王皓南，王文晞，郭江紅，姜紅，

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，武漢 430065；2.湖北省藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，武漢 430075)

人凝血因子Ⅷ(human coagulation factor Ⅷ，F(xiàn)-Ⅷ)是人體內(nèi)源性凝血途徑的主要成分。血液中F-Ⅷ缺乏會(huì)導(dǎo)致不同程度的凝血功能障礙，即甲型血友病[1]。F-Ⅷ是所有血漿凝血因子中含量最低者，血漿內(nèi)含量為0.1 mg·L-1，等電點(diǎn)約為4.3，以單鏈形式合成[2-3]。由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜且分子量大，致使 F-Ⅷ很不穩(wěn)定，在原料血漿收集以及提取制備過(guò)程中容易降解失活。不同企業(yè)采用工藝不同，F(xiàn)-Ⅷ提取純化工藝、藥品的包裝儲(chǔ)存以及輸液方式也可影響其凝血活性，致使人凝血因子Ⅷ產(chǎn)品間的質(zhì)量可能存在差異。

分子量是蛋白質(zhì)的最基本性質(zhì)，是蛋白質(zhì)分析鑒定的重要依據(jù)。因此，測(cè)定分子量及其分布對(duì)于F-Ⅷ產(chǎn)品的質(zhì)量控制和質(zhì)量評(píng)價(jià)有重要意義。多角度激光光散射儀能夠測(cè)定生物大分子的絕對(duì)分子量[4-7]，同時(shí)，無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)校正，并獲得樣品分子量分布和樣品構(gòu)象信息。筆者未見(jiàn)用此項(xiàng)技術(shù)測(cè)定F-Ⅷ分子量及其分布的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本文以不同企業(yè)(A、B、C)的F-Ⅷ產(chǎn)品為研究對(duì)象，建立了高效分子排阻色譜-多角度激光光散射法(high performance molecular exclusion chromatography-multi angle laser light scatter，HPSEC -MALLS)測(cè)定F-Ⅷ產(chǎn)品分子量及其分布的方法，并對(duì)不同企業(yè)產(chǎn)品的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較。

1 材料與方法

1.1儀器 Waters e2695-2414液相系統(tǒng)(沃特世科技有限公司)，Wyatt Heleos Ⅱ多角度激光光散射檢測(cè)器(美國(guó)懷雅特技術(shù)公司)，AUW220D 電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司，感量：0.1 mg)，TSK gel G3000SWXL(7.8 mm×300mm，5 μm)凝膠柱(日本東曹株式會(huì)社)，Waters2414 示差折光檢測(cè)器(沃特世科技有限公司)，Astra軟件。

1.2試藥 血清白蛋白(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：140619-201723，每支21.8 mg)；F-Ⅷ(企業(yè)A，規(guī)格：每瓶200 U，批號(hào)：20190825，20190826，20190932，20190934，20200308；企業(yè)B，規(guī)格：每瓶300 U，批號(hào)：20190402，20190507，20190608，20190609，20190713；企業(yè)C，規(guī)格：每瓶200 U，批號(hào)：20201102，20210103，20210402。共13批)；二水磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)、二水磷酸氫二鈉(Na2HPO4·2H2O)、異丙醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，其他試劑均為色譜純，水為超純水。

1.3色譜條件 流動(dòng)相：0.5 mol·L-1NaH2PO4·2H2O 200 mL，0.5 mol·L-1Na2HPO4.2H2O 420 mL，異丙醇15.5 mL，超純水914.5 mL(混勻后用孔徑0.45 μm水溶性膜濾過(guò)并超聲脫氣)；流速：0.6 mL· min-1，進(jìn)樣量20 μL，柱溫30 ℃，示差溫度：30 ℃，dn/dc值：0.185[8]。

1.4對(duì)照品溶液的制備 將血清白蛋白用流動(dòng)相稀釋成每毫升含蛋白質(zhì)約12 mg的溶液。

1.5供試品溶液的制備 取F-Ⅷ樣品適量，精密加入注射用水1 mL，混勻，供試品溶液濃度為2.8～6.0 mg·mL-1。4 ℃靜置過(guò)夜，注入液相色譜-多角度激光光散射檢測(cè)儀測(cè)定分子量。

2 結(jié)果

2.1準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)和精密度實(shí)驗(yàn) 取血清白蛋白對(duì)照品溶液，按“1.3”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣 20 μL。按上述條件測(cè)定，Astra軟件自動(dòng)計(jì)算分子量，供試品的分子量為6.588×104(n=6)。人血白蛋白的分子量6.646×104，所測(cè)結(jié)果與實(shí)際值差異較小，為0.87%，表明準(zhǔn)確度好。6次人血白蛋白對(duì)照品溶液分子量測(cè)定結(jié)果RSD值為2.26%，表明精密度良好。

2.2重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取一批企業(yè)A產(chǎn)品(批號(hào)：20200308)，按上述方法操作，重復(fù)6次。6次的4個(gè)峰保留時(shí)間分別約為10.6，11.5，13.2，14.3 min，計(jì)算其RSD值依次為0.810%，1.147%，0.876%，0.668%。4個(gè)組分對(duì)應(yīng)分子量RSD值依次為0.687%，1.579%，1.790%，1.781%，表明該方法的重復(fù)性良好[9]。

2.3人凝血因子Ⅷ的分子量及其分布測(cè)定 取“1.5”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，獲取色譜圖，并通過(guò) Astra軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。樣品分子典型圖譜見(jiàn)圖1，結(jié)果顯示，在溶液狀態(tài)(自然狀態(tài))下，3家企業(yè)的人凝血因子Ⅷ產(chǎn)品均由4個(gè)組分組成，按照分子從大到小，命名為組分1，2，3，4，其對(duì)應(yīng)的分子量分別約為7.831×106(±3.301%)、5.283×105(±2.393%)、2.544×105(±1.671%)、2.023×105(±2.534%)，對(duì)應(yīng)保留時(shí)間依次約為10.6，11.5，13.2，14.3 min。此外，不同企業(yè)的4個(gè)組分含量不一致，其對(duì)應(yīng)組分平均值依次為企業(yè)A：25.3%，22.4%，27.8%，24.6%；企業(yè)B：23.9%，30.1%，24.9%，21.1%；企業(yè)C：23.4%，35.7%，25.2%，15.8%，各組分占比信息詳情可見(jiàn)表1。F-Ⅷ的重均分子量(Mw)、數(shù)均分子量(Mn)及分布系數(shù)(Mw/Mn)等分子量及其分布信息結(jié)果見(jiàn)表2。

A、B、C分別為企業(yè)A、企業(yè)B和企業(yè)C的人凝血因子Ⅷ的色譜圖；1，2，3，4分別為人凝血因子Ⅷ的組分1、組分2、組分3和組分4。圖1 不同企業(yè)人凝血因子Ⅷ的典型HPSEC -MALLS圖A，B，and C are chromatograms of F-Ⅷ from enterprise A, B and C, respectively；1，2，3 and 4 are component 1，component 2，component 3 and component 4 of F-Ⅷ，respectively.Fig.1 Typical HPSEC -MALLS diagram of F-Ⅷ products from different enterprises

表1 不同企業(yè)生產(chǎn)的F-Ⅷ的組分占比 Tab.1 Proportion of each component in F-Ⅷ produced by different enterprises %

表2 不同企業(yè)F-Ⅷ中各組分的分子量及分布信息 Tab.2 Molecular weight and distribution information of each component in F-Ⅷ from different enterprises

續(xù)表2 不同企業(yè)F-Ⅷ中各組分的分子量及分布信息 Tab.2 Molecular weight and distribution information of each component in F-Ⅷ from different enterprises

3 討論

3.1樣品濃度的選擇 多角度激光光散射的散射光色譜信號(hào)激光信號(hào)強(qiáng)度和示差折光檢測(cè)器信號(hào)RI可以直接計(jì)算色譜信號(hào)上每一點(diǎn)的分子量[9]。一般情況下，最佳進(jìn)樣濃度是為了保證進(jìn)樣的蛋白質(zhì)含量不會(huì)超出凝膠色譜柱的負(fù)荷。本實(shí)驗(yàn)樣品溶液的濃度(2.8～6.0 mg·mL-1)進(jìn)入系統(tǒng)，經(jīng)強(qiáng)度正比于分子量、濃度、折光指數(shù)增量(dn/dc)的平方以及角度函數(shù)P(theta)。HPSEC -MALLS中得到的過(guò)凝膠色譜柱分離，色譜圖上每一點(diǎn)(組分)滿足稀溶液需求，因此，濃度效應(yīng)可以忽略。此外，黏度與流動(dòng)相幾乎無(wú)差異(稀溶液)。樣品測(cè)試前，系統(tǒng)使用血清白蛋白作為對(duì)照品，其結(jié)果符合±5%測(cè)試誤差需求，系統(tǒng)性能正常，以保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.2流動(dòng)相選擇 分子排阻法使用的流動(dòng)相通常為水溶液或緩沖溶液[10]，溶液的pH值一般為2～8。根據(jù)F-Ⅷ的溶解性及主要成分為蛋白類(lèi)組分，本次考察了pH值6.86磷酸鹽緩沖液、0.7% 硫酸鈉溶液、0.9%氯化鈉溶液、純化水為流動(dòng)相，分離效果均一般。最終選擇《中華人民共和國(guó)藥典》2020 年版通則3121“人血白蛋白多聚體測(cè)定法”中的流動(dòng)相進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[11]，結(jié)果表明，以0.5 mol·L-1NaH2PO4·2H2O 200 mL、0.5 mol·L-1Na2HPO4·2H2O 420 mL、異丙醇15.5 mL、超純水914.5 mL為流動(dòng)相，供試品中各組分色譜分離圖效果較好。

3.3色譜柱考察 考察了TSK GEL G2000 SWXL(7.8 mm×300 mm，5 μm)、TSK GEL G3000 SWXL(7.8 mm×300 mm，5 μm)、 TSK GEL G3000 SW(600 mm×7.5 mm，10 μm)、TSK GEL G4000 SWXL(7.8 mm×300 mm，8 μm)等4種規(guī)格的色譜柱對(duì)產(chǎn)品溶液分離度的影響。結(jié)果表明，采用TSK GEL G3000 SWXL(7.8 mm×300 mm，5 μm)色譜柱時(shí)，供試品中各組分色譜圖分離效果較好。因此，本研究選取 TSK GEL G3000 SWXL色譜柱測(cè)定F-Ⅷ分子量及其分布。

3.4F-Ⅷ組分分析 血漿來(lái)源的F-Ⅷ產(chǎn)品由兩部分組成，即F-Ⅷ和人血管性血友病因子(von willebrand factor，vWF)[1，3]。F-Ⅷ與vWF在血漿中形成復(fù)合物，vWF是作為F-Ⅷ的載體蛋白在凝血過(guò)程中發(fā)揮穩(wěn)定F-Ⅷ作用。F-Ⅷ的分子量約為3.0×105，vWF分子量約為2.2×105[1，12]。大部分F-Ⅷ易被蛋白酶裂解，形成兩條單鏈，即一條輕鏈(A3-C1-C2)和一條重鏈(A1-A2和長(zhǎng)度不定的B區(qū)組成)，重鏈分子量約2.0×105，輕鏈分子量約8×104[2-3]。對(duì)產(chǎn)品各蛋白質(zhì)組分進(jìn)行初步推測(cè)結(jié)果為：①組分1為F-Ⅷ和vWF形成的復(fù)合物的多聚體；②組分2可能為F-Ⅷ與vWF形成的復(fù)合物單體；③組分3為F-Ⅷ重鏈；④組分4為F-Ⅷ輕鏈的寡聚物。

3.5不同企業(yè)間產(chǎn)品的差異分析 F-Ⅷ-vWF復(fù)合物多聚物由于活性位點(diǎn)被掩蓋，失去了凝血活性，F(xiàn)-Ⅷ的重鏈和輕鏈容易降解，因此，F(xiàn)-Ⅷ-vWF復(fù)合物單體是人凝血因子Ⅷ的主要活性成分[2]。本研究對(duì)不同的蛋白質(zhì)組分含量進(jìn)行了測(cè)定，3家生產(chǎn)企業(yè)的各蛋白質(zhì)組分占比主要體現(xiàn)在活性成分組分2(F-Ⅷ-vWF)的差異。3家企業(yè)產(chǎn)品的比活性結(jié)果顯示：企業(yè)C最高，為約100 U·mg-1蛋白質(zhì)；企業(yè)B為約60 U·mg-1；企業(yè)A最低，為約40 U·mg-1。這與組分2占比差異一致，提示組分2的含量與臨床有效性正相關(guān)。

3家企業(yè)組分1含量無(wú)顯著差異。組分2差異的原因是F-Ⅷ降解產(chǎn)物組分3和組分4的差異，即產(chǎn)品越穩(wěn)定，其活性也越高。將不同企業(yè)的處方工藝與組分結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，初步推斷出影響產(chǎn)品穩(wěn)定性的原因：①S/D滅活時(shí)間較長(zhǎng)可能會(huì)加速F-Ⅷ的降解，企業(yè)A滅活時(shí)間最長(zhǎng)，其組分2含量也最低；②在產(chǎn)品質(zhì)添加適量的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑，如聚山梨酯80，能提高溶液穩(wěn)定性，企業(yè)B的處方中添加了聚山梨酯80，其組分2含量也較高；③該品種為凍干制品，凍干過(guò)程中添加的較多的甘氨酸保護(hù)劑能提高產(chǎn)品穩(wěn)定性，企業(yè)C甘氨酸添加量為12 g·L-1，而企業(yè)A、B均為7 g·L-1。

綜上所述，本文建立的方法可用于F-Ⅷ分子量及其分布的測(cè)定，并能對(duì)不同企業(yè)的產(chǎn)品進(jìn)行區(qū)分，為產(chǎn)品的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供技術(shù)支持。不同企業(yè)的F-Ⅷ產(chǎn)品均由4個(gè)組分組成，企業(yè)間產(chǎn)品的差異體現(xiàn)在組分2含量不同。通過(guò)對(duì)不同企業(yè)處方及工藝的比較分析，病毒滅活時(shí)間和穩(wěn)定劑的選擇會(huì)影響產(chǎn)品組分2的含量。本文建立的方法可用于F-Ⅷ分子量及其分布的測(cè)定，并能對(duì)不同企業(yè)的產(chǎn)品進(jìn)行區(qū)分，為產(chǎn)品的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供技術(shù)參考。