張文莉，王彩麗，馮彩霞，王蕊，高瑞，李光，張興旺

宮頸鱗癌是婦科常見生殖道惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率有所上升，并呈年輕化趨勢。宮頸鱗癌是宮頸癌最常見的病理類型，約占70%以上[1]，其發(fā)生發(fā)展受多因素、多階段長期作用影響，分析其可能的分子機制，對宮頸鱗癌早期診斷、預(yù)后干預(yù)具有重要臨床意義。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類單鏈非編碼小分子RNA，通過與靶基因3’-非翻譯端結(jié)合抑制其表達來參與腫瘤的增殖、分化、遷移和凋亡[2-3]。miRNA在腫瘤中的作用越來越受到關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)[4]，miR-448在非小細胞肺癌中低表達，上調(diào)miR-448可抑制腫瘤細胞增殖分化、遷移侵襲作用，可能通過靶向鋅指E盒結(jié)合的同源盒蛋白2發(fā)揮抑癌作用。關(guān)于miR-448在宮頸鱗癌中的表達尚不清楚。賴氨酸特異性脫甲基酶2B(lysine-specific demethylase 2B，KDM2B)參與細胞的正常生命進程，如細胞衰老、細胞分化、干細胞自我更新等[5]。楊慧蘭等[6]報道，KDM2B在惡性卵巢癌中表達上調(diào)，腫瘤低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者KDM2B陽性表達率更高，提示KDM2B參與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展進程。KDM2B是否在宮頸鱗癌中發(fā)揮同樣的分子作用尚未見報道。因此，本研究通過檢測宮頸鱗癌組織中miR-448、KDM2B信使核糖核酸(mRNA)和蛋白表達情況，分析其可能的作用機制，探究其臨床價值，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年8月—2020年3月于榆林市第一醫(yī)院婦產(chǎn)科行腹腔鏡手術(shù)及術(shù)后病理檢查確診為宮頸鱗癌患者96例為研究對象，年齡44～72(49.57±5.63)歲，年齡>50歲者32例，年齡≤50歲者64例；腫瘤分化程度：高分化50例，低、中分化46例；FIGO分期[7]：Ⅰ～Ⅱ期47例，Ⅲ期49例；浸潤宮頸纖維肌壁深度≤1/2者34例，浸潤宮頸纖維肌壁深度>1/2者62例；有脈管癌栓39例，無脈管癌栓57例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移40例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移56例。手術(shù)獲取患者宮頸鱗癌組織和癌旁正常宮頸組織。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(榆醫(yī)倫審2017-32號)，患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準：①均經(jīng)病理組織檢查確診；②術(shù)前3個月內(nèi)無內(nèi)分泌類、激素類或抗生素類藥物治療史；③無圍產(chǎn)期癥狀；④臨床資料完整。(2)排除標準：①合并其他惡性腫瘤；②嚴重心、肝、腎、肺等器質(zhì)性疾?。虎坌g(shù)前行放療、化療、生物治療等；④失訪患者。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 miR-448、KDM2B mRNA表達水平檢測：采用熒光定量PCR技術(shù)(熒光定量PCR儀購自拓赫機電科技上海有限公司，型號THT-96G)檢測miR-448、KDM2B mRNA表達水平。先取宮頸鱗癌組織和癌旁正常宮頸組織各20 mg置于裂解液200 μl中，搗碎、勻漿，再利用TRIzol試劑(上海通蔚生物有限公司)提取總RNA，用紫外分光光度計檢測總RNA純度，以O(shè)D260/OD280值1.8～2.0為純度較好。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海通蔚生物有限公司)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進行PCR擴增，所有過程均嚴格按照試劑盒說明書操作步驟執(zhí)行。循環(huán)參數(shù)：95℃ 預(yù)變性3 min，90℃ 變性10 s，60℃ 退火20 s，72℃ 延伸30 s，共40個循環(huán)。利用2-△△Ct法計算miR-448、KDM2B mRNA表達水平。以U6為內(nèi)參，miR-448上游引物為5’-CATTACGGAGCCCAGTGTT-3’，下游引物為5’-CTGATTCCCCCGACATFCTT-3’；KDM2B mRNA上游引物為5’-TCGGACTAAGCTTGAGCCATA-3’，下游引物為5’-CGAAGTCGCCCAATAGAATCG-3’；U6上游引物為5’-GGGCTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物為5’-GAGCGTGCAGATAATTGACAAGG-3’。重復(fù)3次，取平均值。引物由北京曠博生物技術(shù)股份有限公司合成。

1.3.2 KDM2B蛋白檢測：采用免疫組織化學(xué)法(上海通蔚生物有限公司)對宮頸鱗癌組織和正常宮頸組織進行SP染色，檢測過程均按照試劑盒說明書步驟操作，工作液濃度1∶200，以磷酸鹽緩沖溶液代替一抗作為陰性對照。每張切片隨機選取3個高倍清晰視野，最終結(jié)果取平均值。按染色強度計分：細胞未著色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，深棕色計3分；按陽性細胞所占百分比計分：<25%計1分，25%～50%計2分，>50%計3分。染色強度計分與陽性細胞所占百分比計分乘積作為最終結(jié)果[8]，≥3分判定為陽性(+)，否則為陰性(-)。

1.3.3 病情復(fù)發(fā)情況：術(shù)后第1天開始隨訪，以門診或電話方式隨訪18個月，前6個月內(nèi)每2個月隨訪1次，之后每3個月隨訪1次，隨訪終止日期為患者復(fù)發(fā)或2021年9月30日。復(fù)發(fā)判斷標準[9]：患者有復(fù)發(fā)癥狀，盆腔、細胞學(xué)及常規(guī)影像學(xué)檢查異常，且通過活檢或手術(shù)確定。根據(jù)隨訪期間宮頸鱗癌患者復(fù)發(fā)情況，將其分為復(fù)發(fā)組37例和未復(fù)發(fā)組59例。

2 結(jié) 果

2.1 不同組織中miR-448、KDM2B mRNA表達水平比較 宮頸鱗癌組織中miR-448表達水平明顯低于正常宮頸組織(P<0.01)，KDM2B mRNA表達水平明顯高于正常宮頸組織(P<0.01)，見表1。

表1 宮頸鱗癌組織和正常宮頸組織中miR-448、KDM2B mRNA表達水平比較

2.2 復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組患者宮頸鱗癌組織中miR-448、KDM2B mRNA表達水平比較 復(fù)發(fā)組患者宮頸鱗癌組織中miR-448表達水平低于未復(fù)發(fā)組，KDM2B mRNA水平明顯高于未復(fù)發(fā)組(P<0.01)，見表2。

表2 復(fù)發(fā)組和未復(fù)發(fā)組宮頸鱗癌組織中miR-448、KDM2B mRNA表達水平比較

2.3 宮頸癌組織和正常宮頸組織KDM2B蛋白表達比較 免疫組織化學(xué)染色顯示，KDM2B主要定位于宮頸鱗癌細胞的細胞核，陽性表達產(chǎn)物由弱到強依次呈淺黃色、黃棕色、棕色或深棕色分布，見圖1。宮頸鱗癌組織中KDM2B蛋白陽性64例(66.67%)，正常宮頸組織中KDM2B蛋白陽性33例(34.38%)，2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=20.023，P<0.001)。

圖1 宮頸鱗癌組織和正常宮頸組織中KDM2B蛋白表達情況(免疫組織化學(xué)染色，×100)

2.4 miR-448、KDM2B mRNA表達水平在不同宮頸鱗癌患者臨床病理參數(shù)中比較 miR-448、KDM2B mRNA表達水平在宮頸鱗癌患者年齡、浸潤深度、是否合并脈管癌栓方面比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；腫瘤低中分化、FIGO分期Ⅲ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者宮頸鱗癌組織中miR-448表達水平明顯低于高分化、FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(P<0.05)，KDM2B mRNA表達水平明顯高于高分化、FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(P<0.05)，見表3。

表3 miR-448、KDM2B mRNA表達水平在不同宮頸鱗癌患者臨床病理參數(shù)中比較

2.5 miR-448與KDM2B mRNA表達的相關(guān)性分析 宮頸鱗癌組織中miR-448與KDM2B mRNA表達水平呈負相關(guān)(r=-0.605，P<0.001)。

2.6 影響宮頸鱗癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的危險因素分析 以宮頸鱗癌患者術(shù)后是否發(fā)生復(fù)發(fā)為因變量(1=是，0=否)，以腫瘤分化程度(1=低中分化，0=高分化)、FIGO分期(1=Ⅲ期，0=Ⅰ～Ⅱ期)、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移(1=是，0=否)、miR-448和KDM2B mRNA連續(xù)變量為自變量進行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，腫瘤低中分化、FIGO分期Ⅲ期、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miR-448低表達、KDM2B mRNA高表達是影響宮頸鱗癌患者術(shù)后發(fā)生復(fù)發(fā)的獨立危險因素(P<0.05)，見表4。

表4 影響宮頸鱗癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的危險因素Logistic回歸分析

3 討 論

miRNA是一類由20～22個核苷酸組成的非編碼核酸單鏈小分子，通過抑制靶mRNA翻譯或轉(zhuǎn)錄后水平參與各種生理調(diào)節(jié)[10-11]。不同的miRNA或同一miRNA在不同腫瘤中可能存在表達異質(zhì)性。miR-448是一種常見miRNA，研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌組織和細胞中miR-448呈現(xiàn)低表達，miR-448過表達可抑制胰腺癌細胞的遷移、侵襲和增殖[12]。另有國外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，非小細胞肺癌細胞中miR-448表達下調(diào)，miR-448過表達通過抑制非小細胞肺癌中的胰島素受體底物2表達來抑制細胞增殖、轉(zhuǎn)移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，提示miR-448在非小細胞肺癌中發(fā)揮抑癌基因作用，可逆轉(zhuǎn)疾病進展和不良臨床結(jié)局[13]。Pu等[14]研究報道，在甲狀腺乳頭狀癌組織和細胞系中，miR-448表達降低而賴氨酸特異性脫甲基酶5B表達升高，且miR-448表達與患者的N分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有一定關(guān)系，得出賴氨酸特異性脫甲基酶5B介導(dǎo)的miR-448上調(diào)通過抑制轉(zhuǎn)化生長因子β誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子1抑制甲狀腺乳頭狀癌細胞進展，從而減緩腫瘤生長。本結(jié)果顯示，宮頸鱗癌組織中miR-448表達水平明顯低于正常宮頸組織，與Pu等[14]研究類似，表明miR-448可能與宮頸鱗癌的發(fā)生有關(guān)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，宮頸鱗癌患者腫瘤分化程度越低、FIGO分期越高，其miR-448表達水平越低；且發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者宮頸鱗癌組織中miR-448表達水平顯著低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，表明miR-448可能參與宮頸鱗癌患者腫瘤分化、侵襲和轉(zhuǎn)移過程，高水平miR-448發(fā)揮抑癌作用[15-17]。

表觀遺傳因子KDM2B是一種新型致癌因子。Quan等[18]研究報道，KDM2B通過單極紡錘體—結(jié)合蛋白1調(diào)節(jié)Hippo通路，促進胰腺導(dǎo)管腺癌細胞增殖、遷移和侵襲。侯海瑞等[19]研究顯示，惡性卵巢組織中KDM2B呈高表達，且與腫瘤組織分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FIGO分期相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，宮頸鱗癌組織中KDM2B呈高表達，其在腫瘤組織中的陽性表達率明顯高于正常宮頸組織，腫瘤低、中分化、FIGO分期Ⅲ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者宮頸鱗癌組織中KDM2B mRNA表達水平明顯高于高分化、FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，表明高水平KDM2B對宮頸鱗癌的發(fā)生和進展起促進作用，與其他研究表達趨勢一致[20-22]。最近一項研究發(fā)現(xiàn)，KDM2B可激活前列腺癌腫瘤細胞中的黏著斑激酶(FAK)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)位點，證實了FAK/PI3K信號通路在調(diào)節(jié)前列腺癌細胞遷移中的作用，揭示了組蛋白脫甲基化酶可能通過協(xié)調(diào)不同信號通路來共同參與腫瘤細胞的遷移[23]。Hong等[24]研究發(fā)現(xiàn)，miR-448通過刺激糖酵解促進胃癌細胞增殖，通過生物信息學(xué)方法篩選出KDM2B是miR-448的候選轉(zhuǎn)錄抑制因子，并利用熒光素酶實驗證實了KDM2B是miR-448的直接靶點，在胃癌細胞中發(fā)揮重要作用。本研究利用Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，宮頸鱗癌組織中miR-448和KDM2B mRNA表達水平呈負相關(guān)，推測低水平的miR-448可能靶向上調(diào)KDM2B表達，參與宮頸鱗癌細胞增殖分化、遷移侵襲等過程，具體作用方式或機制還需開展體外實驗進一步分析驗證。研究顯示，miR-448低表達的肺癌患者預(yù)后較差，而KDM2B陽性表達的胃癌患者中位生存期較短[20，25-26]。本研究中，復(fù)發(fā)組宮頸鱗癌組織中miR-448表達水平較未復(fù)發(fā)組低，KDM2B mRNA表達水平較未復(fù)發(fā)組高，與既往研究相似，表明miR-448和KDM2B mRNA表達可能與宮頸鱗癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)情況有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，miR-448低表達、KDM2B mRNA高表達是影響宮頸鱗癌患者術(shù)后發(fā)生復(fù)發(fā)的獨立危險因素，表明miR-448和KDM2B可能作為指示宮頸鱗癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的潛在指標。

綜上所述，宮頸鱗癌患者腫瘤組織中miR-448呈低表達，KDM2B呈高表達，二者可能在分子水平上存在靶向關(guān)系，共同作用參與腫瘤細胞增殖分化、遷移侵襲等過程，并可作為指示宮頸鱗癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的潛在指標。具體作用機制有待進一步體外實驗研究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

張文莉、王彩麗：設(shè)計研究方案，課題設(shè)計，實施研究過程，論文撰寫；馮彩霞、王蕊：提出研究思路，分析試驗數(shù)據(jù)，論文審核；高瑞：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改；李光、張興旺：進行統(tǒng)計學(xué)分析