蘇 娟， 張振忠， 張友佳

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科， 新疆 烏魯木齊 830000 2.新疆醫(yī)科大學(xué)第七附屬醫(yī)院麻醉科， 新疆 烏魯木齊 830000)

隨著外科手術(shù)的發(fā)展，孕期手術(shù)的適應(yīng)癥增加，妊娠期接受外科手術(shù)的孕婦逐漸增多。七氟醚作為常用的吸入型麻醉劑，具有對(duì)呼吸道刺激小，血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定，麻醉/蘇醒較快的優(yōu)勢(shì)，在婦產(chǎn)科廣泛應(yīng)用。然而，對(duì)于孕期婦女，七氟醚也會(huì)迅速通過胎盤到達(dá)胎兒體內(nèi)，當(dāng)胎兒反復(fù)或者長(zhǎng)時(shí)間暴露于全麻藥物會(huì)造成神經(jīng)毒性[1]。2016年美國(guó)FDA也有指出，孕晚期重復(fù)或長(zhǎng)時(shí)間(小于3h)暴露于全麻藥物可能會(huì)影響胎兒的大腦發(fā)育，造成兒童遠(yuǎn)期的學(xué)習(xí)和記憶能力降低。然而，目前關(guān)于孕晚期母體暴露于七氟醚對(duì)子代大腦發(fā)育的影響研究較少，且機(jī)制仍待探索。對(duì)大鼠而言，七氟醚最低肺泡有效濃度值約為2.3%[2]，因此，本研究擬采用2.3%七氟醚麻醉孕晚期大鼠，觀察其對(duì)子鼠遠(yuǎn)期大腦樹突棘發(fā)育和認(rèn)知功能的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:8只SD大鼠，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。雌性，清潔級(jí)，3～4月齡，懷孕15～16d大鼠，體質(zhì)量400～450g。分為對(duì)照組，七氟醚-1h組，七氟醚-3h組與七氟醚-6h組，每組2只。所有大鼠單籠飼養(yǎng)于22～24℃動(dòng)物房中，自由進(jìn)食、飲水，空氣流通且正常晝夜更替。

1.2材料與儀器:七氟醚(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；人工腦脊液(ACSF，上海碧云天生物科技有限公司)；高爾基染色試劑盒(美國(guó)HitoBiotec公司)；Anti-PSD-95抗體、Anti-BDNF抗體、Anti-β-actin抗體(武漢三鷹生物科技有限公司)；Anti-p-TrkB抗體、Anti-TrkB抗體(北京博鰲森生物科技有限公司)；HRP標(biāo)記IgG(H+L)二抗(上海碧云天生物科技有限公司)；Morris水迷宮測(cè)試裝置(江蘇賽昂斯生物科技有限公司，型號(hào)：SA201)；顯微鏡(日本Olympus公司，型號(hào)：BX53)；激光掃描共聚焦顯微鏡(美國(guó)Thermo公司，型號(hào)：CX7 LZR Pro)；凝膠成像顯影儀(上海天能生物技術(shù)，型號(hào)：1600/1600R)。

1.3實(shí)驗(yàn)方案:將孕晚期(19～21d)大鼠以2.3%七氟醚分別麻醉1h，3h與6h。所有大鼠單獨(dú)飼養(yǎng)，待幼鼠出生后31d(P31)，每組取12只P31幼鼠開展水迷宮訓(xùn)練，第35d進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)并以高濃度CO2處死，分離出全腦組織或海馬組織開展長(zhǎng)時(shí)程電位測(cè)試、高爾基體染色與Western blot檢驗(yàn)。

1.4Morris水迷宮實(shí)驗(yàn):水迷宮測(cè)試分為訓(xùn)練期與測(cè)試期。訓(xùn)練期將幼鼠自水迷宮各個(gè)象限依次投入水中，記錄幼鼠90s內(nèi)尋找并登上逃生平臺(tái)時(shí)間，每天訓(xùn)練4次，取平均時(shí)間記為逃避潛伏期，共4d。第5天進(jìn)入測(cè)試期，撤去逃生平臺(tái)，將幼鼠自第I象限投入水中，記錄幼鼠首次到達(dá)平臺(tái)時(shí)間，穿越平臺(tái)次數(shù)和第Ⅲ象限停留時(shí)間。

1.5電生理測(cè)試:將P35幼鼠以CO2處死，取腦組織放入預(yù)冷的ACSF中，沿矢狀線切開大腦左右半球，固定于切片機(jī)，縱向切成約350μm厚的切片，轉(zhuǎn)移至ACSF中，30℃恒溫孵育2h。自海馬Schaffer側(cè)支處插入刺激電極，在海馬錐體神經(jīng)元CA1頂樹突區(qū)域插入記錄電極，充灌ACSF作為記錄電極內(nèi)液。采用細(xì)胞外場(chǎng)電位模式刺激，不斷調(diào)整刺激強(qiáng)度和記錄電極的位置、深度，用0.05Hz的刺激頻率誘發(fā)場(chǎng)興奮性突觸后電位(field excitatory postsynaptic potential,fEPSP)，直到記錄出典型的場(chǎng)電位波形。調(diào)節(jié)刺激強(qiáng)度至最大響應(yīng)，并以50%作為基線，固定刺激強(qiáng)度與記錄電極。在基線穩(wěn)定記錄20min后，應(yīng)用高頻刺激誘發(fā)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(long term potentiation,LTP)，連續(xù)3串高頻脈沖，每串100Hz的100次刺激，連續(xù)記錄60min。統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)前后Slope并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算，對(duì)長(zhǎng)時(shí)程電位(Long-term potentiation,LTP)進(jìn)行量化統(tǒng)計(jì)。

1.6高爾基體染色—樹突棘狀態(tài)評(píng)估:將P35幼鼠以CO2處死，取完整腦組織浸入預(yù)配置的溶液A、溶液B混合液，避光保存2周。轉(zhuǎn)移腦組織至溶液C中，避光保存3d。將腦組織放入預(yù)冷的異戊烷中冷凍，切成100μm厚切片。蒸餾水清洗切片后置入溶液D、溶液E混合液中反應(yīng)10min，蒸餾水沖洗。將切片放在梯度酒精中脫水，再經(jīng)二甲苯I與二甲苯Ⅱ透化，最后用樹脂封片。激光掃描共聚焦顯微鏡下捕獲圖像，用Image J軟件統(tǒng)計(jì)樹突棘密度和長(zhǎng)度(文中溶液A,B,C,D,E來自于高爾基染色試劑盒)。

1.7Western blot:將P35幼鼠以CO2處死，取海馬組織，加入RIPA裂解液研磨成單細(xì)胞懸液，靜置20min使蛋白完全裂解，離心后取上清，加入上樣緩沖液后沸水浴10min。取SDS-PAGE凝膠，每孔加入約10μg樣品與預(yù)染蛋白Marker。設(shè)置電泳條件：60V/30min，120V/60min，以上樣緩沖液到達(dá)凝膠底部為電泳終點(diǎn)。截取目標(biāo)蛋白條帶，濕法轉(zhuǎn)膜法將凝膠上蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，設(shè)置轉(zhuǎn)膜條件：2mA/60min，以上所有過程冰水浴。取出PVDF膜，以4%胎牛血清封閉，目的蛋白一抗稀釋液孵育PVDF膜，4℃過夜。次日，取出PVDF膜，用HRP標(biāo)記IgG(H+L)二抗稀釋液孵育2h。將超敏發(fā)光液滴加在PVDF膜上，顯影獲得目的蛋白條帶。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度七氟醚對(duì)子代大鼠學(xué)習(xí)與記憶能力的影響:隨著七氟醚麻醉時(shí)間增加，P35幼鼠的逃避潛伏期，首次到達(dá)平臺(tái)時(shí)間增加，而第Ⅲ象限停留時(shí)間占比與穿越平臺(tái)次數(shù)減少。見表1、表2。

表1 訓(xùn)練期間P35幼鼠逃避潛伏期±s,n=8)

表2 測(cè)試期間P35幼鼠首次到達(dá)平臺(tái)時(shí)間、第Ⅲ象限停留時(shí)間與穿越平臺(tái)次數(shù)±s,n=8)

2.2不同濃度七氟醚對(duì)子代大鼠長(zhǎng)時(shí)程電位的影響:與對(duì)照組相比，七氟醚-1h組P35幼鼠海馬CA1區(qū)fEPSP沒有明顯改變，但七氟醚-3h與七氟醚-6h組P35幼鼠fEPSP水平明顯降低(P<0.05)，即fEPSP斜率與七氟醚麻醉時(shí)間正相關(guān)。見圖1。

圖1 各組P35幼鼠fEPSP斜率量化統(tǒng)計(jì)與對(duì)照組相比，#P<0.05與對(duì)照組相比，#P<0.05

2.3不同濃度七氟醚對(duì)子代大鼠樹突棘發(fā)育的影響:與對(duì)照組相比，七氟醚-1h組P35幼鼠海馬CA1區(qū)樹突棘密度與長(zhǎng)度沒有明顯改變，但七氟醚-3h與七氟醚-6h組P35幼鼠樹突棘密度與長(zhǎng)度明顯降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組P35幼鼠樹突棘發(fā)育狀態(tài)與量化統(tǒng)計(jì)與對(duì)照組相比，#P<0.05

2.4不同濃度七氟醚對(duì)PSD-95/BDNF/TrkB蛋白表達(dá)的影響:與對(duì)照組相比，七氟醚-1h組P35幼鼠海馬區(qū)中PSD-95、BDNF與p-TrkB蛋白表達(dá)沒有明顯改變，但七氟醚-3h與七氟醚-6h組P35幼鼠海馬區(qū)中PSD-95、BDNF與p-TrkB蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。見圖3。

圖3 各組P35幼鼠PSD-95，BDNF與TrkB表達(dá)與量化統(tǒng)計(jì)與對(duì)照組相比，#P<0.05

3 討 論

以往對(duì)全麻藥物的研究顯示，胎兒或者兒童長(zhǎng)時(shí)間或多次開展全麻手術(shù)可使幼齡動(dòng)物海馬神經(jīng)元中凋亡蛋白Cleaved-Caspase-3與Bax的表達(dá)增加，使神經(jīng)元中抗凋亡蛋白含量升高，引發(fā)神經(jīng)元凋亡[3]，造成幼鼠學(xué)習(xí)與記憶能力損傷。本研究水迷宮結(jié)果中，孕晚期大鼠短期七氟醚吸入麻醉(麻醉時(shí)間≤1h)對(duì)子代P35幼鼠逃避潛伏期，穿越平臺(tái)次數(shù)和第Ⅲ象限停留時(shí)間沒有影響，即學(xué)習(xí)與記憶功能沒有改變，但孕晚期大鼠長(zhǎng)期麻醉(麻醉時(shí)間≥3h)會(huì)導(dǎo)致P35認(rèn)知功能損傷。因此，七氟醚麻醉對(duì)子代幼鼠的影響具有劑量依賴性。綜合該部分結(jié)果可以得出，對(duì)于孕晚期患者，全身麻醉并非完全禁忌行為，短期的七氟醚麻醉對(duì)其子代認(rèn)知功能影響甚微，但由于本研究七氟醚麻醉跨越時(shí)間較廣，因此麻醉時(shí)間的選擇仍待繼續(xù)探索。

學(xué)習(xí)與記憶功能障礙是突觸可塑性損傷的宏觀表現(xiàn)。突觸可塑性是指突觸間信號(hào)傳遞效能，樹突棘是突觸的基本結(jié)構(gòu)[4]。哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，樹突棘負(fù)責(zé)接收來自興奮性信號(hào)輸入，并以突觸結(jié)構(gòu)向下傳遞。因此，樹突棘是大腦神經(jīng)回路發(fā)育、完善和維持的關(guān)鍵，是記憶的形成和儲(chǔ)存神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)[5]。阿爾茲海默病模型大鼠中，存在明顯的Aβ沉積與Tau蛋白纏結(jié)的同時(shí)也可觀察到明顯的樹突棘萎縮現(xiàn)象[6]。術(shù)后認(rèn)知功能障礙的研究中也有表示NMDA受體介導(dǎo)的興奮性傳遞抑制往往也與樹突棘萎縮相關(guān)[7]。且水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果較好的健康大鼠中也有顯示樹突棘密度明顯更高[8]。在樹突棘之間以突觸結(jié)構(gòu)傳遞信號(hào)時(shí)，突觸前神經(jīng)元去極化，引發(fā)谷氨酸遞質(zhì)釋放、激活突觸后NMDA受體，介導(dǎo)Ca2+內(nèi)流，誘發(fā)突觸后電位幅度明顯增加，產(chǎn)生LTP[9]。因此，LTP在某一程度上也反映了學(xué)習(xí)與記憶能力。本研究結(jié)果顯示，孕晚期大鼠短期七氟醚吸入麻醉(麻醉時(shí)間≤1h)對(duì)子代P35幼鼠海馬體中樹突棘密度與LTP水平?jīng)]有影響，但孕晚期大鼠長(zhǎng)期麻醉(麻醉時(shí)間≥3h)則導(dǎo)致幼鼠海馬體中樹突棘密度與LTP水平明顯降低，即七氟醚對(duì)孕晚期大鼠長(zhǎng)期麻醉會(huì)導(dǎo)致幼鼠大腦發(fā)育受損。

大腦空間學(xué)習(xí)與記憶功能的執(zhí)行部位是海馬區(qū)域組織，該區(qū)域神經(jīng)元和樹突棘結(jié)構(gòu)的破壞以及數(shù)量的減少，均可造成記憶和認(rèn)知功能障礙[10]。PSD-95是突觸后致密物的主要成分，反映了樹突棘數(shù)量并維持突觸間的功能與形態(tài)，利于信息傳遞和記憶形成。研究中，阿爾茲海默病的發(fā)展過程中，PSD-95會(huì)出現(xiàn)連續(xù)性降低[11]。本研究中，長(zhǎng)期七氟醚麻醉介導(dǎo)孕晚期大鼠子代幼鼠海馬區(qū)PSD-95表達(dá)降低，反映了樹突棘發(fā)育受損。BDNF作為分布于海馬和皮質(zhì)部位的主要神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，主要負(fù)責(zé)神經(jīng)元發(fā)育與調(diào)節(jié)樹突棘的生長(zhǎng)功能。BDNF可與其高親和力受體TrkB結(jié)合，促使酪氨酸激酶發(fā)生磷酸化，觸發(fā)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，提高突觸間聯(lián)系，參與LTP的形成。此外，TrkB的激活也被發(fā)現(xiàn)可以促進(jìn)突觸前受體信號(hào)途徑中谷氨酸的釋放，促進(jìn)樹突內(nèi)PSD-95蛋白表達(dá)增加，刺激神經(jīng)元樹突棘的生長(zhǎng)于分化。本研究中結(jié)果顯示，長(zhǎng)期的七氟醚麻醉介導(dǎo)子代幼鼠海馬區(qū)BDNF表達(dá)水平明顯降低，且p-TrkB表達(dá)明顯降低，然而短期的七氟醚麻醉對(duì)BDNF與p-TrkB幾乎沒有影響。

綜上所述，我們認(rèn)為孕晚期大鼠長(zhǎng)期麻醉后幼鼠的學(xué)習(xí)與記憶能力降低是由神經(jīng)元生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF表達(dá)減少引起。其原因是介導(dǎo)p-TrkB表達(dá)降低介導(dǎo)PSD-95蛋白減少，導(dǎo)致樹突棘發(fā)育受損。