艾 玲， 徐 卉， 陳 昊

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院麻醉科， 湖北 武漢 430030)

腹腔鏡手術(shù)因其創(chuàng)傷小、操作精細、恢復(fù)快等特點而為外科手術(shù)的革新指明了方向，并得到廣泛的應(yīng)用，但腹腔鏡手術(shù)中所需的二氧化碳氣腹會對患者肝腎功能產(chǎn)生影響，目前研究發(fā)現(xiàn)，氣腹引起的腹內(nèi)壓升高、肝血流改變是造成肝損傷及肝功能改變的主要原因[1]。近來研究發(fā)現(xiàn)，多種原因所致肝損傷均可引起高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein box 1，HMGB1)大量釋放，并介導(dǎo)Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)通路釋放炎癥因子，在多種肝臟疾病中發(fā)揮重要作用[2]。然而在氣腹引起的肝損傷過程中，HMGB1/TLR4通路的調(diào)控作用研究較少。丙泊酚可用于全身麻醉的誘導(dǎo)和維持，近來有文獻報道丙泊酚不僅可改善肝臟缺血再灌注損傷[3]，還可在腹腔鏡直腸癌根治術(shù)中降低患者血清炎癥因子水平，發(fā)揮抗炎作用[4]。但丙泊酚對氣腹所致肝臟損傷的改善作用未見報導(dǎo)?；诒捶訉Ω闻K的保護作用及在腹腔鏡手術(shù)中的抗炎作用，本研究推測丙泊酚可能對氣腹引起的肝損傷有緩解效果，并建立大鼠氣腹模型對此進行驗證，以期闡明丙泊酚發(fā)揮肝損傷保護的可能機制。

1 材料與方法

1.1材 料

1.1.1動物:60只6～7周齡清潔級SD雄性大鼠，體重200～220g，由華中科技大學實驗動物中心提供[生產(chǎn)許可證號為SCXK(鄂)2019-0002]，大鼠在溫度23～26℃，濕度45～55%的環(huán)境中飼養(yǎng)。本實驗經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準同意。

1.1.2主要藥品、試劑及儀器:丙泊酚注射液(批號20210109，規(guī)格200mg，西安力邦制藥有限公司)；聯(lián)苯雙酯片(批號20201229，規(guī)格25mg，北京太洋藥業(yè)股份有限公司)；大鼠天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(批號MM-21301R1、MM-3057R，武漢益普生物科技有限公司)；白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒(批號DM-M57136、DM-M71138，上海篤瑪生物科技有限公司)；蛋白提取試劑盒、BCA試劑盒(批號P0027、CL-80064，上海碧云天公司)；HMGB1、TLR4、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、干擾素-γ(IFN-γ)、β-肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體(批號ab18256、ab217274、ab7202、ab171081、ab53013、ab10357，美國abcam公司)；羊抗兔二抗(批號AT01C9，深圳市安提生物科技有限公司)等；全自動氣腹機(型號F25，武漢國惠醫(yī)療設(shè)備有限公司)；酶標儀(型號MB16-414，上海勝衛(wèi)電子科技有限公司)；光學顯微鏡、全自動化學發(fā)光儀(型號SMZ745、CC600，上海寰熙醫(yī)療器材有限公司)等。

1.2方 法

1.2.1模型建立及分組給藥:3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，參照文獻[5]方法將氣腹針插入腹腔內(nèi)1cm，連接氣腹機，加壓力為20mmHg的二氧化碳，持續(xù)時間2h，建立氣腹模型。待大鼠蘇醒后，取大鼠腹主動脈血，用ELISA檢測大鼠血清肝功能指標AST、ALT水平(高于手術(shù)前2～3倍)，視為造模成功(共50只)，隨機分為氣腹組、丙泊酚低、中、高劑量組、陽性對照組，每組10只。另取10只健康大鼠除不建立氣腹外，其余操作同上，作為假手術(shù)組。各組均于術(shù)后2h開始給藥，丙泊酚參照文獻[6]設(shè)置低、中、高劑量(5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg)，用生理鹽水稀釋成濃度為0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL的溶液，按10mL/kg劑量經(jīng)腹腔注射給藥；陽性對照組參照文獻[7]設(shè)置劑量灌胃給予25mg/kg的聯(lián)苯雙酯溶液(生理鹽水稀釋成2.5mg/mL的溶液，10mL/kg劑量灌胃給藥)；假手術(shù)組與氣腹組經(jīng)腹腔注射等量生理鹽水；給藥10h后取材，進行后續(xù)試驗。

1.2.2肝功能檢測:給藥10h后，麻醉取大鼠腹主動脈血5mL，離心取上清液，檢測血清AST、ALT水平。

1.2.3肝組織病理學觀察:頸脫臼處死大鼠，摘取大鼠肝臟，取部分肝臟置于-80℃保存?zhèn)溆?；剩余部分肝臟于4%多聚甲醛中固定24h，制成厚為5μm的石蠟切片，取部分切片，行蘇木精-伊紅(HE)染色，于光鏡下觀察肝臟病理變化。

1.2.4ELISA法檢測肝組織IL-6、TNF-α水平:取-80℃保存的肝臟組織，解凍、勻漿、離心后取上清液，按ELISA試劑盒說明書檢測炎癥因子指標IL-6、TNF-α水平。

1.2.5蛋白免疫印跡法檢測肝組織HMGB1、TLR4、MCP-1、ICAM-1、IFN-γ蛋白表達:取冰凍肝臟組織勻漿液，提取蛋白，BCA法測蛋白總濃度，取100μg蛋白行電泳及轉(zhuǎn)膜，滴加1∶1000的一抗(HMGB1、TLR4、MCP-1、ICAM-1、IFN-γ)抗體及1∶2000的β-actin內(nèi)參抗體4℃孵育24h，加入1∶2000的羊抗兔二抗室溫孵育1h，增強化學發(fā)光法顯色，Image-J軟件分析條帶相對表達。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠給藥后血清肝功能指標AST、ALT檢測結(jié)果:與假手術(shù)組相比，氣腹組大鼠血清AST、ALT水平升高(P<0.05)；與氣腹組相比，丙泊酚各劑量組及陽性對照組大鼠血清AST、ALT水平降低(P<0.05)，且血清AST、ALT水平隨丙泊酚劑量增加依次降低(P<0.05)；與丙泊酚高劑量組相比，陽性對照組大鼠血清AST、ALT水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清AST ALT水平比較±s，n=10)

2.2各組大鼠肝組織HE染色結(jié)果:假手術(shù)組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整，未見明顯損傷；氣腹組大鼠可見肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細胞炎性浸潤及片狀壞死現(xiàn)象明顯；丙泊酚各劑量組大鼠肝細胞腫脹、變性、壞死等病理損傷程度依次減輕。見圖1。

圖1 HE染色檢測大鼠肝組織病理損傷(×400)

2.3各組大鼠肝組織IL-6、TNF-α水平檢測結(jié)果:與假手術(shù)組相比，氣腹組大鼠肝組織IL-6、TNF-α水平升高(P<0.05)；與氣腹組相比，丙泊酚各劑量組及陽性對照組大鼠肝組織IL-6、TNF-α水平降低(P<0.05)，且肝組織IL-6、TNF-α水平隨丙泊酚劑量增加依次降低(P<0.05)；與丙泊酚高劑量組相比，陽性對照組大鼠肝組織IL-6、TNF-α水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠肝組織IL-6 TNF-α水平比較±s，n=10)

2.4各組大鼠肝組織HMGB1、TLR4、MCP-1、ICAM-1、IFN-γ蛋白表達結(jié)果:與假手術(shù)組相比，氣腹組大鼠肝組織HMGB1、TLR4、MCP-1、ICAM-1、IFN-γ蛋白表達升高(P<0.05)；與氣腹組相比，丙泊酚各劑量組及陽性對照組大鼠肝組織HMGB1、TLR4、MCP-1、ICAM-1、IFN-γ蛋白表達降低(P<0.05)，且肝組織HMGB1、TLR4、MCP-1、ICAM-1、IFN-γ蛋白表達隨丙泊酚劑量增加依次降低(P<0.05)；與丙泊酚高劑量組相比，陽性對照組大鼠肝組織HMGB1、TLR4、MCP-1、ICAM-1、IFN-γ蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2、表3。

圖2 各組大鼠肝組織HMGB1、TLR4、MCP-1、ICAM-1、IFN-γ蛋白印跡圖注A：假手術(shù)組；B：氣腹組；C：丙泊酚低劑量組；D：丙泊酚中劑量組；E：丙泊酚高劑量組；F：陽性對照組

表3 各組大鼠肝組織HMGB1 TLR4 MCP-1 ICAM-1 IFN-γ蛋白相對表達水平比較±s，n=10)

3 討 論

隨著腹腔鏡手術(shù)在外科診斷和治療中的應(yīng)用，其手術(shù)中氣腹所致臟器損傷逐漸成為急需解決的問題[8]。鄒海波等[5]研究發(fā)現(xiàn)氣腹壓力20mmHg持續(xù)1h后，解除氣腹壓力可導(dǎo)致肝臟缺血灌注再損傷及肝功能指標ALT、AST水平高于正常值2倍以上，表明給予大鼠氣腹壓力持續(xù)一定時間可建立肝臟損傷模型。本研究給予大鼠氣腹壓力20mmHg持續(xù)2h建立氣腹模型，給藥10h后，氣腹組大鼠血清ALT、AST水平高于假手術(shù)組大鼠6倍以上，且HE染色可見肝細胞大量壞死和變性，提示氣腹模型大鼠肝組織及功能受損，表明造模成功。

目前，維持最低限度氣腹壓力、使用氯胺酮等麻醉藥物是減少腹腔鏡手術(shù)中氣腹對肝損傷的主要措施，雖能在一定程度上預(yù)防氣腹引起的肝損傷，但特異性及防治效果欠佳[9]。丙泊酚是一種全身麻醉藥，可應(yīng)用于多種手術(shù)的麻醉和鎮(zhèn)靜，另外，有文獻[10]報道丙泊酚可有效緩解肝臟損傷。故本研究推測丙泊酚可能對氣腹引起的肝損傷有一定保護作用，并建立氣腹肝損傷大鼠模型對此進行驗證，發(fā)現(xiàn)給予氣腹肝損傷大鼠丙泊酚低、中、高劑量及陽性藥物治療后，丙泊酚低、中、高劑量組及陽性對照組大鼠肝組織細胞壞死和變性現(xiàn)象明顯緩解，血清ALT、AST水平均顯著低于氣腹組大鼠，提示丙泊酚可改善氣腹肝損傷大鼠肝功能及病理損傷。

HMGB1含量對肝損傷診斷及預(yù)后有重要的診斷及預(yù)測作用[11]。袁蘇榆等[12]研究發(fā)現(xiàn)，對過量乙酰氨基酚所致急性肝功能衰竭患者血清HMGB1水平迅速升高，且早于ALT等肝功能指標變化，表明HMGB1水平更能及時靈敏地診斷出藥物所致肝損傷。HMGB1不僅可由壞死細胞被動釋放，還可由活化的單核、巨噬等免疫細胞釋放，通過與TLR4受體結(jié)合將其激活，活化的TLR4可誘導(dǎo)炎性細胞因子和趨化因子聚集，促進肝臟發(fā)生炎性損傷和纖維化，導(dǎo)致肝功能衰竭[13]；還可刺激IFN-γ表達進一步促進HMGB1的釋放[14]。另外活化單核細胞產(chǎn)生的IL-6、TNF-α也可誘導(dǎo)MCP-1、ICAM-1等多種趨化分子及粘附分子表達釋放，促進血管內(nèi)皮細胞粘附，進而加重組織損傷[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，氣腹組大鼠肝組織中HMGB1、TLR4、IFN-γ、MCP-1、ICAM-1蛋白及IL-6、TNF-α水平均明顯高于假手術(shù)組，提示氣腹肝損傷大鼠肝組織中HMGB1/TLR4通路處于活化狀態(tài)，推測HMGB1/TLR4通路活化誘導(dǎo)炎性細胞因子和趨化因子聚集，可能是氣腹導(dǎo)致肝臟損傷的主要病理機制。而丙泊酚各劑量組及陽性對照組肝組織HMGB1、TLR4、IFN-γ、MCP-1、ICAM-1蛋白及IL-6、TNF-α水平均明顯低于氣腹組，提示丙泊酚及陽性藥物治療后，HMGB1/TLR4通路活化程度較低，炎性因子水平較低，表明丙泊酚降低氣腹大鼠肝臟損傷的作用可能與抑制HMGB1/TLR4通路有關(guān)。

綜上所述，丙泊酚可抑制HMGB1/TLR4通路激活，降低肝組織炎癥因子及趨化因子表達，緩解氣腹大鼠肝臟損傷，可能為丙泊酚在腹腔鏡手術(shù)中應(yīng)用提供一定參考。但腹腔手術(shù)中氣腹引起肝損傷的分子機制較為復(fù)雜，HMGB1/TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的下游靶基因較多，丙泊酚也可能通過其他途徑改善腹腔手術(shù)中氣腹引起的肝損傷，有待后續(xù)進一步驗證。