劉漢濤， 趙良虎， 秦宏敏

(攀枝花學(xué)院附屬醫(yī)院骨科， 四川 攀枝花 617099)

骨肉瘤是一類常發(fā)病于青少年或兒童膝關(guān)節(jié)周圍的原發(fā)性惡性腫瘤[1]，具有高侵襲性和高轉(zhuǎn)移性。據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界范圍內(nèi)骨肉瘤的發(fā)病率正在逐漸增加。目前骨肉瘤的主要治療方法有化療和手術(shù)切除，但是治療效果并不十分理想，仍然存在嚴(yán)重的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移以及腫瘤復(fù)發(fā)，所以需要探究更多的骨肉瘤的發(fā)展機(jī)制[2]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSC)是一類多能干細(xì)胞，存在于骨髓基質(zhì)中，可分化為成骨細(xì)胞以及脂肪細(xì)胞，可轉(zhuǎn)移至腫瘤組織而調(diào)控腫瘤進(jìn)程[3]。間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體是一類由間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的納米級(jí)囊泡，可攜帶間充質(zhì)干細(xì)胞的遺傳信息，如miRNA、lncRNA、脂質(zhì)等[4]，研究表明BMSC exo可促進(jìn)多種腫瘤的進(jìn)程，例如，缺氧條件下BMSC exo miRNA通過STAT3誘導(dǎo)的EMT而促進(jìn)肺癌的轉(zhuǎn)移[5]。MiRNA-25-3p已經(jīng)被報(bào)道可調(diào)控多種腫瘤的病理進(jìn)程，例如，外泌體MiR-25-3p可誘導(dǎo)腫瘤血管形成以及腫瘤轉(zhuǎn)移前腫瘤微環(huán)境的形成，亦可促進(jìn)乳腺癌的生長和轉(zhuǎn)移[6]。然而BMSC exo中miR-25-3p是否對(duì)骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響及機(jī)制尚無報(bào)道，本研究旨在闡明BMSC exo中miR-25-3p對(duì)骨肉瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用，并深入探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSC)(購自廣州賽業(yè)生物科技有限公司)，骨肉瘤細(xì)胞MG-63(購自中科院上海細(xì)胞庫)，Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑(購自美國Thermo Fisher Scientific公司)，miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和qRT-PCR試劑盒(購自美國Thermo Fisher Scientific公司)，Trizol試劑盒(購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司)，CD29-APC、CD90-FITC、CD45-PE、PTEN、GAPDH、CD9、CD63、TSG101抗體(購自美國Cell Signaling Technology公司)，CCK8試劑盒(購自英國Abcam公司)，RIPA試劑盒(購自沈陽萬類生物技術(shù)有限公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng):BMSC培養(yǎng)于含10%FBS、10ng/mL bFGF、20μg/mL Vitamin C的DMEM/F12培養(yǎng)基中，MG-63培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，細(xì)胞培養(yǎng)于5% CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，隔天更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)至細(xì)胞匯合率80%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.3細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染:BMSC分為miR-NC組和miR-25-3p組(轉(zhuǎn)染miR-25-3p mimic Negative Control和miR-25-3p mimic)。提取miR-NC組和miR-25-3p組BMSC分泌的外泌體記為miR-NC exo和miR-25-3p exo。MG-63分為miR-NC組和miR-25-3p組(轉(zhuǎn)染miR-25-3p mimic Negative Control和miR-25-3p mimic)，PBS組和BMSC exo組(MG-63與PBS以及10μg/mL的BMSC exo共孵育48h)，miR-NC exo組、miR-25-3p exo組(分別與10μg/mL的miR-NC exo和miR-25-3p exo共孵育48h)以及miR-25-3p exo+PTEN組(與10μg/mL miR-25-3p exo共孵育48h后轉(zhuǎn)染PTEN質(zhì)粒)。按照上述分組使用Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，qRT-PCR鑒定轉(zhuǎn)染效果。

1.4外泌體的提取與鑒定:將各組BMSC培養(yǎng)基更換為含10%無外泌體FBS的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h后取上清，使用差速離心法提取外泌體，300g離心10min，取上清，2000g離心10min，取上清，10000g離心70min，取上清，100000g離心70min，收集沉淀，PBS重懸后繼續(xù)100000g離心70min以清洗外泌體，收集沉淀后用100μL無菌PBS重懸。透射電鏡觀察外泌體的結(jié)構(gòu)，Western blot鑒定外泌體標(biāo)志蛋白CD9、CD63、TSG101。

1.5qRT-PCR:Trizol試劑盒提取各組細(xì)胞的總RNA，使用核酸定量儀進(jìn)行核酸定量，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒取1μg的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)qRT-PCR試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，95℃ 5s，60℃ 30s，共40個(gè)循環(huán)，數(shù)據(jù)處理采用 2-ΔΔCt法，計(jì)算miR-520a-3p 表達(dá)的水平。引物序列如下：

miR-25-3p-F:5’-CATTGCACTTGTCTCGGTCTGA-3’

miR-25-3p-R:5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3’

U6-F:5’ -CTCGCTTCGGCAGCACA-3’

U6-R:5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’

1.6CCK8法檢測細(xì)胞增殖:將轉(zhuǎn)染后以及與外泌體共孵育后的MG-63細(xì)胞接種至96孔板中，每孔5000個(gè)細(xì)胞，每孔100μL，分別于培養(yǎng)0、24、48、72h，取出對(duì)應(yīng)的96孔板，每孔加入10μL的CCK8溶液，混合均勻后使用酶標(biāo)儀在450nm處檢測各組細(xì)胞吸光度(OD)值。

1.7Transwell小室法檢測細(xì)胞遷移和侵襲:取轉(zhuǎn)染或與外泌體孵育后的MG-63細(xì)胞用DMEM空白培養(yǎng)基稀釋后接種于Transwell小室中(或鋪Matrigel膠的Transwell小室)，每孔接種1×104個(gè)細(xì)胞，小室放置于24孔板中，24孔板每孔加入含10%FBS的DMEM 600μL，然后繼續(xù)培養(yǎng)72h后，小室用PBS清洗后用無水甲醛固定30min，底部滴加結(jié)晶紫溶液染色10min，清洗后于顯微鏡下觀察拍照。

1.8雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn):TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測PTEN與miR-25-3p結(jié)合位點(diǎn)，將PTEN野生型(pGL3-PTEN WT組)、突變型質(zhì)粒(pGL3-PTEN MUT組)以及空白質(zhì)粒(pGL3-control組)，使用Lipofectamine 2000將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T，用Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑將miR-25-3p mimic和miR-NC轉(zhuǎn)染至上述293T細(xì)胞，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒檢測熒光強(qiáng)度。

1.9Western blot:取各組6孔板中培養(yǎng)的MG-63，加入200μL RIPA，裂解30min，12000×rpm，離心15min，取上清液為細(xì)胞總蛋白，取10μg蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，然后轉(zhuǎn)膜，封閉2h，PVDF膜與PTEN、CD9、CD63、TSG101、GAPDH抗體4℃過夜孵育，TBST洗膜后，二抗室溫孵育1.5h，洗膜后用ECL試劑盒顯影，拍照，用Image J軟件對(duì)曝光結(jié)果進(jìn)行定量分析。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間差異使用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)法。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2 結(jié) 果

2.1外泌體鑒定結(jié)果:本文所提取的BMSC exo粒徑在100nm左右，具有雙層膜結(jié)構(gòu)，形態(tài)呈“杯托”樣，并且表達(dá)外泌體標(biāo)志蛋白CD9、CD63、TSG101，符合外泌體的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)特征(圖1)。

圖1 透射電鏡(A)和Western blot(B)鑒定外泌體結(jié)果

2.2miR-25-3p促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲:相比于miR-NC組，miR-25-3p mimic組MG-63細(xì)胞OD值在24h、48h、72h均顯著增加(P<0.05)，細(xì)胞遷移和細(xì)胞侵襲數(shù)目亦顯著增加(P<0.001)，說明miR-25-3p顯著促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力(圖2)。

圖2 miR-25-3p對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力的影響A：CCK8法檢測細(xì)胞增殖能力；B：Transwell小室法檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力(×20倍)相比于miR-NC組，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.3間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲:相比于PBS組，BMSC exo組MG-63細(xì)胞OD值均顯著增加(P<0.05)，MG-63細(xì)胞遷移數(shù)和細(xì)胞侵襲數(shù)亦顯著增加(P<0.001)，說明BMSC exo可顯著促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力(圖3)。

圖3 間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響A：CCK8法檢測細(xì)胞增殖能力；B：Transwell小室法檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力(×20倍)相比于PBS組，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.4間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體轉(zhuǎn)移miR-25-3p至骨肉瘤細(xì)胞:相比于PBS組，BMSC exo組MG-63細(xì)胞miR-25-3p表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.001)(圖4A)，miR-25-3p exo中miR-25-3p表達(dá)顯著高于miR-NC exo(P<0.001)(圖4B)，而miR-25-3p exo組MG-63細(xì)胞中miR-25-3p表達(dá)顯著高于miR-NC exo組(P<0.001)(圖4C)，說明間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體可轉(zhuǎn)移miR-25-3p至骨肉瘤細(xì)胞。

圖4 間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體轉(zhuǎn)移miR-25-3p至骨肉瘤細(xì)胞A,C：qRT-PCR檢測細(xì)胞中miR-25-3p表達(dá)；B：qRT-PCR檢測外泌體中miR-25-3p表達(dá) 相比于PBS組/miR-NC exo/ miR-NC exo組，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.5PTEN為miR-25-3p靶基因:TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測PTEN和miR-25-3p結(jié)合位點(diǎn)如圖5A所示，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果顯示，PTEN-WT組細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-25-3p mimic后，相對(duì)熒光強(qiáng)度顯著低于miR-NC組(P<0.001)，而PTEN-MUT組細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-25-3p mimic和miR-NC后細(xì)胞相對(duì)熒光強(qiáng)度無顯著差異，證明PTEN為miR-25-3p靶基因(圖5B)。miR-25-3p mimic組MG-63細(xì)胞PTEN表達(dá)水平顯著低于miR-NC組(P<0.001)(圖5C)，miR-25-3p exo組MG-63細(xì)胞PTEN表達(dá)水平顯著低于miR-NC exo組(P<0.001)(圖5D)，說明外泌體miR-25-3p可顯著抑制PTEN表達(dá)。

圖5 miR-25-3p對(duì)PTEN表達(dá)的調(diào)控A：數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-25-3p與PTEN結(jié)合位點(diǎn)；B：雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測miR-25-3p與PTEN結(jié)合位點(diǎn)；C,D：Western blot檢測各組細(xì)胞PTEN蛋白表達(dá)相比于miR-NC組或miR-NC exo組，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.6外泌體miR-25-3p靶向PTEN促進(jìn)骨肉瘤的增殖、遷移和侵襲:相比于miR-NC exo組，miR-25-3p exo組MG-63細(xì)胞24h、48h、72h MG-63細(xì)胞OD值顯著增加(P<0.05)，細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)顯著增加(P<0.001)，說明BMSC exo能夠顯著促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。而miR-25-3p exo+PTEN組MG-63細(xì)胞OD值、細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)顯著低于miR-25-3p exo組(P<0.05)，說明外泌體miR-25-3p通過抑制PTEN表達(dá)而影響骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力(圖6)。

圖6 外泌體miR-25-3p對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響A：CCK8法檢測細(xì)胞增殖能力；B：Transwell小室法檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力(×20倍)相比于PBS組，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

3 討 論

腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移受多種機(jī)制的調(diào)控，包括血管新生、免疫逃逸、侵襲和轉(zhuǎn)移能力等[7]。研究表明[8]，腫瘤的生物學(xué)功能不僅與腫瘤細(xì)胞自身有關(guān)，還與腫瘤微環(huán)境中的非腫瘤細(xì)胞相關(guān)，間充質(zhì)干細(xì)胞是重要的非腫瘤細(xì)胞之一，間充質(zhì)干細(xì)胞及其分化的基質(zhì)細(xì)胞在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的功能。研究表明[9]，實(shí)體瘤組織中可分離出BMSC，腫瘤組織中的BMSC與正常組織中的間充質(zhì)干細(xì)胞具有相同的形態(tài)、表型以及分化能力，但是其生物學(xué)功能亦有顯著差異。腫瘤中BMSC可分化為腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞，而誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子-β、白介素-10等細(xì)胞因子的分泌而促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。研究表明[10]，BMSC可通過激活Jagged1/Notch1信號(hào)通路而促進(jìn)前列腺的細(xì)胞干性。但是BMSC對(duì)骨肉瘤的生長和轉(zhuǎn)移的影響及機(jī)制尚無研究。

外泌體是一類由多種活細(xì)胞分泌的納米級(jí)囊泡，研究表明，人BMSC外泌體可促進(jìn)前列腺癌的發(fā)生發(fā)展[11]，亦可通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路而促進(jìn)頭頸癌的病理進(jìn)程[12]。本文提取并鑒定了BMSC外泌體，并且發(fā)現(xiàn)BMSC exo可促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，說明BMSC exo可促進(jìn)骨肉瘤的生長和轉(zhuǎn)移能力。

外泌體內(nèi)含多種遺傳物質(zhì)包括miRNA、lncRNA、circRNA等，間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體可攜帶間充質(zhì)干細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，如miRNA等。間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體miRNA有望成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。MiR-25-3p被報(bào)道可調(diào)控多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，例如，外泌體miR-25-3p和miR-92a-3p可促進(jìn)脂肪肉瘤的進(jìn)程[13]，循環(huán)miR-25-3p作為新的骨肉瘤診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-25-3p后骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力均顯著增加，說明miR-25-3p可促進(jìn)骨肉瘤的生長和轉(zhuǎn)移。

miRNA對(duì)靶基因的調(diào)控表現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄后水平上，通過對(duì)靶基因mRNA的切割或?qū)ζ浞g抑制兩種機(jī)制來下調(diào)靶基因的表達(dá)，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，miRNA可結(jié)合于靶基因mRNA的3’UTR區(qū)域，而抑制靶基因的翻譯[15]。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，PTEN為miR-25-3p的靶基因，MiR-25-3p以及BMSC exo中的miR-25-3p可抑制骨肉瘤細(xì)胞中PTEN的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，外泌體可轉(zhuǎn)移miR-25-3p至骨肉瘤細(xì)胞，并且發(fā)現(xiàn)BMSC exo miR-25-3p可促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。而過表達(dá)PTEN后外泌體miR-25-3p對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的促進(jìn)作用被顯著抑制，說明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體miR-25-3p可靶向PTEN而促進(jìn)骨肉瘤的生長和轉(zhuǎn)移，提示外泌體miR-25-3p或可作為骨肉瘤治療的新靶點(diǎn)。

綜上所述，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體可轉(zhuǎn)移miR-25-3p至骨肉瘤細(xì)胞，并抑制其靶基因PTEN的表達(dá)而促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，但是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體miR-25-3p是否能作為骨肉瘤治療的新靶點(diǎn)還需進(jìn)一步探究。