于洋洋， 韓 超， 李 光

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院放療科， 遼寧 沈陽 110000)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcioma,HCC)是原發(fā)性肝癌中最常見的一種組織學(xué)亞型，約占所有病例的90%[1]。HCC的惡性率極高，在全世界每年造成約70萬人的死亡，是目前世界上排名第四的癌癥死亡原因。現(xiàn)有的治療方案包括手術(shù)切除、局部消融、肝移植、化療、分子靶向治療和免疫治療。但由于HCC早期診斷困難，腫瘤侵襲、復(fù)發(fā)率高，患者的總生存率和預(yù)后一直不佳，平均中位生存期約為1年[2]。鐵死亡(ferroptosis)是近年來公認(rèn)的一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞死亡方式。鐵是人體必需的金屬，參與關(guān)鍵生化過程。當(dāng)鐵在細(xì)胞中過度存在時，會破壞氧化還原，催化活性氧(ROS)的形成，產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。氧化應(yīng)激和組織的損傷和疾病有關(guān)，在細(xì)胞水平上，會導(dǎo)致鐵死亡和鐵依賴性細(xì)胞的死亡。然而目前對于鐵死亡的機(jī)制尚未明確，相關(guān)研究表明，鐵死亡主要通過胱氨酸/谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(System XC-)和谷胱甘肽過氧化物酶(Gpx4)調(diào)節(jié)。System XC-通過影響細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸的豐度決定細(xì)胞抗脂質(zhì)ROS的能力，而GPX4的活性則決定了細(xì)胞能否將脂質(zhì)ROS轉(zhuǎn)化為無毒的脂質(zhì)醇。有研究表明，鐵死亡在HCC的發(fā)生、發(fā)展起重要作用，一些化療藥，如索拉菲尼，也被證實(shí)能夠通過誘導(dǎo)鐵死亡而抑制HCC的進(jìn)展[3]。有研究顯示不同的組織對鐵死亡的敏感性不同，不同的個體對于鐵死亡誘導(dǎo)劑的敏感性也存在異質(zhì)性。因此，找到HCC的鐵死亡相關(guān)性的生物標(biāo)志物，建立HCC的鐵死亡預(yù)后分析模型，能夠?yàn)榕R床預(yù)測HCC的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后提供潛在的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1TCGA-LIHC轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)的下載與處理:從TCGA數(shù)據(jù)庫中，下載了TCGA-LIHC的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)格式為FPKM；從TCGA數(shù)據(jù)庫中，下載了TCGA-LIHC的clinical數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)格式為bcr xml。使用human.gtf對TCHA-LUAD的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行了基因的注釋，使用Perl語言對TCGA-LIHC中的鐵死亡基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行提取。其中，鐵死亡基因來源于對PubMed數(shù)據(jù)庫下載了784篇關(guān)于鐵死亡的文章，從中提取鐵死亡的調(diào)控因子和標(biāo)志物。

1.2TCGA-LIHC鐵死亡基因的差異分析:使用了R語言的limma包，對TCGA-LIHC鐵死亡基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分組，然后對正常組和腫瘤組進(jìn)行差異分析，設(shè)置P<0.05，IlogFCI>1，以篩選出差異的鐵死亡基因，用于后續(xù)的分析。

1.3TCGA-LIHC鐵死亡差異基因的GO和KEGG功能富集分析:為了了解TCGA-LIHC鐵死亡差異基因參與的生物學(xué)信息，使用了R語言的org.Hs.eg.db包對差異基因進(jìn)行id注釋，而后，使用colorspace，stringi和ggplot2包對差異基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。

1.4TCGA-LIHC鐵死亡預(yù)后模型的構(gòu)建:使用了Perl語言將差異的鐵死亡基因與TCGA-LIHC患者的生存時間，生存狀態(tài)數(shù)據(jù)進(jìn)行了整合，使用R語言對整合數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素cox分析，篩選出與患者生存相關(guān)的鐵死亡基因，然后進(jìn)一步使用多因素cox分析構(gòu)建鐵死亡預(yù)后模型，風(fēng)險評分以：(coe x 鐵死亡基因的表達(dá)量)+ …… +(coe x 鐵死亡基因的表達(dá)量)展示。

1.5TCGA-LIHC鐵死亡預(yù)后模型的生存評估:使用R語言的survival包對鐵死亡預(yù)后模型進(jìn)行分組，然后對高表達(dá)組和低表達(dá)組進(jìn)行KM生存分析，以鑒別高低表達(dá)模型是否具備生存差異。并且使用了R語言的pheatmap包，對以生存時間為自變量的患者的生存數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理，以清晰展示患者的生存信息與模型高低組的關(guān)系。

1.6TCGA-LIHC鐵死亡模型的獨(dú)立預(yù)后分析與ROC評價:為了進(jìn)一步挖掘TCGA-LIHC鐵死亡模型的相關(guān)獨(dú)立預(yù)后因子，使用了單因素和多因素cox對患者的年齡，性別，臨床分期，TNM分期，模型進(jìn)行了分析。并且使用了R語言對預(yù)后模型以及相關(guān)因子進(jìn)行了ROC曲線的繪制，以評估其診斷的準(zhǔn)確性。

2 結(jié) 果

2.1TCGA-LIHC差異表達(dá)的鐵死亡基因的鑒定:從TCGA數(shù)據(jù)庫下載了TCGA-LIHC的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，包含了50個正常樣本和374個腫瘤樣本，從PubMed數(shù)據(jù)庫下載了784篇關(guān)于鐵死亡的文章，從中提取鐵死亡的調(diào)控因子和標(biāo)志物，包含了258個鐵死亡相關(guān)基因。通過設(shè)置過濾標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05，IlogFCI>1，共鑒定了TCGA-LIHC相關(guān)鐵死亡差異基因83個(見圖1)，其中上調(diào)基因70個，下調(diào)基因13個。用于進(jìn)一步分析。

圖1 差異表達(dá)的鐵死亡基因

2.2TCGA-LIHC差異表達(dá)的鐵死亡基因的GO和KEGG富集分析:通過R語言的colorspace，stringi和ggplot2包，設(shè)置過濾標(biāo)準(zhǔn)P<0.05，篩選出與差異表達(dá)的鐵死亡基因的相關(guān)GO功能和KEGG通路。GO功能富集分析顯示，response to oxidative stress和cellular response to oxidative stress是主要的鐵死亡相關(guān)生物過程；KEGG功能富集分析顯示，F(xiàn)erroptosis和Central carbon metabolism in cancer是主要的生物通路。見圖2、圖3。

圖2 GO富集分析

圖3 KEGG富集分析

2.3TCGA-LIHC鐵死亡預(yù)后模型的構(gòu)建:對83個鐵死亡的差異基因和患者的生存時間，生存狀態(tài)進(jìn)行了整合，單因素cox分析顯示了31個生存相關(guān)的鐵死亡基因(TFR2，CYBB，F(xiàn)ANCD，OXSR1，ZEB1，BLOC1S5-TXNDC5，BACH1，HMOX1，SC22D3，ATG7，ATG16L1，GPT2，GABARAPL1，TFRC，ALB，F(xiàn)LT3，PEBP1，IDH1，PRKAA1，G6PD，DRD5，SLC1A4，VDAC2，ATG3，SLC2A1，SRC，MYB，F(xiàn)TH1，CISD1，SLC38A1，MAPK1)，其中包括了7個保護(hù)基因，和24個危險基因?；?4個生存相關(guān)的鐵死亡基因的多因素cox分析，構(gòu)建了10個鐵死亡基因的預(yù)后模型。(FANCD2，ZEB1，BLOC1S5-TXNDC5，HMOX1，GABARAPL1，F(xiàn)LT3，IDH1，G6PD，VDAC2，MYB)多因素cox回歸中的系數(shù)如下：鐵死亡基因風(fēng)險評分=(-0.3774×FANCD2的表達(dá))+(-0.3774×ZEB1的表達(dá))+(-0.3774×BLOC1S5-TXNDC5的表達(dá))+(-0.3774×HMOX1的表達(dá))+(-0.3774×GABARAPL1的表達(dá))+(-0.3774×FLT3的表達(dá))+(-0.3774×IDH1的表達(dá))+(-0.3774×G6PD的表達(dá))+(-0.3774×VDAC2的表達(dá))+(-0.3774×MYB的表達(dá))。見圖4、表1。

圖4 單因素cox分析

表1 TCGA-LIHC鐵死亡預(yù)后模型

2.4TCGA-LIHC鐵死亡預(yù)后模型的生存評估:使用R語言的survival包對TCGA-LIHC鐵死亡預(yù)后模型進(jìn)行分組，然后對高表達(dá)組和低表達(dá)組進(jìn)行KM生存分析，結(jié)果顯示低表達(dá)的患者具備更好的生存預(yù)后，P=1.992e-08。(見圖5)低表達(dá)組患者的風(fēng)險評分相對高表達(dá)組的低，隨著風(fēng)險評分的上升，死亡的患者明顯上升。見圖6、圖7。

圖5 KM生存分析

圖6 危險評分

圖7 危險評分與生存分析

2.5TCGA-LIHC鐵死亡模型的單/多因素cox分析和ROC評價:單因素和多因素cox分析分別顯示了clinical stage的P<0.001和P=0.004，riskScore的P<0.001。ROC曲線評估了鐵死亡模型的AUC為0.736，clinical stage臨床分級為0.701，這說明了臨床分期可以作為患者獨(dú)立的預(yù)后因素，并且也證明了該模型的可靠性。見圖8、圖9。

圖8 單因素和多因素cox

圖9 ROC曲線

3 討 論

全世界每年新發(fā)的肝癌患者有超過一半來自中國，目前我國的肝癌發(fā)病率仍在逐年上升。HCC被認(rèn)為是肝癌中最致命的一種亞型，在我國主要發(fā)病人群集中在30～60歲，早期診斷率和5年生存率極低，80%以上患者在確診時已屬于中晚期。HCC給我國社會和經(jīng)濟(jì)都帶來了極大的危害。因此，識別能夠預(yù)測HCC臨床轉(zhuǎn)歸的新的生物標(biāo)志物以及研究參與腫瘤進(jìn)展的分子對于患者治療是非常重要的。

鐵死亡是一種在形態(tài)學(xué)、生化和遺傳水平上有別于其他細(xì)胞凋亡方式、以細(xì)胞內(nèi)大量鐵依賴性ROS蓄積為特點(diǎn)的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡形式。鐵和脂質(zhì)ROS是鐵死亡過程的重要參與者，通過調(diào)節(jié)鐵代謝和影響ROS累積的基因，能夠誘導(dǎo)或者抑制細(xì)胞鐵死亡。相較于正常細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞擁有較高的鐵含量和相關(guān)腫瘤基因表達(dá)，使得其對鐵死亡更加敏感，因而鐵死亡近年來也成為腫瘤學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

本研究對鐵死亡基因進(jìn)行了GO和KEGG富集分析。分析顯示，氧化應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)是主要的鐵死亡相關(guān)生物過程；而癌癥中的鐵死亡和中央碳代謝則是主要的生物通路。

“氧化應(yīng)激”最早于1985年被提出，“應(yīng)激”一詞強(qiáng)調(diào)了可能發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)的抗氧化劑-促氧化劑之間的失衡狀態(tài)。在一般情況下，細(xì)胞內(nèi)ROS(包括O2·、H2O2和HO·)的生成及清除是平衡的，這一過程通過一系列小分子物調(diào)控[4]。鐵因其易改變化學(xué)價的性質(zhì)，是好氧生物中產(chǎn)生有害氧化應(yīng)激產(chǎn)物，即活性自由基的主要催化劑。不穩(wěn)定的、過量的鐵可以誘導(dǎo)H2O2生成強(qiáng)氧化劑HO·，參與氧化細(xì)胞大分子(包括核酸、蛋白質(zhì)、膜脂和碳水化合物等),是細(xì)胞發(fā)生鐵死亡的重要機(jī)制。鐵死亡與腫瘤密切相關(guān)，通過誘發(fā)腫瘤細(xì)胞鐵死亡，可以抑制多種癌癥的進(jìn)展。近年來，亦有研究發(fā)現(xiàn)鐵死亡是包括HCC在內(nèi)的多種癌種在化療過程中產(chǎn)生耐藥的機(jī)制[5]。新陳代謝是支持細(xì)胞的重要過程，腫瘤高度增殖的特性需要特殊的新陳代謝支撐，糖酵解就是最典型的例子。有研究表明，由糖酵解的最終產(chǎn)物丙酮酸鹽中生成乙酸的機(jī)制，對中心碳代謝產(chǎn)生重要影響，但其對腫瘤微環(huán)境所產(chǎn)生的作用在很大程度上仍然是未知的。

本研究用多因素cox分析構(gòu)建了10個鐵死亡相關(guān)基因的預(yù)后模型(FANCD2，ZEB1，BLOC1S5-TXNDC5，HMOX1，GABARAPL1，F(xiàn)LT3，IDH1，G6PD，VDAC2，MYB)。本研究發(fā)現(xiàn)了新的基因BLOC1S5-TXNDC5，基礎(chǔ)研究尚缺乏相關(guān)性報告。其余9個鐵死亡相關(guān)基因均有證據(jù)表明可能與HCC的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，它們的作用機(jī)制如下。

肝臟是人體的儲鐵器官，鐵代謝與HCC的發(fā)生和進(jìn)展息息相關(guān)，在我們的預(yù)后模型中，F(xiàn)ANCD2、HMOX1以及VDAC2正是通過影響腫瘤細(xì)胞的鐵死亡，從而減少HCC細(xì)胞程序性死亡的機(jī)率，導(dǎo)致了病情的進(jìn)展。FANCD2是一種參與DNA損傷修復(fù)的核蛋白，調(diào)節(jié)與鐵代謝(如FTH1、TFR、TFRC、HAMP、HSPB1、SLC40A1和STEAP3)和脂質(zhì)過氧化(如GPX4)有關(guān)的蛋白質(zhì)的表達(dá)。通過轉(zhuǎn)錄依賴和非依賴機(jī)制，F(xiàn)ANCD2能夠抑制鐵死亡時的鐵積累和脂質(zhì)過氧化，這也解釋了KOMATSU等[6]的發(fā)現(xiàn)，即肝癌組織中FANCD2表達(dá)增高可能是預(yù)后不良的一個新的生物標(biāo)志物。HMOX1亦是細(xì)胞利用鐵的關(guān)鍵基因，其編碼的的血紅素加氧酶1將血紅素降解為鐵、一氧化碳和膽綠素，據(jù)shen等報道，與癌旁組織相比，肝癌組織中鐵代謝-受體特異性抗原和蛋白表達(dá)水平存在差異，HMOX1在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)降低，使得腫瘤細(xì)胞內(nèi)鐵含量降低，鐵死亡的幾率下降[7]。類似的，VDAC2是通過調(diào)節(jié)BAX和BAK來驅(qū)動細(xì)胞的程序性死亡的。同時，它也發(fā)揮了神經(jīng)酰胺介導(dǎo)的細(xì)胞死亡的直接效應(yīng)器的作用。第一個被發(fā)現(xiàn)的鐵死亡激活劑Erastin，就是通過直接與VDAC2結(jié)合改變線粒體外膜的通透性，從而降低NADH氧化速率，導(dǎo)致了鐵死亡的發(fā)生[8]。

另外一些基因與促進(jìn)HCC細(xì)胞的增殖和腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)，包括了ZEB1、MYB、GABARAPL1和FLT3。多個研究顯示，ZEB1參與了HCC的生長和轉(zhuǎn)移，常常與較差的癌癥預(yù)后相關(guān)，其機(jī)制可能是該基因觸發(fā)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，參與了癌細(xì)胞浸潤前沿關(guān)鍵因子的調(diào)控，賦予癌細(xì)胞具有前侵襲性和干細(xì)胞樣表型。MYB與HCC進(jìn)展的聯(lián)系則是通過SNHG10和SCARNA13這兩個HCC驅(qū)動基因?qū)崿F(xiàn)的。LIU等發(fā)現(xiàn)GABARAPL1低表達(dá)與HCC細(xì)胞分化不良和腫瘤包膜缺失有顯著相關(guān)性，可用于預(yù)測HCC患者的預(yù)后[9]。相反的，有研究認(rèn)為FLT3可能通過降低HCC患者ERK磷酸化從而阻止癌細(xì)胞的增殖。

IDH1和G6PD除了是鐵死亡相關(guān)基因，也與腫瘤細(xì)胞代謝密切相關(guān)。研究者在多個癌癥研究中發(fā)現(xiàn)，特異性IDH1突變導(dǎo)致一種新形態(tài)的異檸檬酸脫氫酶，產(chǎn)生一種可以改變細(xì)胞表觀遺傳程序并阻止正常分化的腫瘤代謝物。已有許多證據(jù)表明表明具有IDH樣基因表達(dá)特征的HCC是一種預(yù)后差的HCC亞型。值得注意的是，考慮到IDH1突變在肝內(nèi)膽管癌(CCA)中比在HCC中更為頻繁，Ally等認(rèn)為肝癌中IDH1突變的存在可能與向膽道表型轉(zhuǎn)移有關(guān)[10]。G6PD是磷酸戊糖途徑(PPP)的限速酶，在人類惡性腫瘤中常被激活，產(chǎn)生核苷酸和脂質(zhì)合成的前體，使其即使在有氧的情況下，腫瘤細(xì)胞也能保持高的糖酵解率，Barajas等發(fā)現(xiàn)G6PD的上調(diào)與腫瘤分級、腫瘤復(fù)發(fā)率增加和患者生存率差有關(guān)，其原因可能是低分化腫瘤細(xì)胞對PPP的依賴性增加，以期快速產(chǎn)生生物量[11]。

綜上，我們的研究構(gòu)建了一個包含了10基因的鐵死亡預(yù)后模型，它們主要通過鐵死亡和癌細(xì)胞的中央碳代謝這兩個生物通路影響HCC的預(yù)后。其中FANCD2、HMOX1和VDAC2通過鐵死亡通路降低了腫瘤細(xì)胞的程序性死亡機(jī)率。而IDH1和G6PD也影響腫瘤細(xì)胞代謝。以上5個基因都與HCC的不良結(jié)果相關(guān)。除此之外，還有4個基因與HCC的增殖和轉(zhuǎn)移有關(guān)，其中ZEB1、MYB的高表達(dá)和GABARAPL1低表達(dá)可能促進(jìn)HCC患者腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移，F(xiàn)LT3則可以降低腫瘤細(xì)胞的增殖。最后，BLOC1S5-TXNDC5對于HCC的預(yù)測機(jī)制不明，需要進(jìn)一步的研究和探討。