于洋洋， 韓 超， 李 光

(中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院放療科， 遼寧 沈陽 110000)

肝細胞癌(hepatocellular carcioma,HCC)是原發(fā)性肝癌中最常見的一種組織學亞型，約占所有病例的90%[1]。HCC的惡性率極高，在全世界每年造成約70萬人的死亡，是目前世界上排名第四的癌癥死亡原因?，F(xiàn)有的治療方案包括手術(shù)切除、局部消融、肝移植、化療、分子靶向治療和免疫治療。但由于HCC早期診斷困難，腫瘤侵襲、復發(fā)率高，患者的總生存率和預后一直不佳，平均中位生存期約為1年[2]。鐵死亡(ferroptosis)是近年來公認的一種新發(fā)現(xiàn)的細胞死亡方式。鐵是人體必需的金屬，參與關(guān)鍵生化過程。當鐵在細胞中過度存在時，會破壞氧化還原，催化活性氧(ROS)的形成，產(chǎn)生氧化應激反應。氧化應激和組織的損傷和疾病有關(guān)，在細胞水平上，會導致鐵死亡和鐵依賴性細胞的死亡。然而目前對于鐵死亡的機制尚未明確，相關(guān)研究表明，鐵死亡主要通過胱氨酸/谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運系統(tǒng)(System XC-)和谷胱甘肽過氧化物酶(Gpx4)調(diào)節(jié)。System XC-通過影響細胞內(nèi)半胱氨酸的豐度決定細胞抗脂質(zhì)ROS的能力，而GPX4的活性則決定了細胞能否將脂質(zhì)ROS轉(zhuǎn)化為無毒的脂質(zhì)醇。有研究表明，鐵死亡在HCC的發(fā)生、發(fā)展起重要作用，一些化療藥，如索拉菲尼，也被證實能夠通過誘導鐵死亡而抑制HCC的進展[3]。有研究顯示不同的組織對鐵死亡的敏感性不同，不同的個體對于鐵死亡誘導劑的敏感性也存在異質(zhì)性。因此，找到HCC的鐵死亡相關(guān)性的生物標志物，建立HCC的鐵死亡預后分析模型，能夠為臨床預測HCC的復發(fā)、轉(zhuǎn)移及預后提供潛在的靶點。

1 材料與方法

1.1TCGA-LIHC轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)的下載與處理:從TCGA數(shù)據(jù)庫中，下載了TCGA-LIHC的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)格式為FPKM；從TCGA數(shù)據(jù)庫中，下載了TCGA-LIHC的clinical數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)格式為bcr xml。使用human.gtf對TCHA-LUAD的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行了基因的注釋，使用Perl語言對TCGA-LIHC中的鐵死亡基因表達譜數(shù)據(jù)進行提取。其中，鐵死亡基因來源于對PubMed數(shù)據(jù)庫下載了784篇關(guān)于鐵死亡的文章，從中提取鐵死亡的調(diào)控因子和標志物。

1.2TCGA-LIHC鐵死亡基因的差異分析:使用了R語言的limma包，對TCGA-LIHC鐵死亡基因表達譜數(shù)據(jù)進行分組，然后對正常組和腫瘤組進行差異分析，設(shè)置P<0.05，IlogFCI>1，以篩選出差異的鐵死亡基因，用于后續(xù)的分析。

1.3TCGA-LIHC鐵死亡差異基因的GO和KEGG功能富集分析:為了了解TCGA-LIHC鐵死亡差異基因參與的生物學信息，使用了R語言的org.Hs.eg.db包對差異基因進行id注釋，而后，使用colorspace，stringi和ggplot2包對差異基因進行GO和KEGG富集分析，設(shè)置標準為P<0.05。

1.4TCGA-LIHC鐵死亡預后模型的構(gòu)建:使用了Perl語言將差異的鐵死亡基因與TCGA-LIHC患者的生存時間，生存狀態(tài)數(shù)據(jù)進行了整合，使用R語言對整合數(shù)據(jù)進行單因素cox分析，篩選出與患者生存相關(guān)的鐵死亡基因，然后進一步使用多因素cox分析構(gòu)建鐵死亡預后模型，風險評分以：(coe x 鐵死亡基因的表達量)+ …… +(coe x 鐵死亡基因的表達量)展示。

1.5TCGA-LIHC鐵死亡預后模型的生存評估:使用R語言的survival包對鐵死亡預后模型進行分組，然后對高表達組和低表達組進行KM生存分析，以鑒別高低表達模型是否具備生存差異。并且使用了R語言的pheatmap包，對以生存時間為自變量的患者的生存數(shù)據(jù)進行可視化處理，以清晰展示患者的生存信息與模型高低組的關(guān)系。

1.6TCGA-LIHC鐵死亡模型的獨立預后分析與ROC評價:為了進一步挖掘TCGA-LIHC鐵死亡模型的相關(guān)獨立預后因子，使用了單因素和多因素cox對患者的年齡，性別，臨床分期，TNM分期，模型進行了分析。并且使用了R語言對預后模型以及相關(guān)因子進行了ROC曲線的繪制，以評估其診斷的準確性。

2 結(jié) 果

2.1TCGA-LIHC差異表達的鐵死亡基因的鑒定:從TCGA數(shù)據(jù)庫下載了TCGA-LIHC的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，包含了50個正常樣本和374個腫瘤樣本，從PubMed數(shù)據(jù)庫下載了784篇關(guān)于鐵死亡的文章，從中提取鐵死亡的調(diào)控因子和標志物，包含了258個鐵死亡相關(guān)基因。通過設(shè)置過濾標準為P<0.05，IlogFCI>1，共鑒定了TCGA-LIHC相關(guān)鐵死亡差異基因83個(見圖1)，其中上調(diào)基因70個，下調(diào)基因13個。用于進一步分析。

圖1 差異表達的鐵死亡基因

2.2TCGA-LIHC差異表達的鐵死亡基因的GO和KEGG富集分析:通過R語言的colorspace，stringi和ggplot2包，設(shè)置過濾標準P<0.05，篩選出與差異表達的鐵死亡基因的相關(guān)GO功能和KEGG通路。GO功能富集分析顯示，response to oxidative stress和cellular response to oxidative stress是主要的鐵死亡相關(guān)生物過程；KEGG功能富集分析顯示，F(xiàn)erroptosis和Central carbon metabolism in cancer是主要的生物通路。見圖2、圖3。

圖2 GO富集分析

圖3 KEGG富集分析

2.3TCGA-LIHC鐵死亡預后模型的構(gòu)建:對83個鐵死亡的差異基因和患者的生存時間，生存狀態(tài)進行了整合，單因素cox分析顯示了31個生存相關(guān)的鐵死亡基因(TFR2，CYBB，F(xiàn)ANCD，OXSR1，ZEB1，BLOC1S5-TXNDC5，BACH1，HMOX1，SC22D3，ATG7，ATG16L1，GPT2，GABARAPL1，TFRC，ALB，F(xiàn)LT3，PEBP1，IDH1，PRKAA1，G6PD，DRD5，SLC1A4，VDAC2，ATG3，SLC2A1，SRC，MYB，F(xiàn)TH1，CISD1，SLC38A1，MAPK1)，其中包括了7個保護基因，和24個危險基因?；?4個生存相關(guān)的鐵死亡基因的多因素cox分析，構(gòu)建了10個鐵死亡基因的預后模型。(FANCD2，ZEB1，BLOC1S5-TXNDC5，HMOX1，GABARAPL1，F(xiàn)LT3，IDH1，G6PD，VDAC2，MYB)多因素cox回歸中的系數(shù)如下：鐵死亡基因風險評分=(-0.3774×FANCD2的表達)+(-0.3774×ZEB1的表達)+(-0.3774×BLOC1S5-TXNDC5的表達)+(-0.3774×HMOX1的表達)+(-0.3774×GABARAPL1的表達)+(-0.3774×FLT3的表達)+(-0.3774×IDH1的表達)+(-0.3774×G6PD的表達)+(-0.3774×VDAC2的表達)+(-0.3774×MYB的表達)。見圖4、表1。

圖4 單因素cox分析

表1 TCGA-LIHC鐵死亡預后模型

2.4TCGA-LIHC鐵死亡預后模型的生存評估:使用R語言的survival包對TCGA-LIHC鐵死亡預后模型進行分組，然后對高表達組和低表達組進行KM生存分析，結(jié)果顯示低表達的患者具備更好的生存預后，P=1.992e-08。(見圖5)低表達組患者的風險評分相對高表達組的低，隨著風險評分的上升，死亡的患者明顯上升。見圖6、圖7。

圖5 KM生存分析

圖6 危險評分

圖7 危險評分與生存分析

2.5TCGA-LIHC鐵死亡模型的單/多因素cox分析和ROC評價:單因素和多因素cox分析分別顯示了clinical stage的P<0.001和P=0.004，riskScore的P<0.001。ROC曲線評估了鐵死亡模型的AUC為0.736，clinical stage臨床分級為0.701，這說明了臨床分期可以作為患者獨立的預后因素，并且也證明了該模型的可靠性。見圖8、圖9。

圖8 單因素和多因素cox

圖9 ROC曲線

3 討 論

全世界每年新發(fā)的肝癌患者有超過一半來自中國，目前我國的肝癌發(fā)病率仍在逐年上升。HCC被認為是肝癌中最致命的一種亞型，在我國主要發(fā)病人群集中在30～60歲，早期診斷率和5年生存率極低，80%以上患者在確診時已屬于中晚期。HCC給我國社會和經(jīng)濟都帶來了極大的危害。因此，識別能夠預測HCC臨床轉(zhuǎn)歸的新的生物標志物以及研究參與腫瘤進展的分子對于患者治療是非常重要的。

鐵死亡是一種在形態(tài)學、生化和遺傳水平上有別于其他細胞凋亡方式、以細胞內(nèi)大量鐵依賴性ROS蓄積為特點的調(diào)節(jié)性細胞死亡形式。鐵和脂質(zhì)ROS是鐵死亡過程的重要參與者，通過調(diào)節(jié)鐵代謝和影響ROS累積的基因，能夠誘導或者抑制細胞鐵死亡。相較于正常細胞，腫瘤細胞擁有較高的鐵含量和相關(guān)腫瘤基因表達，使得其對鐵死亡更加敏感，因而鐵死亡近年來也成為腫瘤學領(lǐng)域的研究熱點。

本研究對鐵死亡基因進行了GO和KEGG富集分析。分析顯示，氧化應激反應和細胞氧化應激反應是主要的鐵死亡相關(guān)生物過程；而癌癥中的鐵死亡和中央碳代謝則是主要的生物通路。

“氧化應激”最早于1985年被提出，“應激”一詞強調(diào)了可能發(fā)生在細胞內(nèi)的抗氧化劑-促氧化劑之間的失衡狀態(tài)。在一般情況下，細胞內(nèi)ROS(包括O2·、H2O2和HO·)的生成及清除是平衡的，這一過程通過一系列小分子物調(diào)控[4]。鐵因其易改變化學價的性質(zhì)，是好氧生物中產(chǎn)生有害氧化應激產(chǎn)物，即活性自由基的主要催化劑。不穩(wěn)定的、過量的鐵可以誘導H2O2生成強氧化劑HO·，參與氧化細胞大分子(包括核酸、蛋白質(zhì)、膜脂和碳水化合物等),是細胞發(fā)生鐵死亡的重要機制。鐵死亡與腫瘤密切相關(guān)，通過誘發(fā)腫瘤細胞鐵死亡，可以抑制多種癌癥的進展。近年來，亦有研究發(fā)現(xiàn)鐵死亡是包括HCC在內(nèi)的多種癌種在化療過程中產(chǎn)生耐藥的機制[5]。新陳代謝是支持細胞的重要過程，腫瘤高度增殖的特性需要特殊的新陳代謝支撐，糖酵解就是最典型的例子。有研究表明，由糖酵解的最終產(chǎn)物丙酮酸鹽中生成乙酸的機制，對中心碳代謝產(chǎn)生重要影響，但其對腫瘤微環(huán)境所產(chǎn)生的作用在很大程度上仍然是未知的。

本研究用多因素cox分析構(gòu)建了10個鐵死亡相關(guān)基因的預后模型(FANCD2，ZEB1，BLOC1S5-TXNDC5，HMOX1，GABARAPL1，F(xiàn)LT3，IDH1，G6PD，VDAC2，MYB)。本研究發(fā)現(xiàn)了新的基因BLOC1S5-TXNDC5，基礎(chǔ)研究尚缺乏相關(guān)性報告。其余9個鐵死亡相關(guān)基因均有證據(jù)表明可能與HCC的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，它們的作用機制如下。

肝臟是人體的儲鐵器官，鐵代謝與HCC的發(fā)生和進展息息相關(guān)，在我們的預后模型中，F(xiàn)ANCD2、HMOX1以及VDAC2正是通過影響腫瘤細胞的鐵死亡，從而減少HCC細胞程序性死亡的機率，導致了病情的進展。FANCD2是一種參與DNA損傷修復的核蛋白，調(diào)節(jié)與鐵代謝(如FTH1、TFR、TFRC、HAMP、HSPB1、SLC40A1和STEAP3)和脂質(zhì)過氧化(如GPX4)有關(guān)的蛋白質(zhì)的表達。通過轉(zhuǎn)錄依賴和非依賴機制，F(xiàn)ANCD2能夠抑制鐵死亡時的鐵積累和脂質(zhì)過氧化，這也解釋了KOMATSU等[6]的發(fā)現(xiàn)，即肝癌組織中FANCD2表達增高可能是預后不良的一個新的生物標志物。HMOX1亦是細胞利用鐵的關(guān)鍵基因，其編碼的的血紅素加氧酶1將血紅素降解為鐵、一氧化碳和膽綠素，據(jù)shen等報道，與癌旁組織相比，肝癌組織中鐵代謝-受體特異性抗原和蛋白表達水平存在差異，HMOX1在肝癌細胞中的表達降低，使得腫瘤細胞內(nèi)鐵含量降低，鐵死亡的幾率下降[7]。類似的，VDAC2是通過調(diào)節(jié)BAX和BAK來驅(qū)動細胞的程序性死亡的。同時，它也發(fā)揮了神經(jīng)酰胺介導的細胞死亡的直接效應器的作用。第一個被發(fā)現(xiàn)的鐵死亡激活劑Erastin，就是通過直接與VDAC2結(jié)合改變線粒體外膜的通透性，從而降低NADH氧化速率，導致了鐵死亡的發(fā)生[8]。

另外一些基因與促進HCC細胞的增殖和腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)，包括了ZEB1、MYB、GABARAPL1和FLT3。多個研究顯示，ZEB1參與了HCC的生長和轉(zhuǎn)移，常常與較差的癌癥預后相關(guān)，其機制可能是該基因觸發(fā)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，參與了癌細胞浸潤前沿關(guān)鍵因子的調(diào)控，賦予癌細胞具有前侵襲性和干細胞樣表型。MYB與HCC進展的聯(lián)系則是通過SNHG10和SCARNA13這兩個HCC驅(qū)動基因?qū)崿F(xiàn)的。LIU等發(fā)現(xiàn)GABARAPL1低表達與HCC細胞分化不良和腫瘤包膜缺失有顯著相關(guān)性，可用于預測HCC患者的預后[9]。相反的，有研究認為FLT3可能通過降低HCC患者ERK磷酸化從而阻止癌細胞的增殖。

IDH1和G6PD除了是鐵死亡相關(guān)基因，也與腫瘤細胞代謝密切相關(guān)。研究者在多個癌癥研究中發(fā)現(xiàn)，特異性IDH1突變導致一種新形態(tài)的異檸檬酸脫氫酶，產(chǎn)生一種可以改變細胞表觀遺傳程序并阻止正常分化的腫瘤代謝物。已有許多證據(jù)表明表明具有IDH樣基因表達特征的HCC是一種預后差的HCC亞型。值得注意的是，考慮到IDH1突變在肝內(nèi)膽管癌(CCA)中比在HCC中更為頻繁，Ally等認為肝癌中IDH1突變的存在可能與向膽道表型轉(zhuǎn)移有關(guān)[10]。G6PD是磷酸戊糖途徑(PPP)的限速酶，在人類惡性腫瘤中常被激活，產(chǎn)生核苷酸和脂質(zhì)合成的前體，使其即使在有氧的情況下，腫瘤細胞也能保持高的糖酵解率，Barajas等發(fā)現(xiàn)G6PD的上調(diào)與腫瘤分級、腫瘤復發(fā)率增加和患者生存率差有關(guān)，其原因可能是低分化腫瘤細胞對PPP的依賴性增加，以期快速產(chǎn)生生物量[11]。

綜上，我們的研究構(gòu)建了一個包含了10基因的鐵死亡預后模型，它們主要通過鐵死亡和癌細胞的中央碳代謝這兩個生物通路影響HCC的預后。其中FANCD2、HMOX1和VDAC2通過鐵死亡通路降低了腫瘤細胞的程序性死亡機率。而IDH1和G6PD也影響腫瘤細胞代謝。以上5個基因都與HCC的不良結(jié)果相關(guān)。除此之外，還有4個基因與HCC的增殖和轉(zhuǎn)移有關(guān)，其中ZEB1、MYB的高表達和GABARAPL1低表達可能促進HCC患者腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移，F(xiàn)LT3則可以降低腫瘤細胞的增殖。最后，BLOC1S5-TXNDC5對于HCC的預測機制不明，需要進一步的研究和探討。