董 巖， 李佳蔚， 賈依娜爾， 黃詠梅， 張 嶠

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院， 新疆 烏魯木齊 830000)

根據(jù)2020年世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)(International Agency for Research on Cancer，IARC)發(fā)布的全球癌癥數(shù)據(jù)顯示，肺癌是威脅全球人類生命健康的第二大癌癥[1]。非小細(xì)胞肺癌 (NSCLC)是肺癌的一種，約占所有肺癌病例的85%，其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)逐年增加[2]。NSCLC包括多種癌癥類型，最常見的是肺腺癌 (Lung adenocarcinoma，LUAD)、肺鱗癌 (Lung squamous cell carcinoma，LUSC)[3]。目前的輔助化療提高了NSCLC患者的生存率，但是它也存在致殘或致死的風(fēng)險[4]。甲狀腺激素受體作用因子13(Thyroid hormone receptor interactor 13，TRIP13)在調(diào)節(jié)有絲分裂過程中起關(guān)鍵作用，包括紡錘體組裝檢查和DNA修復(fù)，這可能是染色體不穩(wěn)定從而產(chǎn)生癌癥的原因[5]。因此TRIP13可能是人類癌癥的新治療靶點。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，TRIP13在多種癌癥中過度表達(dá)，與癌癥的發(fā)展密切相關(guān)，影響患者的生存率。Agarwal等[6]發(fā)現(xiàn)TRIP13能促進(jìn)結(jié)直腸癌腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，TRIP13可能是結(jié)直腸癌的治療靶點。Zhou等[7]的研究證明，TRIP13通過調(diào)節(jié)Notch信號通路促進(jìn)上皮性卵巢癌發(fā)展，而沉默TRIP13可抑制細(xì)胞增殖，減少細(xì)胞侵襲和遷移，并在體外誘導(dǎo)上皮性卵巢癌細(xì)胞凋亡。此外TRIP13能夠調(diào)節(jié)NSCLC細(xì)胞增殖、侵襲和細(xì)胞周期檢查點，可能是臨床上診斷和治療肺癌的有用標(biāo)志物[8]。但是目前TRIP13與NSCLC之間的相互關(guān)系仍需進(jìn)一步研究，在本實驗中，我們收集了肺腺癌與鱗腺癌的患者的腫瘤組織與癌旁組織，并使用兩種腫瘤細(xì)胞系，評估了TRIP13的表達(dá)，并探索了TRIP13可能的致癌機制，為將來研究NSCLC的致病機制和治療提供參考價值。

1 資料與方法

1.1一般資料：從2018年2月至2020年2月在我院接受切除手術(shù)的NSCLC患者中收集了45例腫瘤及其癌旁組織(距腫瘤邊緣≥5mm)。手術(shù)取材后將樣本立即放在凍存管并置于液氮中，隨后在-80℃冰箱保存。所有患者手術(shù)前未接受放化治療，患者均簽署知情同意書，本研究在我院倫理委員會的監(jiān)督下獲得批準(zhǔn)和實施。人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和肺鱗癌細(xì)胞系SKMES1均購自中國科學(xué)院上海研究所細(xì)胞庫，RPMI1640培養(yǎng)基、多聚甲醛和結(jié)晶紫溶液均購自北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清(FBS)購自浙江天杭生物科技股份有限公司，TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green試劑購自上海翌圣公司，Transwel購自康寧公司，CCK8試劑購自上海信裕公司，TRIP13抗體、GAPDH抗體購自abcam公司，TRIP13、VEGFA和GAPDH 的qPCR引物由上海生工生物公司合成；過表達(dá)TRIP13的慢病毒(PLK-TRIP13)及陰性對照病毒(PLK-NC)由上海漢恒生物科技有限公司構(gòu)建。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)：人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和肺鱗癌細(xì)胞系SKMES1均使用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，將所有細(xì)胞置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，根據(jù)細(xì)胞生長密度更換新鮮培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞生長融合度達(dá)到80%～90%時進(jìn)行消化傳代，選擇對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行下一步實驗。

1.3慢病毒轉(zhuǎn)染實驗：分別設(shè)置為A549組(轉(zhuǎn)染PLK-NC)與A549+PLK-TRIP13組(轉(zhuǎn)染PLK-TRIP13)、SKMES1組(轉(zhuǎn)染PLK-NC)與SKMES1+PLK-TRIP13(轉(zhuǎn)染PLK-TRIP13)。細(xì)胞在含10% FBS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長密度達(dá)到70%～80%時轉(zhuǎn)染病毒。轉(zhuǎn)染前1d，細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化后接種于24孔板(1×105個細(xì)胞/孔)。用陰性對照病毒測定兩個細(xì)胞的轉(zhuǎn)染條件和感染復(fù)數(shù)值，根據(jù)MOI值計算每孔所需病毒量[病毒體積=(MOI×細(xì)胞數(shù))/病毒滴度，病毒滴度=2×108TU/mL]。每孔加入2.5μL聚凝胺(2mg/mL)，然后加入培養(yǎng)基補充體積至500μL/孔。48h后，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。72h 后收集細(xì)胞并檢測TRIP13過表達(dá)的效果。

1.4細(xì)胞侵襲實驗：A549 細(xì)胞和 SKMES1 細(xì)胞分別接種在6孔板中，每孔2×104個細(xì)胞，加入100μL無血清RPMI 1640培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，將6000μL含20%血清的RPMI 1640培養(yǎng)基加入小室，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。移走小室并傾倒培養(yǎng)基，然后在含有多聚甲醛和結(jié)晶紫的溶液中連續(xù)固定和染色。用棉簽擦拭室內(nèi)的未侵襲的細(xì)胞，并在顯微鏡下拍照。對每個視野中的侵襲細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。

1.5CCK8細(xì)胞增殖實驗：取對數(shù)生長期細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化并離心。用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋成單細(xì)胞懸液，接種到96孔板中。細(xì)胞濃度調(diào)至8000個/孔，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱。在24h、48h和72h時，每孔加入20 μL CCK8溶液，2h后用酶標(biāo)儀測定450nm處的吸光度(A)值。

1.6qRT-PCR法：TRIzol試劑提取NSCLC及癌旁組織樣本、A549和 SKMES1 細(xì)胞中的總RNA，酶標(biāo)儀檢測總RNA的純度和含量。按照qRT-PCR試劑盒實驗說明，依次進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR實驗。qRT-PCR反體系：cDNA模板2ng，上下游引物各0.4μL，SYBR Primix Ex TaqTM 5 μL，ddH2O補充至10μL。qRT-PCR反應(yīng)條件：95oC(30s)預(yù)變性后，變性95oC(7s)，退火55℃(30s)，72℃(15s)，40個循環(huán)周期。擴增結(jié)果根據(jù)2-△△Ct法計算mRNA的相對表達(dá)量。qRT-PCR引物序列：CAPDH-F，5-AGTGTGACGTTGACATCCGT-3，CAPDH-R，5-GCAGCTCAGTAACAGTCCGC-3；TRIP13-F，5- TGCATGCACTGTTGCACTTC-3，TRIP13-R，5- GGGTTGCACAAGTATCACGC-3；VEGFA-F，5- GTCCTGGAGCGTGTACGTTG -3,VEGFA-R，5- CTTCCGGGCTCGGTGATTTA-3。

1.7Western blot法：收集各組細(xì)胞，RIPA裂解提取總蛋白，BCA法定量蛋白。變性后用SDS-PAGE凝膠電泳分離等量的蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂牛奶4℃密封1h，TBST洗膜5min，3次。加入TRIP13-b抗體(1∶2000)，4℃搖床過夜。TBST膜洗滌5min，3次。加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶1000)，37℃孵育1h。TBST膜洗滌5min，5次。蛋白質(zhì)條帶灰度值通過image-Pro Plus Image分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。 實驗重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié) 果

2.1NSCLC 中TRIP13表達(dá)量改變與臨床病理特征間的關(guān)系：通過qRT-PCR分析NSCLC腫瘤和配對的癌旁組織中TRIP13表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，NSCLC患者腫瘤組織中TRIP13的表達(dá)水平顯著升高(1.00±0.34 vs 7.69±2.14,P=0.007)，見圖1。

圖1 NSCLC腫瘤及癌旁組織中TRIP13表達(dá)差異注：與癌旁組織比較，**P<0.01

根據(jù)TRIP13相對表達(dá)水平(腫瘤組織/癌旁組織)的中位數(shù)5.62，將45例患者分為TRIP13低表達(dá)組(腫瘤組織/癌旁組織<5.62，n=22)和高表達(dá)組(癌旁組織/癌組織≥5.62，n=23),并分析患者TRIP13表達(dá)量與臨床病理特征間的關(guān)系。結(jié)果顯示，大部分肺腺癌患者相對高表達(dá)TRIP13(P<0.05)，而大部分肺鱗癌患者低表達(dá)TRIP13(P<0.05)。此外TRIP13的表達(dá)水平與NSCLC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤進(jìn)展程度相關(guān)(P<0.05)，與性別、年齡因素?zé)o關(guān)(P>0.05)。提示TRIP13可能在肺腺癌中發(fā)揮關(guān)鍵作用，影響腫瘤的惡化和轉(zhuǎn)移，見表1。通過Kaplanmeier-plotter數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步分析TRIP13與肺腺癌和肺鱗癌患者相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)TRIP13的表達(dá)水平能夠影響肺腺癌的預(yù)后，而對肺鱗癌的預(yù)后沒有影響，見圖2。

圖2 Kaplanmeier-plotter數(shù)據(jù)庫分析TRIP13表達(dá)水平與肺癌患者預(yù)后的關(guān)系

表1 TRIP13表達(dá)差異與臨床病理特征相關(guān)性比較

2.2過表達(dá)TRIP13的NSCLC細(xì)胞系構(gòu)建：通過慢病毒將PLK-NC和PLK-TRIP13分別轉(zhuǎn)染至非小細(xì)胞肺腺癌A549和非小細(xì)胞肺鱗癌SKMES1細(xì)胞。采用qRT-PCR和western blot檢測各組細(xì)胞TRIP13 mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，A549組細(xì)胞的TRIP13 mRNA和蛋白表達(dá)水平均高于SKMES1組(1.00±0.24 vs 0.26±0.03,P=0.001；1.00±0.22 vs 0.21±0.05,P=0.006)。與A549組相比，A549+PLK-TRIP13組細(xì)胞TRIP13 mRNA和蛋白表達(dá)水平提高(1.00±0.24 vs 5.65±0.63,P=0.001；1.00±0.22 vs 1.72±0.21,P=0.004)。與SKMES1組相比，SKMES1+PLK-TRIP13組細(xì)胞TRIP13 mRNA和蛋白表達(dá)水平提高(0.26±0.03 vs 0.826±0.07,P=0.003；0.21±0.05 vs 0.86±0.03,P=0.001)，見圖3。說明過表達(dá)TRIP13的NSCLC穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系構(gòu)建成功。

圖3 過表達(dá)TRIP13的NSCLC細(xì)胞系鑒定注：與A549組比較，**P<0.01，***P<0.001；與SKMES1組比較，**P<0.01

2.3過表達(dá)TRIP13對A549細(xì)胞增殖和侵襲的影響：CCK8結(jié)果顯示，與A549組相比，A549+PLK-TRIP13組細(xì)胞增殖能力提高，在72h時表現(xiàn)出顯著性差異(1.12±0.27 vs 1.73±0.20,P=0.004)，見圖4A。Transwell結(jié)果顯示，與A549組相比，A549+PLK-TRIP13組細(xì)胞侵襲數(shù)量增加(214.25±11.64 vs 384.69±23.54,P=0.001)，見圖4B。

圖4 過表達(dá)TRIP13對A549細(xì)胞增殖和侵襲的影響注：與A549組比較，**P<0.01，***P<0.001

2.4過表達(dá)TRIP13對A549細(xì)胞血管生成的影響：采用western blot檢測A549細(xì)胞血管生成相關(guān)蛋白VEGF的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與A549組相比，A549+ PLK-TRIP13組細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)水平提高(0.51±0.16 vs 0.97±0.15,P=0.006)，見圖5。

圖5 過表達(dá)TRIP13對A549細(xì)胞血管生成的影響注：與A549組比較，**P<0.01

2.5過表達(dá)TRIP13對SKMES1細(xì)胞增殖、侵襲和血管生成的影響：我們探究TRIP13在非小細(xì)胞肺鱗癌SKMES1細(xì)胞中的作用。CCK8實驗結(jié)果顯示，與SKMES1組相比，SKMES1+PLK-TRIP13組細(xì)胞增殖能力沒有顯著差異(1.52±0.13 vs 1.59±0.14,P=0.482)，見圖6A。Western blot實驗結(jié)果顯示，與SKMES1組相比，SKMES1+PLK-TRIP13組細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)水平略微升高，但無顯著性差異(0.78±0.09 vs 0.82±0.15,P=0.672)，見圖6B。Transwell實驗結(jié)果顯示，與SKMES1組相比，SKMES1+PLK-TRIP13組細(xì)胞侵襲數(shù)量增加，有顯著性差異(159.85±14.57 vs 174.39±9.50,P=0.032)，見圖6C。結(jié)果表明過表達(dá)TRIP13對非小細(xì)胞肺鱗癌的影響較少，僅能輕微促進(jìn)細(xì)胞侵襲和血管生成。

圖6 過表達(dá)TRIP13對SKMES1細(xì)胞增殖、侵襲和血管生成的影響注：與SKMES1組比較，*P<0.05

3 討 論

肺癌是全球致死率最高的惡性腫瘤，每年有眾多患者死于肺癌。到目前為止，針對特定腫瘤中某些分子改變的靶向治療方法已成功用于肺腺癌，需要更多的研究闡述癌細(xì)胞內(nèi)的分子相互作用，從而實現(xiàn)創(chuàng)新藥物設(shè)計，指導(dǎo)精確的癌癥治療。

TRIP13是ATPases家族的一個保守的成員，是特定染色體事件的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在減數(shù)分裂程序中，它參與控制G2的前期過程，如DNA斷裂重組、檢查點信號傳導(dǎo)等[5]。很多研究表明TRIP13與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，該基因定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，并在體外和體內(nèi)均能表現(xiàn)出致癌作用。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，非小細(xì)胞肺腺癌患者腫瘤組織中TRIP13的表達(dá)水平顯著升高，TRIP13的表達(dá)水平能夠影響肺腺癌的預(yù)后，然而在肺鱗癌患者中，TRIP13的表達(dá)水平?jīng)]有變化，TRIP13對于肺鱗癌患者的預(yù)后沒有影響，表明的TRIP13可能僅與肺腺癌發(fā)展相關(guān)，而與肺鱗癌的發(fā)病無相關(guān)性。

研究證明，TRIP13可以通過控制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移來促進(jìn)癌癥發(fā)展。例如，TRIP13干擾通過調(diào)節(jié)TTC5/p53通路和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因表達(dá)抑制甲狀腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[9]，在結(jié)直腸癌向肝臟轉(zhuǎn)移的過程中，肝臟與結(jié)直腸中均顯示TRIP13過表達(dá)，TRIP13敲低會阻礙結(jié)直腸癌細(xì)胞的集落形成、侵襲、運動和球體形成能力[10]。另外也有研究證實，TRIP13表達(dá)與肺癌患者的腫瘤大小和患者的高死亡率呈正相關(guān)，TRIP13促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞增殖、克隆形成和遷移，同時在體外抑制肺腺癌細(xì)胞的凋亡[11]。在本實驗研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)TRIP13的A549肺腺癌細(xì)胞侵襲數(shù)量顯著增加。VEGF是一種參與機體所有血管生成的細(xì)胞因子，對內(nèi)皮細(xì)胞具有促有絲分裂和抗凋亡作用，高表達(dá)則可以促進(jìn)血管的通透性和細(xì)胞遷移能力[12]，過表達(dá)TRIP13的A549肺腺癌細(xì)胞的VEGF蛋白表達(dá)顯著提高，說明過表達(dá)TRIP13可能通過促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞增殖和侵襲和血管生成參與疾病的發(fā)展，但是過表達(dá)TRIP13對SKMES1肺鱗癌細(xì)胞的影響較少，僅能輕微促進(jìn)細(xì)胞侵襲和血管生成。以上說明TRIP13對非小細(xì)胞肺腺癌影響較大，對鱗癌影響較少。

另外，本實驗也存在一些不足之處，本實驗中僅采取了兩種NSCLC細(xì)胞來驗證TRIP13與肺腺癌與肺鱗癌可能存在的相互關(guān)系，因此無法認(rèn)為所有的肺腺癌患者均與TRIP13基因相關(guān)而肺鱗癌患者與TRIP13基因無關(guān)，后續(xù)需要使用多種NSCLC細(xì)胞系進(jìn)行進(jìn)一步驗證。

綜上所述，TRIP13在非小細(xì)胞肺腺癌組織和細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)，TRIP13增加了非小細(xì)胞肺腺癌細(xì)胞的增殖侵襲和促血管生成作用。以上結(jié)果初步明確了，TRIP13在非小細(xì)胞肺腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，可為進(jìn)一步探討非小細(xì)胞肺腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移機制提供新的思路。