王皓南，王文晞，郭江紅，姜紅，

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，武漢 430065；2.湖北省藥品監(jiān)督檢驗研究院，武漢 430075)

人凝血因子Ⅷ(human coagulation factor Ⅷ，F(xiàn)-Ⅷ)是人體內(nèi)源性凝血途徑的主要成分。血液中F-Ⅷ缺乏會導(dǎo)致不同程度的凝血功能障礙，即甲型血友病[1]。F-Ⅷ是所有血漿凝血因子中含量最低者，血漿內(nèi)含量為0.1 mg·L-1，等電點約為4.3，以單鏈形式合成[2-3]。由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜且分子量大，致使 F-Ⅷ很不穩(wěn)定，在原料血漿收集以及提取制備過程中容易降解失活。不同企業(yè)采用工藝不同，F(xiàn)-Ⅷ提取純化工藝、藥品的包裝儲存以及輸液方式也可影響其凝血活性，致使人凝血因子Ⅷ產(chǎn)品間的質(zhì)量可能存在差異。

分子量是蛋白質(zhì)的最基本性質(zhì)，是蛋白質(zhì)分析鑒定的重要依據(jù)。因此，測定分子量及其分布對于F-Ⅷ產(chǎn)品的質(zhì)量控制和質(zhì)量評價有重要意義。多角度激光光散射儀能夠測定生物大分子的絕對分子量[4-7]，同時，無需標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)校正，并獲得樣品分子量分布和樣品構(gòu)象信息。筆者未見用此項技術(shù)測定F-Ⅷ分子量及其分布的相關(guān)文獻報道。本文以不同企業(yè)(A、B、C)的F-Ⅷ產(chǎn)品為研究對象，建立了高效分子排阻色譜-多角度激光光散射法(high performance molecular exclusion chromatography-multi angle laser light scatter，HPSEC -MALLS)測定F-Ⅷ產(chǎn)品分子量及其分布的方法，并對不同企業(yè)產(chǎn)品的測定結(jié)果進行比較。

1 材料與方法

1.1儀器 Waters e2695-2414液相系統(tǒng)(沃特世科技有限公司)，Wyatt Heleos Ⅱ多角度激光光散射檢測器(美國懷雅特技術(shù)公司)，AUW220D 電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司，感量：0.1 mg)，TSK gel G3000SWXL(7.8 mm×300mm，5 μm)凝膠柱(日本東曹株式會社)，Waters2414 示差折光檢測器(沃特世科技有限公司)，Astra軟件。

1.2試藥 血清白蛋白(中國食品藥品檢定研究院，批號：140619-201723，每支21.8 mg)；F-Ⅷ(企業(yè)A，規(guī)格：每瓶200 U，批號：20190825，20190826，20190932，20190934，20200308；企業(yè)B，規(guī)格：每瓶300 U，批號：20190402，20190507，20190608，20190609，20190713；企業(yè)C，規(guī)格：每瓶200 U，批號：20201102，20210103，20210402。共13批)；二水磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)、二水磷酸氫二鈉(Na2HPO4·2H2O)、異丙醇(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，其他試劑均為色譜純，水為超純水。

1.3色譜條件 流動相：0.5 mol·L-1NaH2PO4·2H2O 200 mL，0.5 mol·L-1Na2HPO4.2H2O 420 mL，異丙醇15.5 mL，超純水914.5 mL(混勻后用孔徑0.45 μm水溶性膜濾過并超聲脫氣)；流速：0.6 mL· min-1，進樣量20 μL，柱溫30 ℃，示差溫度：30 ℃，dn/dc值：0.185[8]。

1.4對照品溶液的制備 將血清白蛋白用流動相稀釋成每毫升含蛋白質(zhì)約12 mg的溶液。

1.5供試品溶液的制備 取F-Ⅷ樣品適量，精密加入注射用水1 mL，混勻，供試品溶液濃度為2.8～6.0 mg·mL-1。4 ℃靜置過夜，注入液相色譜-多角度激光光散射檢測儀測定分子量。

2 結(jié)果

2.1準(zhǔn)確度實驗和精密度實驗 取血清白蛋白對照品溶液，按“1.3”項色譜條件連續(xù)進樣6次，每次進樣 20 μL。按上述條件測定，Astra軟件自動計算分子量，供試品的分子量為6.588×104(n=6)。人血白蛋白的分子量6.646×104，所測結(jié)果與實際值差異較小，為0.87%，表明準(zhǔn)確度好。6次人血白蛋白對照品溶液分子量測定結(jié)果RSD值為2.26%，表明精密度良好。

2.2重復(fù)性實驗 取一批企業(yè)A產(chǎn)品(批號：20200308)，按上述方法操作，重復(fù)6次。6次的4個峰保留時間分別約為10.6，11.5，13.2，14.3 min，計算其RSD值依次為0.810%，1.147%，0.876%，0.668%。4個組分對應(yīng)分子量RSD值依次為0.687%，1.579%，1.790%，1.781%，表明該方法的重復(fù)性良好[9]。

2.3人凝血因子Ⅷ的分子量及其分布測定 取“1.5”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，獲取色譜圖，并通過 Astra軟件進行數(shù)據(jù)處理。樣品分子典型圖譜見圖1，結(jié)果顯示，在溶液狀態(tài)(自然狀態(tài))下，3家企業(yè)的人凝血因子Ⅷ產(chǎn)品均由4個組分組成，按照分子從大到小，命名為組分1，2，3，4，其對應(yīng)的分子量分別約為7.831×106(±3.301%)、5.283×105(±2.393%)、2.544×105(±1.671%)、2.023×105(±2.534%)，對應(yīng)保留時間依次約為10.6，11.5，13.2，14.3 min。此外，不同企業(yè)的4個組分含量不一致，其對應(yīng)組分平均值依次為企業(yè)A：25.3%，22.4%，27.8%，24.6%；企業(yè)B：23.9%，30.1%，24.9%，21.1%；企業(yè)C：23.4%，35.7%，25.2%，15.8%，各組分占比信息詳情可見表1。F-Ⅷ的重均分子量(Mw)、數(shù)均分子量(Mn)及分布系數(shù)(Mw/Mn)等分子量及其分布信息結(jié)果見表2。

A、B、C分別為企業(yè)A、企業(yè)B和企業(yè)C的人凝血因子Ⅷ的色譜圖；1，2，3，4分別為人凝血因子Ⅷ的組分1、組分2、組分3和組分4。圖1 不同企業(yè)人凝血因子Ⅷ的典型HPSEC -MALLS圖A，B，and C are chromatograms of F-Ⅷ from enterprise A, B and C, respectively；1，2，3 and 4 are component 1，component 2，component 3 and component 4 of F-Ⅷ，respectively.Fig.1 Typical HPSEC -MALLS diagram of F-Ⅷ products from different enterprises

表1 不同企業(yè)生產(chǎn)的F-Ⅷ的組分占比 Tab.1 Proportion of each component in F-Ⅷ produced by different enterprises %

表2 不同企業(yè)F-Ⅷ中各組分的分子量及分布信息 Tab.2 Molecular weight and distribution information of each component in F-Ⅷ from different enterprises

續(xù)表2 不同企業(yè)F-Ⅷ中各組分的分子量及分布信息 Tab.2 Molecular weight and distribution information of each component in F-Ⅷ from different enterprises

3 討論

3.1樣品濃度的選擇 多角度激光光散射的散射光色譜信號激光信號強度和示差折光檢測器信號RI可以直接計算色譜信號上每一點的分子量[9]。一般情況下，最佳進樣濃度是為了保證進樣的蛋白質(zhì)含量不會超出凝膠色譜柱的負荷。本實驗樣品溶液的濃度(2.8～6.0 mg·mL-1)進入系統(tǒng)，經(jīng)強度正比于分子量、濃度、折光指數(shù)增量(dn/dc)的平方以及角度函數(shù)P(theta)。HPSEC -MALLS中得到的過凝膠色譜柱分離，色譜圖上每一點(組分)滿足稀溶液需求，因此，濃度效應(yīng)可以忽略。此外，黏度與流動相幾乎無差異(稀溶液)。樣品測試前，系統(tǒng)使用血清白蛋白作為對照品，其結(jié)果符合±5%測試誤差需求，系統(tǒng)性能正常，以保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.2流動相選擇 分子排阻法使用的流動相通常為水溶液或緩沖溶液[10]，溶液的pH值一般為2～8。根據(jù)F-Ⅷ的溶解性及主要成分為蛋白類組分，本次考察了pH值6.86磷酸鹽緩沖液、0.7% 硫酸鈉溶液、0.9%氯化鈉溶液、純化水為流動相，分離效果均一般。最終選擇《中華人民共和國藥典》2020 年版通則3121“人血白蛋白多聚體測定法”中的流動相進行實驗[11]，結(jié)果表明，以0.5 mol·L-1NaH2PO4·2H2O 200 mL、0.5 mol·L-1Na2HPO4·2H2O 420 mL、異丙醇15.5 mL、超純水914.5 mL為流動相，供試品中各組分色譜分離圖效果較好。

3.3色譜柱考察 考察了TSK GEL G2000 SWXL(7.8 mm×300 mm，5 μm)、TSK GEL G3000 SWXL(7.8 mm×300 mm，5 μm)、 TSK GEL G3000 SW(600 mm×7.5 mm，10 μm)、TSK GEL G4000 SWXL(7.8 mm×300 mm，8 μm)等4種規(guī)格的色譜柱對產(chǎn)品溶液分離度的影響。結(jié)果表明，采用TSK GEL G3000 SWXL(7.8 mm×300 mm，5 μm)色譜柱時，供試品中各組分色譜圖分離效果較好。因此，本研究選取 TSK GEL G3000 SWXL色譜柱測定F-Ⅷ分子量及其分布。

3.4F-Ⅷ組分分析 血漿來源的F-Ⅷ產(chǎn)品由兩部分組成，即F-Ⅷ和人血管性血友病因子(von willebrand factor，vWF)[1，3]。F-Ⅷ與vWF在血漿中形成復(fù)合物，vWF是作為F-Ⅷ的載體蛋白在凝血過程中發(fā)揮穩(wěn)定F-Ⅷ作用。F-Ⅷ的分子量約為3.0×105，vWF分子量約為2.2×105[1，12]。大部分F-Ⅷ易被蛋白酶裂解，形成兩條單鏈，即一條輕鏈(A3-C1-C2)和一條重鏈(A1-A2和長度不定的B區(qū)組成)，重鏈分子量約2.0×105，輕鏈分子量約8×104[2-3]。對產(chǎn)品各蛋白質(zhì)組分進行初步推測結(jié)果為：①組分1為F-Ⅷ和vWF形成的復(fù)合物的多聚體；②組分2可能為F-Ⅷ與vWF形成的復(fù)合物單體；③組分3為F-Ⅷ重鏈；④組分4為F-Ⅷ輕鏈的寡聚物。

3.5不同企業(yè)間產(chǎn)品的差異分析 F-Ⅷ-vWF復(fù)合物多聚物由于活性位點被掩蓋，失去了凝血活性，F(xiàn)-Ⅷ的重鏈和輕鏈容易降解，因此，F(xiàn)-Ⅷ-vWF復(fù)合物單體是人凝血因子Ⅷ的主要活性成分[2]。本研究對不同的蛋白質(zhì)組分含量進行了測定，3家生產(chǎn)企業(yè)的各蛋白質(zhì)組分占比主要體現(xiàn)在活性成分組分2(F-Ⅷ-vWF)的差異。3家企業(yè)產(chǎn)品的比活性結(jié)果顯示：企業(yè)C最高，為約100 U·mg-1蛋白質(zhì)；企業(yè)B為約60 U·mg-1；企業(yè)A最低，為約40 U·mg-1。這與組分2占比差異一致，提示組分2的含量與臨床有效性正相關(guān)。

3家企業(yè)組分1含量無顯著差異。組分2差異的原因是F-Ⅷ降解產(chǎn)物組分3和組分4的差異，即產(chǎn)品越穩(wěn)定，其活性也越高。將不同企業(yè)的處方工藝與組分結(jié)果進行比對分析，初步推斷出影響產(chǎn)品穩(wěn)定性的原因：①S/D滅活時間較長可能會加速F-Ⅷ的降解，企業(yè)A滅活時間最長，其組分2含量也最低；②在產(chǎn)品質(zhì)添加適量的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑，如聚山梨酯80，能提高溶液穩(wěn)定性，企業(yè)B的處方中添加了聚山梨酯80，其組分2含量也較高；③該品種為凍干制品，凍干過程中添加的較多的甘氨酸保護劑能提高產(chǎn)品穩(wěn)定性，企業(yè)C甘氨酸添加量為12 g·L-1，而企業(yè)A、B均為7 g·L-1。

綜上所述，本文建立的方法可用于F-Ⅷ分子量及其分布的測定，并能對不同企業(yè)的產(chǎn)品進行區(qū)分，為產(chǎn)品的質(zhì)量評價提供技術(shù)支持。不同企業(yè)的F-Ⅷ產(chǎn)品均由4個組分組成，企業(yè)間產(chǎn)品的差異體現(xiàn)在組分2含量不同。通過對不同企業(yè)處方及工藝的比較分析，病毒滅活時間和穩(wěn)定劑的選擇會影響產(chǎn)品組分2的含量。本文建立的方法可用于F-Ⅷ分子量及其分布的測定，并能對不同企業(yè)的產(chǎn)品進行區(qū)分，為產(chǎn)品的質(zhì)量評價提供技術(shù)參考。