劉 倩，王少婷，姜永瑋，于 洋，叢 笑，曹永彤，馬 亮

（中日友好醫(yī)院 檢驗(yàn)科，北京 100029）

隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，臨床分子生物學(xué)診斷水平在不斷提升，臨床分子生物學(xué)檢測從手工操作發(fā)展為更精準(zhǔn)的自動化操作，可排除人為因素造成的誤差及污染。 根據(jù)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所（clinical and laboratory standards institute，CLSI）[1，2]以及中國合格評定國家認(rèn)可委員會（China national accreditation service for conformity assessment，CNAS）[3～5]的要求，在新引入儀器進(jìn)行常規(guī)應(yīng)用前，由臨床實(shí)驗(yàn)室對儀器設(shè)備及項(xiàng)目進(jìn)行獨(dú)立驗(yàn)證?，F(xiàn)將全自動核酸提取儀Autrax-192 自動提取高危型人乳頭瘤病毒（HR-HPV）核酸的正確度、精密度、線性范圍、分析靈敏度及攜帶污染結(jié)果報(bào)道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

上海之江生物科技有限公司可溯源HPV（16+）型企業(yè)參考品 L1 （1.0E7copies/ml）、L2 （1.0E6copies/ml）、L3（1.0E5copies/ml）、L4 （1.0E4copies/ml）、L5（2.5E3copies/ml）、L6（6.25E2copies/ml）。 HR-HPV 15 種分型核酸（16、56、31、18、52、58、68、45、82、33、35、39、51、59、66）陽性質(zhì)控品P4（1.0E4copies/ml）、P5（1.0E3copies/ml）、P6（1.0E2copies/ml）。

1.2 儀器與試劑

全自動核酸提取儀Autrax-192，SLAN-96 PCR 儀，5810R 臺式高速冷凍離心機(jī)，HR-HPV 核酸15 種分型（16、56、31、18、52、58、68、45、82、33、35、39、51、59、66） 測定試劑盒（上海之江生物科技股份有限公司）。

1.3 性能評價(jià)方案

1.3.1 正確度評價(jià)

選取40 份中日友好醫(yī)院HR-HPV 檢測樣本，采用實(shí)驗(yàn)室已通過室間質(zhì)評的手工法提取核酸作金標(biāo)準(zhǔn)，同步使用Autrax-192 提取核酸進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，SLAN-96 PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。 記錄檢測結(jié)果，進(jìn)行正確度評價(jià)。

1.3.2 精密度評價(jià)

參考品L1 和L3， 使用Autrax-192 同日進(jìn)行20 次核酸提取，進(jìn)行熒光PCR，得出批內(nèi)均值、標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù)CV 值；參考品L1 和L3 分裝為20 份置于-20℃保存，使用Autrax-192 連續(xù)提取核酸20d，進(jìn)行熒光PCR，得出批內(nèi)以及批間均值、標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù)CV 值。

1.3.3 線性范圍評價(jià)

參考品L1- L6， 使用Autrax-192 每個濃度進(jìn)行6 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，計(jì)算L1- L6 每個濃度均值Ct 值，將測得值與理論值進(jìn)行線性回歸分析，評估其線性區(qū)間。

1.3.4 分析靈敏度探索

在準(zhǔn)確度、精密度結(jié)果達(dá)到實(shí)驗(yàn)室要求后，陽性質(zhì)控品P4、P5、P6 使用Autrax-192 提取核酸進(jìn)行分析靈敏度探索，每個濃度5 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，記錄檢出率。

1.3.5 攜帶污染評價(jià)

使用Autrax-192 進(jìn)行線性范圍評價(jià)，同時將陰性樣本穿插置于樣本孔位，每次放置3 例陰性樣本，提取核酸進(jìn)行熒光PCR，評估Autrax-192 防污染能力。

1.4 病毒核酸提取

根據(jù)Autrax-192 操作說明書，自動化核酸提取、試劑分裝及模板加樣，模板DNA 4滋l，聚合酶鏈反應(yīng)檢測混合液36滋l。 同時使用傳統(tǒng)手工煮沸法對40 例臨床樣本進(jìn)行核酸提取，模板DNA 4滋l，聚合酶鏈反應(yīng)檢測混合液36滋l。

1.5 HR-HPV DNA 分型檢測

采用HR-HPV 15 種型別的特異性引物以及熒光探針，應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）結(jié)合Taqman 技術(shù)，對特異性DNA 核酸片段進(jìn)行分型定性檢測， 共包含4 種反應(yīng)體系，1 為16 型、56 型、31 型以及內(nèi)標(biāo)（internal control），2 為18、52、58、68，3 為45、82、33、35，4 為39、51、59、66。

SLAN-96 PCR 儀， 設(shè)置循環(huán)參數(shù)為94℃10min；93℃10s→62℃31s，循環(huán)40 次，單點(diǎn)熒光檢測在62℃，熒光通道選擇FAM 和VIC 通道。

1.6 結(jié)果判讀

4 種混合液在FAM 和VIC 通道均無Ct 值， 判定為陰性；Ct 值≤38.0 且擴(kuò)增曲線呈典型的S 型，判定為HPV 陽性；Ct 在38.0～40.0 之間，需重復(fù)測定，若仍在38.0～40.0 之間且擴(kuò)增曲線呈典型S 型，則判定為陽性，反之為陰性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS22.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及分析。

2 結(jié)果

2.1 正確度

以通過室間質(zhì)評的手工法為金標(biāo)準(zhǔn)，HR-HPV 臨床樣本40 例，其中陽性35 例、陰性5 例； Autrax-192 提取核酸檢測結(jié)果陽性35 例，陰性5 例，與手工法陰陽符合率為100%，符合實(shí)驗(yàn)室要求，見表1。

表1 全自動核酸提取儀Autrax-192 與手工法比較

2.2 精密度

選取高濃度L1 和低濃度L3 進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)，同日進(jìn)行20 次核酸提取進(jìn)行熒光PCR，得出Ct 值。 批內(nèi)變異系數(shù)2.96%～3.36%；參考品分裝為20 份-20℃保存，連續(xù)測定20d，得出批間變異系數(shù)CV 為2.89%～3.41%，見表2。

表2 批內(nèi)以及批間精密度

2.3 線性范圍

L1～L4 進(jìn)行6 個復(fù)孔檢測，L5 及L6 進(jìn)行5 個復(fù)孔檢測，記錄每孔位CT 值。 各孔位CT 值的CV 值均5%，其中L6 濃度水平未檢出。

以L1～L5 樣本理論濃度對數(shù)值為X，各濃度實(shí)際測定值均值為Y，進(jìn)行線性擬合。 在2.5E3～1.0E7copies/ml 范圍內(nèi)，Y=-3.9097X+46.336，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.991，線性優(yōu)，本系統(tǒng)對于高危型HPV 病毒核酸檢測性能優(yōu)于廠家聲明1.0E4～1.0E7copies/ml。

2.4 分析靈敏度試驗(yàn)

在精密度、正確度試驗(yàn)結(jié)果達(dá)到實(shí)驗(yàn)室要求后，使用陽性質(zhì)控品P4、P5、P6 對HPV 15 種型別進(jìn)行檢測。 18、33、35、39、45、51、52、58、59、66、68、82 型分析靈敏度可達(dá)1.0E3copies/ml，優(yōu)于生產(chǎn)廠家聲明1.0E4copies/ml；16 型、31型、56 型分析靈敏度達(dá)到生產(chǎn)廠家聲明。

2.5 攜帶污染

共檢測陰性樣本18 例，結(jié)果均為No Ct，攜帶污染率為0。

3 討論

HR-HPV 持續(xù)反復(fù)感染與子宮頸癌[6]及其癌前病變密切相關(guān)，2014年WHO 及2015年美國FDA 提出用HPV分型檢測[7]作為宮頸癌篩查的首選方法，各醫(yī)院對于HRHPV 核酸檢測的質(zhì)量以及效率要求越來越高。 因此選擇更為客觀且標(biāo)準(zhǔn)化，不易受人為因素干擾的全自動核酸提取儀， 對于提升核酸提取及檢測的效率及質(zhì)量尤為重要。因此，本研究在正確度、精密度、線性范圍、分析靈敏度、攜帶污染[8，9]對Autrax-192 進(jìn)行了評價(jià)。

精確度，又稱準(zhǔn)確度，指測得值與“真值”的接近程度以及測得值之間的一致程度。本次正確度實(shí)驗(yàn)以通過室間質(zhì)評的手工法為金標(biāo)準(zhǔn)， 同步Autrax-192 進(jìn)行核酸檢測，結(jié)果與手工法陰陽符合率符合實(shí)驗(yàn)室要求； 精密度評價(jià)，選兩個水平參考品進(jìn)行多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，批內(nèi)精密度和總精密度均達(dá)到ISO15189 要求， Autrax-192 具有良好的精密度以及重復(fù)性。

線性范圍是反映實(shí)驗(yàn)室方法性能的重要指標(biāo)，在2.5E3～1.0E7copies/ml 濃度內(nèi)，線性回歸相關(guān)系數(shù)R2>0.99，說明儀器對于高危型HPV 病毒核酸檢測性能良好， 并且優(yōu)于廠家聲明的線性濃度范圍（1.0E4～1.0E7copies/ml）。

分析靈敏度評價(jià)中，高危型HPV-16、56、31 型分析靈敏度達(dá)到廠家聲明1.0E4copies/ml， 其余亞型可達(dá)1.0E3copies/ml。 本試劑盒使用的是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）結(jié)合Taqman 技術(shù)， 引入內(nèi)標(biāo) （internal control） 作為熒光PCR 反應(yīng)的內(nèi)參，排除掉管間差異及避免假陰性結(jié)果。 學(xué)者[10]發(fā)現(xiàn)內(nèi)標(biāo)在一定程度上會導(dǎo)致PCR 檢測靈敏度下降，尤其當(dāng)兩種模板的起始拷貝數(shù)相差較大時，競爭會表現(xiàn)得更為顯著。 本研究中，高危型HPV-16、56、31 型與內(nèi)標(biāo)在同一反應(yīng)體系中，分析靈敏度雖然達(dá)到了廠家聲明，但與其余3 個體系相比，分析靈敏度下降，說明內(nèi)標(biāo)與靶模板存在競爭抑制，待測模板的擴(kuò)增受一定干擾。 為保證低濃度待測模板的檢出， 對于內(nèi)標(biāo)基因的濃度還需后續(xù)探索。實(shí)驗(yàn)過程中未發(fā)現(xiàn)儀器存在攜帶污染。

綜上所述，Autrax-192 可以滿足臨床工作需要， 全程自動化提取及加樣過程標(biāo)準(zhǔn)化操作，減少了不同人員之間的差異，在保證了檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的前提下，提升了檢測效率，實(shí)驗(yàn)室可以用于常規(guī)HR-HPV 核酸檢測。