張文慧

(安康市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，陜西 安康 725000)

番茄是一種亦蔬亦果的植物，它的果實(shí)不僅美味可口，而且營(yíng)養(yǎng)豐富，還具有一定的藥用價(jià)值[1]。番茄的經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高，陜南山區(qū)農(nóng)民種植普遍，既滿足了自家生活的需求，還可帶來(lái)一部分經(jīng)濟(jì)收入。陜南氣候濕潤(rùn)，降雨較多，很容易滋生番茄病蟲害，目前市面上的番茄品種大多不太適宜在本地區(qū)種植。陜南山區(qū)番茄地方品種，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的栽培，既適應(yīng)了本區(qū)域特定的環(huán)境，又保持了相對(duì)穩(wěn)定的遺傳結(jié)構(gòu)，可以作為番茄新品種選育重要的種質(zhì)資源[2]。近年來(lái)，分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展使得番茄等作物育種年限大大縮短，包括SSR、CAPS、STS、KASP在內(nèi)的分子標(biāo)記在番茄抗病基因的篩選中應(yīng)用廣泛[3～7]。通過(guò)尋找與抗病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，可以鑒定番茄中是否存在抗病基因，進(jìn)而聚合多個(gè)抗病基因，培育適宜本地種植的多抗優(yōu)質(zhì)番茄新品種，這對(duì)促進(jìn)陜南山區(qū)番茄種業(yè)的發(fā)展，帶動(dòng)農(nóng)民增產(chǎn)增收具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料

課題組于2017-2019年從陜南三市收集了54份番茄地方品種，該批材料都是連續(xù)自交6代以上的高世代材料。

1.2 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)設(shè)在安康市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院育種基地，該基地土質(zhì)為壤土，有機(jī)質(zhì)含量中等，已經(jīng)連續(xù)種植番茄4年。

1.3 試驗(yàn)方法

對(duì)54份材料分別進(jìn)行取樣，用CTAB小量法提取DNA，檢測(cè)各材料的抗病基因。參照孫亞林[8]、葛乃鵬[9]等人設(shè)計(jì)的Ty-1、I-2、Tm-2a、Cf-9、Mi-1抗病基因標(biāo)記檢測(cè)各材料是否含有番茄黃化曲葉病毒病、枯萎病、煙草花葉病毒病、葉霉病、根結(jié)線蟲等抗性基因。

PCR檢測(cè)反應(yīng)體系為 ddH2O 15.2 μL，1×10 Buffer(Mg2+)2.0 μL，模板DNA 1.0 μL，0.25 mMdNTPs 0.4 μL，0.5 μM Forward Primer NL3 0.2 μL/0.2μL，0.5 μM Reverse Primer NL2 0.4 μL/0.4μL，0.05 U/μLTaq DNA 聚合酶 0.2 μL，總體積20 μL。

凝膠電泳顯示：PCR產(chǎn)物用加有EB(溴化乙錠)的1%瓊脂糖在100-120 V電壓條件下電泳，時(shí)間約30～40 min，凝膠成像系統(tǒng)顯示結(jié)果。

基因標(biāo)記的反應(yīng)程序見(jiàn)表1。

表1 Ty-1 基因的SNP標(biāo)記PCR擴(kuò)增程序

番茄黃化曲葉病毒病抗病基因(Ty-1)雙重SNP標(biāo)記的PCR檢測(cè)，通過(guò)擴(kuò)增，純合抗病材料會(huì)出現(xiàn)984bp條帶，感病材料出現(xiàn)1424bp的條帶，而雜合材料將會(huì)同時(shí)出現(xiàn)這兩條條帶；番茄葉霉病抗病基因(Cf-9)通過(guò)PCR檢測(cè)，只有抗病材料能擴(kuò)增出約415bp的條帶；番茄根結(jié)線蟲抗性基因(Mi-1)CAPS標(biāo)記通過(guò)PCR檢測(cè)，需要經(jīng)過(guò)酶切，抗病材料會(huì)擴(kuò)增出180bp和570bp兩條條帶，感病材料只有一條750bp的條帶，雜合抗病材料則會(huì)擴(kuò)增出上述三條條帶；番茄煙草花葉病毒病抗病基因(Tm-2a)只有抗病材料會(huì)擴(kuò)增出一條469bp的條帶；番茄枯萎病抗病基因(I-2)標(biāo)記通過(guò)PCR檢測(cè)，抗病材料會(huì)擴(kuò)增出600bp的條帶，感病材料會(huì)擴(kuò)增出720bp的條帶，雜合抗病材料能同時(shí)出現(xiàn)上述兩條條帶。

2 結(jié)果與分析

對(duì)54份番茄地方品種進(jìn)行抗病基因分子標(biāo)記檢測(cè)，詳細(xì)檢測(cè)記錄見(jiàn)附表。經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)分析，該批材料中，47份含有1個(gè)及以上抗病基因，含Ty-1純合抗病基因的材料有19份，占總量的35.19%；含I-2純合抗病基因的材料17份，占總量的48.57%；含Mi-1純合抗病基因的材料有14份，占總量的25.93%；含Tm-2a抗病基因的材料11份，占總量的20.37%；含Cf-9抗病基因的材料21份，占總量的38.89%；未發(fā)現(xiàn)雜合抗病材料。

表2、附表2中所列是抗病基因檢測(cè)結(jié)果，HZ15、HZ01、AK22等3份材料同時(shí)檢測(cè)出5個(gè)抗病基因分子標(biāo)記，另有18份材料檢測(cè)出2個(gè)以上抗病基因分子標(biāo)記，7份材料未檢測(cè)出抗病基因分子標(biāo)記。

表2 抗病基因的PCR檢測(cè)

附表2 抗病基因的PCR檢測(cè)

3 結(jié)論

陜南山區(qū)由于特殊的氣候條件，對(duì)番茄抗性要求更高，市面上常見(jiàn)的番茄品種往往不能很好的適應(yīng)本地的環(huán)境。本地區(qū)的番茄地方品種遺傳多樣性非常豐富，在抗病性、抗逆性上具有較好的表現(xiàn)，而且經(jīng)過(guò)多年的種植選擇，完全能夠適應(yīng)本地種植，可以作為重要的遺傳資源加以利用。

分子標(biāo)記輔助選擇早在三十多年前就被應(yīng)用到作物育種中[10]。通過(guò)抗病基因鑒定試驗(yàn)，在54份番茄地方品種中篩選出47份含有1個(gè)及以上抗病基因的材料，占總量的87%，這說(shuō)明陜南山區(qū)番茄地方品種具有抗性基因的重要基因源，可以作為抗性親本材料進(jìn)行雜交育種。本研究篩選出3份材料具有5個(gè)抗病基因，這是非常難得的優(yōu)秀多抗番茄種質(zhì)資源。

本地區(qū)的番茄抗性材料與其他番茄品種的遺傳交換較少，還可能存在其他未知的抗性基因，可為番茄抗病優(yōu)質(zhì)新品種的選育提供新的抗源。