王茜　成細華　劉春燕　徐文峰　張熙　張海英　王暉　唐群

〔摘要〕 目的 觀察六味地黃湯含藥血清對CoCl2缺氧后HK-2細胞中的上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition， EMT）標志物E-鈣黏蛋白（E-cadherin）和α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin， α-SMA）的影響。方法 體外培養(yǎng)HK-2細胞，分為3組：正常組（10%空白血清）、模型組（10%空白血清+200 μmol·L CoCl）、含藥血清組（10%含藥血清+200 μmol·L CoCl）。CCK-8法檢測不同濃度空白血清、含藥血清（2.5%、5%、10%、20%、40%）在24、36 h對HK-2細胞存活率的影響;以及不同濃度CoCl2 （150、200、300、600 μmol·L）在24 h的最佳干預濃度。qRT-PCR法和Western blot法分別檢測各組E-cadherin、α-SMA 的mRNA和蛋白表達水平;免疫熒光觀察各組E-cadherin、α-SMA蛋白表達情況。結果 CCK-8法確定含藥血清和空白血清的最佳干預濃度和干預時間分別為10%和24 h;CoCl2的最佳干預濃度為200 μmol·L。與正常組比較，模型組E-cadherin的mRNA和蛋白表達水平均明顯降低（P<0.01）、α-SMA明顯升高（P<0.05）;與模型組比較，含藥血清組E-cadherin的mRNA和蛋白表達水平均明顯升高（P<0.01）、α-SMA明顯降低（P<0.01）。結論 缺氧能誘導HK-2細胞發(fā)生EMT，六味地黃湯含藥血清能夠降低α-SMA的表達，升高E-cadherin的表達，從而緩解腎小管EMT。

〔關鍵詞〕 六味地黃湯;缺氧;上皮-間充質轉化;腎纖維化

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.04.007

Influence of Liuwei Dihuang Decoction durg-containing serum on expression of

E-cadherin and α-SMA in HK-2 cells induced by CoCl

WANG Xi CHENG Xihua LIU Chunyan XU Wenfeng ZHANG Xi ZHANG Haiying WANG Hui TANG Qun

（1. Medical College of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. The First Affiliated

Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China; 3. Hunan Brain Hospital，

Changsha， Hunan 410021， China）

〔Abstract〕 Objective To observe the biomarkers E-cadherin and α-smooth muscle actin （α-SMA） of epithelial-mesenchymal transition （EMT） in HK-2 cells after CoCl2 hypoxia with Liuwei Dihuang Decoction drug-containing serum. Methods HK-2 cells were cultured in vitro and divided into 3 groups： normal group （10% blank serum）， model group （10% blank serum+200 μmol·L^-1 CoCl）， and drug-containing serum group （10% drug-containing serum+200 μmol·L CoCl）. The CCK-8 method was used to detect the effects of different concentrations of blank serum and drug-containing serum （2.5%， 5%， 10%， 20%， 40%） on the survival rate of HK-2 cells at 24 and 36 h; and the best intervention concentration of different concentrations of CoCl （150， 200， 300， 600 μmol·L） in 24 h. qRT-PCR and Western blot method were used to detect the expression of E-cadherin and α-SMA protein and mRNA in each group. The expression of E-cadherin and α-SMA protein in each group was observed by immunofluorescence. Results CCK-8 method determined that the best intervention concentration and time of drug-containing serum and blank serum was 10% and 24 h， and the best intervention concentration of CoCl was 200 μmol·L. Compared with normal group， the mRNA and protein expression level of E-cadherin in model group were significantly decreased （P<0.01）， and α-SMA expression was increased （P<0.05）. Compared with model group， the mRNA and protein expression level of E-cadherin were significantly increased （P<0.01）， and α-SMA expression was significantly decreased （P<0.01） in drug-containing serum group. Conclusion Hypoxia can induce EMT in HK-2 cells. Liuwei Dihuang Decoction drug-containing serum can reduce the expression of α-SMA and increase the expression of E-cadherin， thus alleviating EMT in renal tubule.

〔Keywords〕 Liuwei Dihuang Decoction; hypoxia; epithelial-mesenchymal transition; renal fibrosis

慢性腎臟病（chronic kidney disease， CKD）以長期腎小球濾過率降低、尿白蛋白排泄率增加為特征。一項發(fā)布在The Lancet上的慢性腎臟疾病負擔的研究顯示：自1990年以來，全球CKD全年齡患病率增加了29.3%（95%不確定區(qū)間26.4～32.6），2017年，全球患病率為9.1%（8.5～9.8）[1]，有效防治CKD已成為腎臟疾病研究領域的焦點之一。腎臟纖維化（renal fibrosis， RF）是CKD的基本病理過程[2]，纖維化過程會逐漸損害腎功能直至腎功能完全喪失，最終可導致終末期腎?。╡nd stage renal adisease， ESRD）和腎衰竭[3]。上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transformation， EMT）是腎臟纖維化發(fā)生和發(fā)展的重要機制。尋找與腎臟纖維化發(fā)生發(fā)展相關的靶向因子和介導因子是延緩腎功能惡化和改善預后的關鍵環(huán)節(jié)[4]。缺氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α， HIF-1α）的表達，促進腎小管EMT從而導致腎臟纖維化，目前有大量證據支持HIF-1α對EMT的促進作用[5-6]。HIF-1α對EMT的調節(jié)主要表現(xiàn)在對EMT轉錄因子（EMT transcription factors， EMT-TFs）的調節(jié)，如Snail、Slug、Twist1、Zeb1、SIP1等，以及對EMT標記物的調節(jié)，如E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin， α-SMA）。六味地黃湯具有抗氧化、耐缺氧等作用，可延緩腎間質纖維化[7]。本研究通過體外實驗探討六味地黃湯含藥血清對CoCl2誘導的人腎小管上皮細胞HK-2缺氧模型中EMT相關標記物E-cadherin、α-SMA的影響。

1 材料與方法

1.1? 動物及細胞

取健康SPF級雄性和雌性SD大鼠各10只，體質量220～250 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK（湘）2019-0004，動物實驗倫理合格證號：LLBH-202009250003。HK-2（人腎皮質近曲小管上皮）細胞株（批號：CL-0109，武漢普諾賽生命科技有限公司）。實驗經過湖南中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審查（編號為LLBH-202105100002）。

1.2? 藥物

中藥六味地黃湯配方：熟地黃24 g（批號：20111443A）、山藥12 g（批號：CK21051705）、山茱萸12 g（批號：TH21051705）、澤瀉9 g（批號：SX21090610）、茯苓9 g（批號：CK21092703）、牡丹皮9 g（批號：CK21083006），均購自湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院。

1.3? 試劑與儀器

CCK-8試劑盒（Biosharp公司，批號：BS350B）;TC處理細胞爬片24孔板（北京索萊寶科技有限公司，批號：YA0350）;E-cadherin抗體（批號：20874-1-AP）、α-SMA抗體（批號：55135-1-AP）、GAPDH抗體（批號：10494-1-AP）、羊抗兔-HRP（批號：SA00001-2）、羊抗兔-CL594（批號：SA00013-4）、靈敏ELC化學發(fā)光試劑盒（批號：PK10002）均購自Proteintech公司;BCA蛋白定量試劑盒（批號：CW0014S）、快速去基因逆轉錄預混液（批號：CW2020M）、UltraSYBR Mixture（批號：CW0957M）均購自康為世紀生物科技股份有限公司;總RNA快速抽提試劑盒（上海飛捷生物技術有限公司，批號：Cat#220011）;一抗稀釋液（批號：P0256）、二抗稀釋液（批號：P0258）均購自上海碧云天生物技術有限公司。

酶標儀（瑞士Tecan公司，型號：Spark 20M）;電泳/轉膜裝置（美國Bio-Rad公司，型號：Power Pac Basic）;Chemi-DoC-XRS+化學發(fā)光成像分析儀（美國Bio-Rad公司，型號：721BR17573）;正置熒光顯微鏡（型號：Axioscope）、倒置熒光顯微鏡（型號：vert.A1）均購自德國Carl·Zeiss公司;實時熒光定量RCR儀（瑞士Roche公司，型號：LightCycler 96）。

1.4? 含藥血清的獲取

按照隨機數(shù)字表將20只大鼠分為2組：空白對照組、六味地黃湯組，每組10只。六味地黃湯組分別以33.75 g/（kg·d）六味地黃煎液灌胃（相當于70 kg成人劑量的5倍），藥材加入5倍體積的水浸泡2 h，煮沸，再文火煎熬30 min，過濾后收集煎液，原藥渣加少量水煎煮，取二煎液。兩次煎液混勻后放入水浴恒溫器中濃縮為3 g/mL（即每毫升藥液含生藥3 g）?？瞻讓φ战M以10 mL/（kg·d）蒸餾水灌胃。適應性飼養(yǎng)3 d后開始灌胃，灌胃5 d后，提取血清。取血方法：每只大鼠麻醉前90 min灌胃，大鼠麻醉、固定，腹主動脈取血，靜置2 h，2000 r/min，4 ℃離心15 min，離心半徑17.3 cm。離心后用微孔濾膜防止微生物感染，血清分裝儲存于-70 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5? 血清濃度及干預時間的篩選

采用CCK-8法將細胞以2×104個/mL、200 μL/孔的密度接種在96孔板中，在37 ℃、5%CO2箱中培養(yǎng)24 h，移出孔板，吸棄完全培養(yǎng)基，分別加入200 μL/孔含有2.5%、5%、10%、20%、40%濃度含藥血清的基礎培養(yǎng)基;分別于24、36 h干預后取出96孔板;傾去舊培養(yǎng)液，基礎培養(yǎng)基和CCK-8反應溶液以9∶1配制;在37 ℃、5%CO箱中繼續(xù)孵育2 h;用酶標儀測量450 nm處的吸光度（OD），并通過細胞存活率判定各種濃度下的細胞增殖活性，選擇適當?shù)难鍧舛群腿毖鯐r間。

1.6? 化學缺氧劑CoCl濃度的篩選

稱取0.143 g CoCl·6H2O，溶于50 mL純水中，混勻，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，配制母液濃度為12 000 μmol·L，4 ℃保存。取對數(shù)生長期細胞制備細胞懸液，以5×10/孔接種于96孔板，待細胞貼壁后每孔分別加入終濃度150、200、300、600 μmol·L CoCl溶液，培養(yǎng)24 h。CCK-8法檢測細胞活力，篩選最佳造模濃度。

1.7? 細胞模型建立及分組、干預

使用HK-2細胞株，將體外培養(yǎng)的HK-2細胞分為正常組（10%空白血清）、模型組（10%空白血清+200 μmol·L CoCl）、含藥血清組（10%含藥血清+200 μmol·L CoCl）。3組細胞分別用空白、含藥血清預先干預3 h，模型組、含藥血清組隨后加入200 μmol·L CoCl模擬腎內缺氧環(huán)境，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.8? qRT-PCR法檢測E-cadherin、α-SMA mRNA的表達

采用快速提取RNA法提取各組HK-2細胞的總RNA，分光光度儀測定總RNA含量及濃度，再使用逆轉錄酶試劑盒將RNA逆轉錄到cDNA，根據qRT-PCR法試劑盒說明書進行擴增。擴增條件：95 ℃預變性10 min;95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸32 s，40個循環(huán)。以β-actin為內參，采用2法計算E-cadherin、α-SMA基因相對表達量。引物序列見表1，實驗重復3次。

1.9? Western blot法檢測E-cadherin、α-SMA蛋白的表達

25 cm細胞培養(yǎng)瓶收集各組細胞，分別加入50 μL蛋白裂解液;細胞刮刀將細胞刮下后，4 ℃下 12 000 r/min離心20 min，離心半徑20 cm，取上清液;采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白質濃度;根據濃度測定結果對蛋白濃度進行調整，保證不同組別之間蛋白濃度一致，每孔上樣量為10 μg，與適量SDS-PAGE Loading Buffer混勻，95 ℃、10 min 后進行上樣。制備電泳膠、上樣電泳、轉膜、封閉、孵一抗4 ℃冰箱過夜[用一抗稀釋液稀釋相應的一抗，E-cadherin（1∶3000）、α-SMA（1∶700）];室溫孵二抗2 h [用二抗稀釋液稀釋相應的二抗（1∶15 000）]、ECL化學發(fā)光試劑激發(fā)熒光，X片曝光，顯影、定影，用凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描分析條帶，比較目的條帶相對灰度值。實驗重復3次。

1.10? 免疫熒光檢測E-cadherin、α-SMA的蛋白表達情況

將HK-2細胞以5×10個/mL、500 μL/孔密度分別接種于24孔板爬片中;待細胞生長至80%密度后，將各組細胞分組造模;每孔滴加4%多聚甲醛進行細胞固定10～15 min;0.1%曲拉通通透10 min;5% BSA在37 °C封閉30 min;加入一抗[用PBS稀釋一抗，E-cadherin（1∶200）、α-SMA（1∶500）]4 °C冰箱孵育過夜;室溫靜置30 min;加入熒光二抗 [用PBS稀釋二抗（1∶200）] 37 °C避光孵育1 h;滴加DAPI核染色2 min（上述每個步驟結束后需用PBST漂洗5 min×3次）;抗熒光淬滅劑封片。每組拍攝3次，重復3次。用Image J軟件分析各組HK-2細胞E-cadherin、α-SMA的平均熒光強度。

1.11? 統(tǒng)計學分析

用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計學分析，雙側檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。計量資料用“x±s”表示。先進行正態(tài)性及方差齊性檢驗，若數(shù)據呈正態(tài)分布，且方差齊，則進行單因素方差分析。若不滿足正態(tài)性要求，則采用非參數(shù)檢驗。

2 結果

2.1? 血清最佳干預濃度及時間的確定

含藥血清和空白血清在干預24 h的存活率趨勢更好，其中10%含藥血清干預24 h的存活率為93.6%±7.7%，10%空白血清干預24 h的存活率為92.4%±5.5%，故選擇10%為兩組血清的干預濃度。見圖1。

2.2? CoCl最佳干預濃度的確定

隨著CoCl作用濃度增加，HK-2細胞形態(tài)發(fā)生變化，由正常的鵝卵石鋪板狀橢圓形，到缺氧后呈長梭形改變。CCK-8測得150、200、300、600 μmol·L

CoCl2干預HK-2細胞的存活率，分別為115.1%±0.7%、91.0%±0.9%、74.3%±7.0%、15.6%±3.0%。根據實驗結果選擇200 μmol·L CoCl作為干預濃度。見圖2。

2.3? qRT-PCR法檢測各組E-cadherin、α-SMAmRNA相對表達量

與正常組比較，模型組E-cadherin相對表達量降低（P<0.01）、α-SMA相對表達量增加（P<0.01）;與模型組比較，含藥血清組E-cadherin的相對表達量升高（P<0.01）、α-SMA的相對表達量明顯降低（P<0.01）。見圖3。

2.4? Western blot法檢測各組HK-2細胞中E-cadherin、α-SMA 蛋白水平表達情況

與正常組比較，模型組E-cadherin蛋白表達量降低（P<0.01）、α-SMA蛋白表達量增加（P<0.05）;與模型組比較，含藥血清組的E-cadherin的蛋白表達量明顯升高（P<0.01）、α-SMA的蛋白表達量明顯降低（P<0.01）。見圖4。

2.5? 免疫熒光檢測各組HK-2細胞中E-cadherin、α-SMA蛋白水平表達

與正常組比較，模型組E-cadherin蛋白的平均熒光強度減少、α-SMA蛋白的平均熒光強度增加（P<0.01）;與模型組比較，含藥血清組E-cadherin蛋白的平均熒光強度增加、α-SMA蛋白的平均熒光強度減少（P<0.01）。見圖5-6。

3 討論

腎纖維化是指腎單位破壞，間質中成纖維細胞大量增生、肌成纖維細胞形成、細胞外基質過度沉積導致腎小球硬化、腎小管間質纖維化。EMT指上皮細胞通過特定程序轉化為具有間質表型細胞的生物學過程，是導致腎間質纖維化的重要機制之一。而缺氧對EMT有促進作用，這一發(fā)現(xiàn)在腫瘤領域[8-9]以及相關器官的纖維化[10-11]都得到了驗證。E-cadherin是一種鈣依賴的跨膜糖蛋白，主要介導細胞間的黏附。缺乏鈣黏蛋白是EMT的核心，從而導致失去上皮細胞極性、附著力不穩(wěn)定、細胞骨架結構的變化[12]。α-SMA是血管平滑肌細胞內肌動蛋白異構體，是EMT時間葉組織表型常用標志物之一[13]，在纖維化進程中起關鍵作用。EMT過程中，E-cadherin表達進行性下降，α-SMA蛋白表達增強[14]。

六味地黃湯出自宋代錢乙（錢仲陽）著《小兒藥證直訣》，是以《金匱要略》中腎氣丸減附子、肉桂而成。方中組成：熟地黃24 g，山茱萸12 g、干山藥12 g，澤瀉、牡丹皮、白茯苓各9 g。六味地黃湯“三補三瀉”的特點，可補脾腎之虛。目前，六味地黃湯已被廣泛運用于慢性腎炎[15]、高血壓[16]、糖尿病[17]等脾腎陰虛證者。

團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，六味地黃湯可明顯降低5/6腎切除大鼠血尿素氮、肌酐水平，減輕腎組織病理變化，減少間質膠原纖維增生，減少腎組織中Ⅰ型、Ⅲ型膠原、纖連蛋白表達水平[18]。體內實驗發(fā)現(xiàn)，六味地黃湯可下調在5/6腎切除大鼠腎組織HIF-1α的表達，后者下調Twist的表達，上調E-cadherin表達，從而延緩腎纖維化[19]。本研究在前期研究基礎上，進一步通過體外實驗，探討六味地黃湯抗纖維化機制是否與抑制腎小管上皮細胞間充質轉化有關。

本研究通過CCK-8實驗，首先確定正常大鼠血清和含藥血清的最佳干預濃度，2.5%、5%濃度過低干預效果不明顯，40%濃度過高細胞存活率不佳，選取最佳干預濃度為10%，干預時間越長，細胞存活率越低，24 h的存活率明顯高于36 h，因此選擇干預時間為24 h。同時進行CoCl2濃度篩選，并選擇24 h CoCl2干預的濃度為200 μmol·L。結合先前大量研究結論：調控EMT相關分子標志物的表達，可以挽救腎纖維化[20-21]。本研究通過qRT-PCR、蛋白印跡和免疫熒光實驗結果顯示，上皮細胞標志物E-cadherin在模型組HK-2細胞中蛋白水平和mRNA表達均低于對照組，而間葉細胞標志物α-SMA在模型組HK-2細胞中蛋白和mRNA表達水平均高于對照組，且差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01），說明CoCl2可誘導HK-2細胞缺氧發(fā)生EMT。研究結果還顯示，與模型組相比，含藥血清組E-cadherin蛋白和mRNA表達水平均明顯升高，而α-SMA蛋白和mRNA表達水平均明顯降低，且差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01），說明六味地黃湯可通過調節(jié)EMT相關分子標志物E-cadherin、α-SMA的表達改善腎小管EMT。

綜上所述，本研究初步證實了CoCl2可誘導HK-2缺氧發(fā)生EMT，六味地黃湯含藥血清能下調α-SMA的表達，上調E-cadherin的表達，從而緩解腎臟EMT，為腎臟纖維化的治療提供實驗依據。

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