劉琪文，陳婷，安琪，楊世穎，楊德智，呂揚(yáng)，杜冠華

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院、中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所1.晶型藥物研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.藥物靶點(diǎn)研究與新藥篩選北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050)

白樺脂醇(betulin)又名白樺酯醇、樺木醇、樺木腦，是從白樺樹皮中提取的一種五環(huán)三萜類化合物，分子式為C30H50O2，分子量為442.38。白樺脂醇具有廣泛的藥理作用，如降血糖、抗炎、抑菌及抗癌等[1-5]，但水溶性差，生物利用度低，限制了其進(jìn)一步研究與臨床應(yīng)用。固體化學(xué)藥物存在多晶型現(xiàn)象，同種物質(zhì)的不同晶型由于排列方式和排列規(guī)律不同，其理化性質(zhì)、生物利用度和藥理性質(zhì)等可能不同[6]。通過對(duì)固體化學(xué)藥物進(jìn)行多晶型研究，可發(fā)現(xiàn)藥物的不同晶型，從而探究穩(wěn)定性較好、生物利用度高且安全有效的優(yōu)勢(shì)藥物晶型[7]。白樺脂醇已有11種溶劑合物[8-11]和1種白樺脂醇半水合物報(bào)道[12]。本課題組在中國(guó)專利CN109988215A中公布了白樺脂醇晶B型[13]，專利CN109988214A中公布了白樺脂醇晶C型[14]，專利CN109988216A中公布了白樺脂醇晶D型[15]。通過對(duì)市售的白樺脂醇進(jìn)行粉末X射線衍射法(powder X-ray diffraction，PXRD)表征，發(fā)現(xiàn)其PXRD圖譜與已報(bào)道白樺脂醇的多晶型圖譜不一致，故將其命名為晶A型。在本研究中，采用晶A型作為起始晶型，研究白樺脂醇的3種無溶劑的晶B型、晶C型、晶D型制備方法。在此基礎(chǔ)上，對(duì)4種晶型進(jìn)行差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry，DSC)、熱重法(thermogravimetry，TG)、PXRD表征以及溶解度、穩(wěn)定性的評(píng)價(jià)研究工作。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑與試藥 白樺脂醇購(gòu)自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司(含量>99%)；高效液相色譜法(HPLC)使用的溶劑為色譜純，購(gòu)自美國(guó)Fisher公司；其他試劑均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為純凈水。

1.1.2儀器 差示掃描量熱儀(DSC1型，瑞士Mettler Toledo公司)；熱重分析儀(TGA/DSC1型，瑞士Mettler Toledo 公司)；粉末X射線衍射儀(Rigaku D/max-2550，日本理學(xué) Rigaku 公司)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9035A，上海一恒科技有限公司)；溶出實(shí)驗(yàn)儀(RC12AD型，天大天發(fā)有限公司，配 RZQ-12D 取樣收集系統(tǒng))；高效液相色譜儀(Agilent 1200，美國(guó)Agilent 公司，配 DAD檢測(cè)器)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1多晶型制備 依據(jù)白樺脂醇晶A型的DSC圖譜，分別選擇160，220 ℃作為多晶型篩選及制備的溫度。取白樺脂醇原料藥適量，將其置于160 ℃的干燥箱中，加熱后得到無溶劑的晶B型；將晶B型置于220 ℃的干燥箱中，加熱后得到晶C型；晶C型可通過加熱熔融或者研磨法得到晶D型。

1.2.2DSC分析與TG分析 DSC分析：精密稱取樣品3～5 mg，置于40 μL標(biāo)準(zhǔn)帶蓋鋁坩堝中，用空鋁坩堝做參比，在大氣氣氛下設(shè)置升溫速率為10 ℃·min-1，采用STARe數(shù)據(jù)處理軟件處理圖譜。

TG分析：精密稱取樣品3～5 mg，置于氧化鋁坩堝(6.0 mm×4.5 mm)中，在50 mL·min-1的氮?dú)獗Ｗo(hù)下設(shè)置升溫速率為10 ℃·min-1，掃描范圍：30～500 ℃，采用STARe數(shù)據(jù)處理軟件處理圖譜。

1.2.3PXRD分析 使用粉末X射線衍射儀對(duì)白樺脂醇4種晶型以及穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)樣品進(jìn)行PXRD表征，實(shí)驗(yàn)條件：CuKα輻射，λ=1.541 84?，管壓40 kV，管流150 mA，2θ掃描范圍在3°～80°，步長(zhǎng)0.02°，掃描速度為8°·min-1。

1.2.4穩(wěn)定性考察 按穩(wěn)定性考察要求，稱取白樺脂醇4種晶型樣品各50 mg，置于培養(yǎng)皿中，每個(gè)樣品3份，分別置于高溫[(60±1 ) ℃] 、高濕[(90±5)%，25 ℃]、光照[(4500±500) lx，25 ℃]條件下，并于第0天、第5天和第10天取樣。利用PXRD測(cè)定第5天、第10天的樣品，掃描范圍為3°～80°，并與原始數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，作為考察4種晶型穩(wěn)定性的依據(jù)。

1.2.5溶解性評(píng)價(jià) 采用HPLC法對(duì)白樺脂醇4種晶型進(jìn)行溶解度考察實(shí)驗(yàn)。HPLC實(shí)驗(yàn)條件為：色譜柱：Agilent Eclipse XDB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動(dòng)相：乙腈：水(V：V)=90：10。流速：1.0 mL·min-1，柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：10 μL。檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm。

2 結(jié)果

2.1DSC與TG測(cè)定結(jié)果 在程序控溫下，DSC可測(cè)量物質(zhì)的能量與溫度變化的關(guān)系，TG可檢測(cè)物質(zhì)的質(zhì)量與溫度變化的關(guān)系[16]。相同物質(zhì)的不同晶型的熱力學(xué)行為一般不同，可通過DSC和TG進(jìn)行測(cè)定，綜合分析后區(qū)分不同晶型。

在白樺脂醇晶A型的DSC圖譜中存在3個(gè)吸熱峰，其中前兩個(gè)吸熱峰峰形較寬，峰值溫度(PEAK)值分別為95.9，203.3 ℃；第3個(gè)吸熱峰較尖銳，PEAK值為260.5 ℃(圖1)。晶A型的TG圖譜(圖2)顯示，在50～150 ℃范圍內(nèi)存在一個(gè)0.67%的失重臺(tái)階，該范圍與其DSC圖譜中第1個(gè)吸熱峰的溫度(95.9 ℃)對(duì)應(yīng)，從而確定白樺脂醇晶A型含有少量溶劑且其DSC的第1個(gè)吸熱峰為溶劑峰。

將白樺脂醇晶A型置于160 ℃(其第1個(gè)吸熱峰95.9 ℃和第2個(gè)吸熱峰203.3 ℃溫度之間)干燥箱中加熱去溶劑，得到晶B型。晶B型DSC圖譜中含有2個(gè)吸熱峰，其PEAK值分別為204.1，260.3 ℃；其TG圖(圖2)只有一個(gè)失重臺(tái)階，為不含溶劑的白樺脂醇。故推斷晶B型的DSC圖譜中第1個(gè)吸熱峰(204.1 ℃)為轉(zhuǎn)晶點(diǎn)，第2個(gè)吸熱峰(260.3 ℃)為熔融過程。選擇在220 ℃時(shí)將晶B型加熱，獲得了晶C型。晶C型的DSC圖譜中只含1個(gè)尖銳的吸熱峰，其峰值為260.0 ℃；其TG圖(圖2)只有一個(gè)失重臺(tái)階，為不含溶劑的白樺脂醇。將晶C型加熱熔融或者研磨可得白樺脂醇的無定型晶D型。晶D型的DSC圖譜中存在3個(gè)放熱峰和1個(gè)吸熱峰，3個(gè)放熱峰的峰值分別為109.0，137.4和197.1 ℃，最終在260.3 ℃吸熱熔融。白樺脂醇晶D型的TG圖(圖2)只有一個(gè)失重臺(tái)階，為不含溶劑的白樺脂醇。白樺脂醇4種晶型的DSC圖譜及數(shù)據(jù)見圖1、表1，4種晶型的TG圖譜及數(shù)據(jù)見圖2、表2。

圖1 白樺脂醇4種晶型的DSC圖譜 Fig.1 DSC patterns of four crystal forms of betulin

圖2 白樺脂醇4種晶型的TG圖譜 Fig.2 TG patterns of four crystal forms of betulin

表1 白樺脂醇4種晶型的DSC數(shù)據(jù) Tab.1 DSC data of four crystal forms of betulin

表2 白樺脂醇4種晶型的TG數(shù)據(jù) Tab.2 TG data of four crystal forms of betulin

2.2PXRD分析 PXRD是定性和定量研究藥物多晶型的重要方法[17]，同種物質(zhì)不同晶型的粉末圖譜會(huì)有不同位置和強(qiáng)度的衍射峰。將白樺脂醇4種晶型的實(shí)驗(yàn)粉末圖進(jìn)行比較，結(jié)果見圖3所示。由圖3可知，與晶A型相比，晶C型衍射峰較為尖銳，且衍射峰位置增加、強(qiáng)度發(fā)生變化，與晶A型存在較大差異，為新晶型；晶D型為無定型，僅存在一個(gè)彌散衍射峰；晶B型與晶A型粉末圖相比，粉末峰變尖銳但差異不明顯，需結(jié)合其他表征手段加以區(qū)分。

圖3 白樺脂醇4種晶型的PXRD圖譜 Fig.3 PXRD patterns of four crystal forms of betulin

2.3穩(wěn)定性評(píng)價(jià) 將白樺脂醇4種晶型樣品放置于高濕、高溫、光照條件下，分別于5，10 d后取出，通過PXRD表征以判斷4種晶型的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，晶A型、晶B型、晶C型及晶D型均可以穩(wěn)定存在，為白樺脂醇的穩(wěn)定晶型。

2.4溶解度評(píng)價(jià) 采用HPLC對(duì)白樺脂醇4種晶型的溶解度進(jìn)行測(cè)定，由于白樺脂醇屬于難溶性藥物，在水、pH值6.8磷酸緩沖液、0.9%鹽酸中均不溶解(未檢測(cè)到白樺脂醇)，故使用0.5%十二烷基硫酸鈉溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，增加白樺脂醇的溶解度，以對(duì)白樺脂醇不同晶型的溶解度進(jìn)行區(qū)分。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，白樺脂醇的溶解度為縱坐標(biāo)繪制溶解度曲線(圖4)。結(jié)果表明，在0.5%十二烷基硫酸鈉溶液中，晶A型溶解度最差，新獲得的3種晶型溶解性和溶解性質(zhì)都有提高。其中，晶D型具有最明顯的溶解性優(yōu)勢(shì)，溶解速率最快，溶解度最好；晶B型與晶C型相似，溶解速率雖不及晶D型，但均優(yōu)于晶A型。結(jié)合4種晶型的穩(wěn)定性性質(zhì)，確定晶D型為優(yōu)勢(shì)藥用晶型。

圖4 白樺脂醇4種晶型在0.5%十二烷基硫酸鈉溶液中的溶出曲線 Fig.4 Dissolution curves of four crystal forms of betulin in 0.5% SDS

3 討論

本研究通過對(duì)白樺脂醇晶A型的熱力學(xué)行為進(jìn)行分析，采用加熱法和研磨法對(duì)白樺脂醇進(jìn)行多晶型篩查，最終得到3種不含溶劑的晶型，即晶B型、晶C型、晶D型。其中晶D型在0.5%十二烷基硫酸鈉中溶解性最好，且在穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)考察條件下可以保持無定型狀態(tài)，故將晶D型確定為白樺脂醇的優(yōu)勢(shì)藥用晶型。本研究基于對(duì)藥物的熱力學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析后進(jìn)行多晶型篩查，相比于傳統(tǒng)篩查方式，本方法更具有目標(biāo)性，提高了晶型篩查效率，縮短藥物多晶型篩查的研究周期，可以加快藥物多晶型研究和藥用開發(fā)。