莊海容， 吳子?xùn)|， 陳雪紅， 李成軍

(海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院眼科， 海南 ?？?570311)

過(guò)敏性結(jié)膜炎(allergic conjunctivitis，AC)是一種常見(jiàn)的過(guò)敏性眼表疾病，多發(fā)于兒童與青少年人群中，臨床表現(xiàn)為眼部瘙癢、腫脹、發(fā)紅、流淚和畏光等癥狀，通常與鼻炎、哮喘和其他過(guò)敏性疾病的發(fā)作密切相關(guān)[1,2]。近年來(lái)，由于空氣污染和氣候變暖，AC的發(fā)病率逐年增高，這嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。AC主要與免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)介導(dǎo)的I型過(guò)敏反應(yīng)和T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的IV型超敏反應(yīng)有關(guān)[3]，但具體介導(dǎo)的其病理生理過(guò)程尚未明確。斑蝥素(cantharidin，CTD)是從昆蟲(chóng)大斑蝥中提取的一種主要活性成分，具有促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)、皮膚止癢等藥理作用。去甲斑蝥素(norcantharidin，NCTD)是CTD的去甲甲基化合物，與CTD相比，具有易合成、副作用少、活性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)，人們對(duì)NCTD的關(guān)注度越來(lái)越高，尤其是其抗癌作用。各種臨床和實(shí)驗(yàn)研究證明其對(duì)多種癌細(xì)胞具有強(qiáng)大而廣泛的抗腫瘤作用，如膽管癌、鼻咽癌、肺癌、直腸癌和乳腺癌等[4～6]，特別是對(duì)肝癌的預(yù)后顯示出良好效果[7]，其機(jī)制主要包括抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和侵襲，并介導(dǎo)調(diào)控細(xì)胞自噬和多個(gè)相關(guān)信號(hào)通路。此外，NCTD還具有增強(qiáng)免疫、抗血小板聚集和抑制腎間質(zhì)纖維化的作用，由此說(shuō)明，NCTD可能具有更廣泛生物活性作用有待挖掘。已有研究表明，NCTD能夠明顯抑制新生血管的生成[8]，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性生長(zhǎng)因子，能夠誘導(dǎo)血管生成。因此，本研究通過(guò)構(gòu)建AC大鼠模型，檢測(cè)經(jīng)NCTD作用的AC大鼠角結(jié)膜組織的病理情況，Th1/Th2細(xì)胞比例的變化，以及VEGF相關(guān)途徑蛋白的表達(dá)，綜合探討NCTD對(duì)AC大鼠模型的治療作用及其意義。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康清潔級(jí)SD大鼠，40只，8周齡，體質(zhì)量為200～220g，飼養(yǎng)環(huán)境設(shè)置為溫度(22±2)℃、相對(duì)濕度40～60%、光照/黑暗各12h循環(huán)，自由飲食、飲水。適應(yīng)性飼喂一周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，本研究獲得我院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2主要材料與試劑：去甲斑蝥素(norcantharidin,NCTD，純度>99%，生產(chǎn)批號(hào)CPRS100414)購(gòu)自上海博頓生物化工有限公司，卵清蛋白(OVA)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，HE試劑盒和PAS試劑盒購(gòu)自北京雷根生物有限公司，大鼠特異性ELISA試劑盒購(gòu)自南京凱基生物公司，RNAiso Plus和SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司，免疫熒光染色試劑購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司，RIPA溶液、BCA蛋白測(cè)定試劑盒和ECL發(fā)光液購(gòu)自上海碧云天生物研究所，Cy5-A CD4、PE-A IFN-γ、PE-A IL-4抗體購(gòu)自美國(guó)e Biloscience公司，兔抗VEGF、VEGFR2單克隆抗體、兔抗GAPDH多克隆抗體及TRITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)市售分析純。

1.3方 法

1.3.1動(dòng)物建模、分組及給藥：參考文獻(xiàn)[9]方法，采用OVA致敏法建立SD大鼠AC模型。第1天大鼠通過(guò)皮下注射含100μg OVA和5mg佐劑Al(OH)3的PBS溶液200μL，將大鼠致敏；第7天腹腔注射含100μg OVA的PBS溶液200μL；第8～13天，用含80μg/μL OVA的生理鹽水溶液點(diǎn)眼以加強(qiáng)致敏；第14天和第16天，分別用含150μg/μL、0.15mg/μL OVA的PBS溶液點(diǎn)眼以進(jìn)行致敏原攻擊；第17天，再以腹腔注射含100μg OVA的PBS溶液200 μL；第18天和第20天，用含0.15mg/μL OVA的PBS溶液點(diǎn)眼進(jìn)行致敏原攻擊；第17～26天，各組連續(xù)給藥10d；第27天，再用含0.15 mg/μL OVA的PBS溶液點(diǎn)眼，再次進(jìn)行致敏原攻擊，20min后觀察大鼠眼部體征并記錄。將40只SD大鼠按照數(shù)字隨機(jī)表法分為4組，包括對(duì)照組、模型組、NCTD低劑量組和NCTD高劑量組，每組10只，除對(duì)照組外，其余3組建立AC模型，在給藥期間，對(duì)照組和模型組給予生理鹽水，NCTD低、高劑量組分別按0.05mg·kg-1·d-1、0.1mg·kg-1·d-1的劑量給予NCTD灌胃，連續(xù)10d。

1.3.2模型大鼠眼部體征觀察及評(píng)估：大鼠OVA末次致敏后，雙盲法通過(guò)臺(tái)式裂隙燈顯微鏡觀察其眼部體征，包括：結(jié)膜水腫、充血，眼瞼充血、水腫，分泌物產(chǎn)生，根據(jù)Magone等[10]的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分，4種指標(biāo)評(píng)分分別記為0～3分，相加得出評(píng)分，最低為0分，最高為12分，以此判斷大鼠眼部癥狀嚴(yán)重程度。

1.3.3眼部病理學(xué)變化觀察：斷頸法處死各組大鼠，迅速摘除眼球，取角膜組織與結(jié)膜組織，清洗固定后，置于OCT包埋劑中，切成4μm的組織薄片。蘇木精-伊紅(HE)染色觀察角膜組織病理學(xué)變化，切片常溫下復(fù)溫，脫蠟脫水，浸入蘇木素染色8min，自來(lái)水沖洗，1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來(lái)水沖洗，伊紅浸染3min，自來(lái)水沖洗，常規(guī)脫水，二甲苯透明，以中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡觀察組織形態(tài)并采集圖像。高碘酸‐希夫(PAS)染色觀察結(jié)膜組織，統(tǒng)計(jì)結(jié)膜區(qū)域下穹窿0.1mm2區(qū)域中的杯狀細(xì)胞數(shù)目。切片復(fù)溫后，脫蠟脫水，浸入阿利新藍(lán)溶液染色10min，自來(lái)水沖洗，過(guò)碘酸溶液氧化5min，Leagene SchiffReagent染色10min，流水沖洗，蘇木素染核，乙醇分化，氨水溶液返藍(lán)，自來(lái)水沖洗后，常規(guī)脫水，二甲苯透明，以中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡觀察組織染色情況并采集圖像。

1.3.4血清細(xì)胞因子分析：各組大鼠腹主動(dòng)脈采血，室溫靜置2h，再以4000r/min離心15min，收集上清，使用特異性ELISA試劑盒檢測(cè)各組大鼠血清中細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-5、IL-10及IFN-γ的含量，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th1/Th2細(xì)胞比值：無(wú)菌環(huán)境下摘取大鼠脾臟組織，清洗干凈，于勻漿器中充分研磨，鋼篩過(guò)濾，以4000r/min離心10min，棄上清留取沉淀，PBS洗滌，利用分離液分離獲得單個(gè)核細(xì)胞。取1mL細(xì)胞懸液，再以1000r/min離心10min，留取沉淀，適量緩沖液重懸，依次加入Cy5-A CD4以及PE-A IFN-γ、PE-A IL-4抗體各10μL，均勻后，室溫避光靜置30min，離心再以PBS重懸，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th1、Th2細(xì)胞百分比，計(jì)算Th1/Th2比值。

1.3.6總RNA提取與實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)：取結(jié)膜組織加入RNAiso Plus試劑，于勻漿器中充分研磨，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取組織總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)量樣品OD值，測(cè)定RNA的質(zhì)量與濃度。將總RNA通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄操作合成cDNA，再以cDNA為模版，采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)目的基因mRNA表達(dá)水平，以GAPDH為內(nèi)參基因，擴(kuò)增體系：cDNA 2μL、上游引物/下游引物各0.5μL、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10μL、加無(wú)酶水補(bǔ)足20μL；擴(kuò)增條件：95℃ 3min(第一階段，1個(gè)循環(huán))；95℃ 12s，62℃ 40s，95℃ 15s(第二階段，45個(gè)循環(huán))。引物具體序列如下：IFN-γ上游引物：5’-AGCCGCCACATCAAACACATA-3’，下游引物：5’-CGCTGGATTCTCAAGTCGTT-3’；IL-4上游引物：5’-ACGCCATCAGGAAGGTTGTT-3’，下游引物：5’-GTGCCCACCGCTGTGCTTAC-3’；GAPDH上游引物：5’-AACGGATTTGGTCGTATTG-3’,下游引物：5’-GGAAGATGGTGATGGGATT-3’。檢測(cè)結(jié)束后，2-△△Ct法計(jì)算基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.7免疫熒光染色檢測(cè)VEGF表達(dá)：將制備的角膜組織切片解凍復(fù)溫，使用4%甲醛溶液固定20min，浸入0.2%Triton X-100中透化20min，以10%山羊血清室溫封閉30min，再與兔抗VEGF單克隆抗體(1∶200)共同置于4℃隔夜孵育。次日，棄去原液，加入TRITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶200)，室溫下孵育2h，DAPI染核10min，以中性樹(shù)膠封片，熒光顯微鏡觀察組織染色情況并采集圖像，隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)數(shù)該視野下陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)，以陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)作為陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)。

1.3.8Western Blot法：無(wú)菌環(huán)境下將眼結(jié)膜組織剪碎，加入RIPA溶液置于冰上裂解45min，超聲裂解20min，以12000r/min離心30min，取上清液，BCA法進(jìn)行蛋白定量。制備10%SDS-PAGE凝膠，取等量蛋白加入膠孔，通過(guò)電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，用5%脫脂奶粉在室溫下封閉1h，加入稀釋的一抗(1∶1000)，4℃隔夜孵育。次日，棄去原液，洗膜后加入對(duì)應(yīng)稀釋后的二抗(1∶5000)，37℃孵育1h，再次洗膜后，ECL發(fā)光液顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍照，Image ProPlus軟件分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參蛋白，以目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值的比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1大鼠眼部體征觀察及炎癥評(píng)分：通過(guò)觀察可見(jiàn)對(duì)照組大鼠結(jié)膜無(wú)明顯充血紅腫，未見(jiàn)分泌物，眼裂大小正常，精神狀況良好；模型組大鼠結(jié)膜明顯充血紅腫，眼裂變小、流淚、分泌物增多且浸潤(rùn)至眼周，精神狀況較差，活動(dòng)減少，炎癥評(píng)分顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；NCTD低、高劑量組大鼠結(jié)膜充血紅腫現(xiàn)象較模型組明顯緩解，流淚、分泌物均減少，炎癥評(píng)分顯著下降(P<0.01)，且NCTD高劑量組炎癥評(píng)分顯著低于NCTD低劑量組(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠炎癥評(píng)分比較±s)

2.2去甲斑蝥素對(duì)AC大鼠角結(jié)膜病理變化的影響：HE染色可見(jiàn)對(duì)照組角膜組織結(jié)構(gòu)清晰，角膜上皮細(xì)胞層整齊緊密排列，未見(jiàn)炎癥浸潤(rùn)現(xiàn)象；模型組角膜表面不平，結(jié)構(gòu)疏松，角膜上皮細(xì)胞層有缺損細(xì)胞，可見(jiàn)新生血管產(chǎn)生；NCTD低、高劑量組的角膜組織中上皮細(xì)胞排列較為緊密，較模型組未見(jiàn)明顯缺損現(xiàn)象，新生血管減少，且NCTD高劑量組病理改善作用更加明顯，見(jiàn)圖1A。PAS染色觀察到對(duì)照組結(jié)膜有大量杯狀細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)飽滿、體積較大，而模型組結(jié)膜中杯狀細(xì)胞大量減少，細(xì)胞數(shù)目較對(duì)照組顯著下降(P<0.01)，形態(tài)欠規(guī)則；與模型組比較，NCTD低、高劑量組的結(jié)膜中杯狀細(xì)胞數(shù)目顯著增加(P<0.01)，細(xì)胞間接較為緊密，見(jiàn)圖1B與圖1C。

圖1 各組大鼠角結(jié)膜病理變化觀察注：A：HE染色觀察角膜組織，箭頭所指為新生血管(比例尺=100μm)；B：PAS染色觀察結(jié)膜組織，箭頭所指為杯狀細(xì)胞(比例尺=100μm)；C：大鼠結(jié)膜組織杯狀細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計(jì)。與對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01；與NCTD低劑量組比較，^^P<0.01。

2.3去甲斑蝥素對(duì)AC大鼠血清細(xì)胞因子水平的影響：ELISA檢測(cè)結(jié)果如表2所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中IL-2、IFN-γ含量顯著降低，IL-4、IL-5、IL-10含量顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，NCTD低、高劑量組IL-2、IFN-γ含量顯著升高，而IL-4、IL-5及IL-10含量顯著降低(P<0.01)；同時(shí)，NCTD高劑量組IL-2、IFN-γ含量顯著高于NCTD低劑量組，IL-4、IL-5、IL-10含量顯著低于NCTD低劑量組(P<0.01)。

表2 各組大鼠細(xì)胞因子水平比較±s,pg/mL)

2.4去甲斑蝥素對(duì)AC大鼠Th1/Th2免疫平衡的影響：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)Th1細(xì)胞比例和Th1/Th2比值均顯著減少，Th2細(xì)胞比例顯著增加(P<0.01)；與模型組比較，NCTD低、高劑量組Th1細(xì)胞比例和Th1/Th2比值均顯著增加，Th2細(xì)胞比例顯著減少(P<0.01)；而相較于NCTD低劑量組，NCTD高劑量組Th1細(xì)胞比例及Th1/Th2比值顯著增加，Th2細(xì)胞比例顯著減少(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠脾臟淋巴細(xì)胞Th1、Th2比例及Th1/Th2比值比較注：與對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01；與NCTD低劑量組比較，^^P<0.01

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組大鼠結(jié)膜組織中IFN-γ mRNA表達(dá)較對(duì)照組顯著下調(diào)，IL-4 mRNA表達(dá)較對(duì)照組顯著上調(diào)(P<0.01)；與模型組比較，NCTD低、高劑量組IFN-γ mRNA表達(dá)顯著上調(diào)，IL-4 mRNA表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)；與NCTD低劑量組比較，NCTD高劑量組IFN-γ mRNA表達(dá)顯著上調(diào)，IL-4 mRNA表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)，見(jiàn)圖3。

圖3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組大鼠結(jié)膜組織IL-4與IFN-γ mRNA表達(dá)注：與對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01；與NCTD低劑量組比較，^^P<0.01

2.5去甲斑蝥素對(duì)AC大鼠VEGF相關(guān)途徑蛋白表達(dá)的影響：免疫熒光染色觀察各組大鼠角膜組織VEGF表達(dá)，可見(jiàn)對(duì)照組角膜組織中染色強(qiáng)度弱，VEGF陽(yáng)性表達(dá)低；模型組中染色強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，VEGF陽(yáng)性表達(dá)率較對(duì)照組顯著增加(P<0.01)；與模型組比較，NCTD低、高劑量組染色強(qiáng)度明顯減弱，VEGF陽(yáng)性表達(dá)率顯著減少(P<0.01)；NCTD高劑量組染色強(qiáng)度較低劑量減弱，VEGF陽(yáng)性表達(dá)率顯著減少(P<0.01)，見(jiàn)圖4。

圖4 免疫熒光染色檢測(cè)各組大鼠角膜組織VEGF表達(dá)(比例尺=50μm)注：與對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01；與NCTD低劑量組比較，^^P<0.01

Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組結(jié)膜組織中VEGF、VEGFR2蛋白表達(dá)水平均較對(duì)照組顯著上調(diào)(P<0.01)；與模型組比較，NCTD低、高劑量組中VEGF、VEGFR2蛋白表達(dá)水平均顯著下調(diào)(P<0.01)；此外，NCTD高劑量組中VEGF、VEGFR2蛋白表達(dá)水平均較NCTD低劑量組顯著下調(diào)(P<0.01)，見(jiàn)圖5。

圖5 Western Blot檢測(cè)各組大鼠結(jié)膜組織中VEGF、VEGFR2蛋白表達(dá)注：與對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01；與NCTD低劑量組比較，^^P<0.01

3 討 論

AC作為常見(jiàn)的眼病之一，可分為5種類型，包括季節(jié)性過(guò)敏性結(jié)膜炎(SAC)、常年性過(guò)敏性結(jié)膜炎(PAC)、巨乳頭狀結(jié)膜炎(GPC)、春季角結(jié)膜炎(VKC)以及特應(yīng)性角結(jié)膜炎(AKC)，后兩種嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致視力功能出現(xiàn)障礙。據(jù)統(tǒng)計(jì)，AC的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)為6%～30%，除了過(guò)敏體質(zhì)和遺傳因素外，環(huán)境也是AC發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素，并與過(guò)敏性疾病密切相關(guān)，在過(guò)敏性鼻炎患者中有30%～70%的患者患有AC[2]。AC作為一種季節(jié)性且反復(fù)發(fā)作的疾病，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)?dǎo)致視力障礙，不僅影響了患者的日常活動(dòng)，而且對(duì)其身心狀態(tài)造成不利影響。目前，AC已被視為全球主要的公共衛(wèi)生問(wèn)題，對(duì)AC的治療包括非藥物治療和藥物治療，包括識(shí)別和避免過(guò)敏觸發(fā)因素和惡化因素，以及外用抗組胺藥、肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑、非甾體抗炎藥和類固醇等[11]，然而，這些抗生素治療的療程較長(zhǎng)，易產(chǎn)生耐藥性，并具有一定的毒副作用，因此難以根除。AC的特征是炎細(xì)胞浸潤(rùn)，IgE能夠與肥大細(xì)胞上的受體結(jié)合，通過(guò)分泌炎癥因子引起一系列不良反應(yīng)，因此，抑制炎癥反應(yīng)是緩解AC的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

NCTD作為一種有效的抗癌藥物，已在臨床上用于治療癌癥。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展及一些疾病治療分子機(jī)制的深入探究，NCTD在一些炎癥疾病和其他疾病中的作用也被揭示。例如，Shen等[12]研究表明NCTD能夠降低膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠的關(guān)節(jié)炎評(píng)分，減輕大鼠踝關(guān)節(jié)的病理改變，并抑制血清炎癥因子水平，說(shuō)明了NCTD對(duì)膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠具有治療作用；陳東軍等[13]采用NCTD治療增殖性狼瘡性腎炎患者后發(fā)現(xiàn)，NCTD較單純采用標(biāo)準(zhǔn)免疫抑制劑治療具有更顯著的臨床療效和良好的遠(yuǎn)期預(yù)后。鑒于以往這些研究結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在構(gòu)建的AC大鼠模型中施以NCTD作用，結(jié)果顯示出AC大鼠結(jié)膜充血紅腫現(xiàn)象得到明顯緩解，流淚和分泌物均減少，炎癥評(píng)分也下降，經(jīng)過(guò)眼部病理學(xué)檢測(cè)顯示AC大鼠角膜上皮細(xì)胞損傷和新生血管均減少，結(jié)膜杯狀細(xì)胞數(shù)目增加。由此推測(cè)，NCTD對(duì)AC大鼠具有良好的治療效果。

AC的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，目前尚未完全闡明，已知輔助性T細(xì)胞在免疫功能障礙中起著至關(guān)重要的作用，在AC致敏階段，個(gè)體眼部暴露于由樹(shù)突細(xì)胞和/或其他抗原呈遞細(xì)胞處理和呈遞新型過(guò)敏原的初始遺傳易感性，會(huì)導(dǎo)致CD4幼稚細(xì)胞或輔助性T細(xì)胞的成熟并分化為Th2型細(xì)胞[14]。Th2細(xì)胞的致敏和分化需要樹(shù)突狀細(xì)胞呈遞抗原，其主要通過(guò)釋放IL-3、IL-4、IL-5、IL-9、IL-10和IL-13等因子參與IgE介導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)，阻止Th1細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，例如IL-2、IFN-γ，以妨礙T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。此外，Th1細(xì)胞能夠抑制肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞的分化和增殖。在正常情況下，機(jī)體內(nèi)的Th1/Th2處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，彼此之間相互調(diào)節(jié)以維持體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。Th1/Th2失衡是AC發(fā)生的一個(gè)重要機(jī)制，Th2及相關(guān)反應(yīng)增強(qiáng)導(dǎo)致了炎細(xì)胞浸潤(rùn)。本研究顯示，NCTD干預(yù)AC大鼠模型后檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)，結(jié)果顯示血清IL-2、IFN-γ含量升高，IL-4、IL-5及IL-10含量降低，結(jié)膜組織中IFN-γ mRNA表達(dá)上調(diào)，IL-4 mRNA表達(dá)下調(diào)，脾臟淋巴細(xì)胞中Th1細(xì)胞比例和Th1/Th2比值均增加，Th2細(xì)胞比例減少，可見(jiàn)NCTD能夠調(diào)控AC大鼠的Th1/Th2失衡，這可能是其改善AC體征的重要機(jī)理。

血管形成由多種血管生成因子參與，該過(guò)程相對(duì)復(fù)雜，其中VEGF是關(guān)鍵的促血管生成因子，其能夠促進(jìn)血管和淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂。已證實(shí)NCTD可抑制血管生成，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，下調(diào)血管生成因子如VEGF、VEGFR-2，并上調(diào)TSP和TIMP-2等抗血管生成因子的表達(dá)[8]，因此，NCTD可能是一種潛在抗血管生成藥物。本研究檢測(cè)結(jié)果顯示，NCTD干預(yù)AC大鼠模型后角膜組織內(nèi)VEGF陽(yáng)性表達(dá)率減少，結(jié)膜組織中VEGF、VEGFR2蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)，進(jìn)一步說(shuō)明了NCTD抑制血管新生的作用。

綜上所述，本研究顯示在OVA刺激下可引起大鼠實(shí)驗(yàn)性過(guò)敏性結(jié)膜炎，而去甲斑蝥素能在過(guò)敏性結(jié)膜炎中減輕機(jī)體炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，并抑制VEGF及VEGFR2表達(dá)，從而起到緩解大鼠過(guò)敏性結(jié)膜炎的作用。本研究只對(duì)相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了初步探究，過(guò)敏性結(jié)膜炎病理機(jī)制復(fù)雜，將去甲斑蝥素應(yīng)用于該疾病的治療還需要進(jìn)一步大量且深入的實(shí)驗(yàn)研究。