。設置電泳條件：60V/30min，120V/60min，以上樣緩沖液到達凝膠底部為電泳終點。截取目標蛋白條帶，濕法轉膜法將凝膠上蛋白轉移至PVDF膜上，設置轉膜條件：2mA/60min，以上所有過程冰水浴。取出PVDF膜，以4%胎牛血清封閉，目的蛋白一抗稀釋液孵育PVDF膜，4℃過夜。次日，取出PVDF膜，用HRP標記IgG(H+L)二抗稀釋液孵育2h。將超敏發(fā)光液滴加在PVDF膜上，顯影獲得目的蛋白條帶。

2 結 果

2.1不同濃度七氟醚對子代大鼠學習與記憶能力的影響:隨著七氟醚麻醉時間增加，P35幼鼠的逃避潛伏期，首次到達平臺時間增加，而第Ⅲ象限停留時間占比與穿越平臺次數(shù)減少。見表1、表2。

表1 訓練期間P35幼鼠逃避潛伏期±s,n=8)

表2 測試期間P35幼鼠首次到達平臺時間、第Ⅲ象限停留時間與穿越平臺次數(shù)±s,n=8)

2.2不同濃度七氟醚對子代大鼠長時程電位的影響:與對照組相比，七氟醚-1h組P35幼鼠海馬CA1區(qū)fEPSP沒有明顯改變，但七氟醚-3h與七氟醚-6h組P35幼鼠fEPSP水平明顯降低(P<0.05)，即fEPSP斜率與七氟醚麻醉時間正相關。見圖1。

圖1 各組P35幼鼠fEPSP斜率量化統(tǒng)計與對照組相比，#P<0.05與對照組相比，#P<0.05

2.3不同濃度七氟醚對子代大鼠樹突棘發(fā)育的影響:與對照組相比，七氟醚-1h組P35幼鼠海馬CA1區(qū)樹突棘密度與長度沒有明顯改變，但七氟醚-3h與七氟醚-6h組P35幼鼠樹突棘密度與長度明顯降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組P35幼鼠樹突棘發(fā)育狀態(tài)與量化統(tǒng)計與對照組相比，#P<0.05

2.4不同濃度七氟醚對PSD-95/BDNF/TrkB蛋白表達的影響:與對照組相比，七氟醚-1h組P35幼鼠海馬區(qū)中PSD-95、BDNF與p-TrkB蛋白表達沒有明顯改變，但七氟醚-3h與七氟醚-6h組P35幼鼠海馬區(qū)中PSD-95、BDNF與p-TrkB蛋白表達明顯降低(P<0.05)。見圖3。

圖3 各組P35幼鼠PSD-95，BDNF與TrkB表達與量化統(tǒng)計與對照組相比，#P<0.05

3 討 論

以往對全麻藥物的研究顯示，胎兒或者兒童長時間或多次開展全麻手術可使幼齡動物海馬神經(jīng)元中凋亡蛋白Cleaved-Caspase-3與Bax的表達增加，使神經(jīng)元中抗凋亡蛋白含量升高，引發(fā)神經(jīng)元凋亡[3]，造成幼鼠學習與記憶能力損傷。本研究水迷宮結果中，孕晚期大鼠短期七氟醚吸入麻醉(麻醉時間≤1h)對子代P35幼鼠逃避潛伏期，穿越平臺次數(shù)和第Ⅲ象限停留時間沒有影響，即學習與記憶功能沒有改變，但孕晚期大鼠長期麻醉(麻醉時間≥3h)會導致P35認知功能損傷。因此，七氟醚麻醉對子代幼鼠的影響具有劑量依賴性。綜合該部分結果可以得出，對于孕晚期患者，全身麻醉并非完全禁忌行為，短期的七氟醚麻醉對其子代認知功能影響甚微，但由于本研究七氟醚麻醉跨越時間較廣，因此麻醉時間的選擇仍待繼續(xù)探索。

學習與記憶功能障礙是突觸可塑性損傷的宏觀表現(xiàn)。突觸可塑性是指突觸間信號傳遞效能，樹突棘是突觸的基本結構[4]。哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，樹突棘負責接收來自興奮性信號輸入，并以突觸結構向下傳遞。因此，樹突棘是大腦神經(jīng)回路發(fā)育、完善和維持的關鍵，是記憶的形成和儲存神經(jīng)生物學基礎[5]。阿爾茲海默病模型大鼠中，存在明顯的Aβ沉積與Tau蛋白纏結的同時也可觀察到明顯的樹突棘萎縮現(xiàn)象[6]。術后認知功能障礙的研究中也有表示NMDA受體介導的興奮性傳遞抑制往往也與樹突棘萎縮相關[7]。且水迷宮實驗結果較好的健康大鼠中也有顯示樹突棘密度明顯更高[8]。在樹突棘之間以突觸結構傳遞信號時，突觸前神經(jīng)元去極化，引發(fā)谷氨酸遞質釋放、激活突觸后NMDA受體，介導Ca2+內流，誘發(fā)突觸后電位幅度明顯增加，產(chǎn)生LTP[9]。因此，LTP在某一程度上也反映了學習與記憶能力。本研究結果顯示，孕晚期大鼠短期七氟醚吸入麻醉(麻醉時間≤1h)對子代P35幼鼠海馬體中樹突棘密度與LTP水平?jīng)]有影響，但孕晚期大鼠長期麻醉(麻醉時間≥3h)則導致幼鼠海馬體中樹突棘密度與LTP水平明顯降低，即七氟醚對孕晚期大鼠長期麻醉會導致幼鼠大腦發(fā)育受損。

大腦空間學習與記憶功能的執(zhí)行部位是海馬區(qū)域組織，該區(qū)域神經(jīng)元和樹突棘結構的破壞以及數(shù)量的減少，均可造成記憶和認知功能障礙[10]。PSD-95是突觸后致密物的主要成分，反映了樹突棘數(shù)量并維持突觸間的功能與形態(tài)，利于信息傳遞和記憶形成。研究中，阿爾茲海默病的發(fā)展過程中，PSD-95會出現(xiàn)連續(xù)性降低[11]。本研究中，長期七氟醚麻醉介導孕晚期大鼠子代幼鼠海馬區(qū)PSD-95表達降低，反映了樹突棘發(fā)育受損。BDNF作為分布于海馬和皮質部位的主要神經(jīng)營養(yǎng)因子，主要負責神經(jīng)元發(fā)育與調節(jié)樹突棘的生長功能。BDNF可與其高親和力受體TrkB結合，促使酪氨酸激酶發(fā)生磷酸化，觸發(fā)胞內信號轉導，提高突觸間聯(lián)系，參與LTP的形成。此外，TrkB的激活也被發(fā)現(xiàn)可以促進突觸前受體信號途徑中谷氨酸的釋放，促進樹突內PSD-95蛋白表達增加，刺激神經(jīng)元樹突棘的生長于分化。本研究中結果顯示，長期的七氟醚麻醉介導子代幼鼠海馬區(qū)BDNF表達水平明顯降低，且p-TrkB表達明顯降低，然而短期的七氟醚麻醉對BDNF與p-TrkB幾乎沒有影響。

綜上所述，我們認為孕晚期大鼠長期麻醉后幼鼠的學習與記憶能力降低是由神經(jīng)元生長營養(yǎng)因子BDNF表達減少引起。其原因是介導p-TrkB表達降低介導PSD-95蛋白減少，導致樹突棘發(fā)育受損。