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        藥品中需氧菌總數(shù)計數(shù)能力驗證結(jié)果分析

        2022-04-27 02:15:30張煜琳李哲王建聲杜彥輝
        藥品評價 2022年3期
        關(guān)鍵詞:實驗室實驗檢測

        張煜琳,李哲,王建聲,杜彥輝

        1.慶陽市藥品檢驗檢測中心,甘肅 慶陽 745000;2.慶陽市食品檢驗檢測中心,甘肅 慶陽 745000

        藥品檢驗檢測能力驗證是藥品質(zhì)量技術(shù)監(jiān)管的重要手段,推動實施藥品檢驗檢測技術(shù)能力持續(xù)有效提升,更加體現(xiàn)權(quán)威性、可靠性、公正性,是藥品檢驗檢測工作高質(zhì)量發(fā)展的永恒課題。本實驗組人員參加了2021 年由上海市食品藥品檢驗研究院負(fù)責(zé)實施的“NIFDC-PT-340 藥品中需氧菌總數(shù)計數(shù)能力驗證”,按照預(yù)先制定的實驗方案和作業(yè)指導(dǎo)書,對3 份未知樣品進(jìn)行檢測,結(jié)果為滿意。本研究以此為契機(jī),準(zhǔn)確考量影響實驗結(jié)果的人員、試劑、設(shè)施、環(huán)境等關(guān)鍵因素,全面回顧梳理實驗過程,對比分析全國實驗室數(shù)據(jù),重點總結(jié)本次實驗結(jié)果,為健全完善微生物檢驗內(nèi)部質(zhì)量控制管理體系[1-3]提供理論和實踐參考。

        1 實驗材料與試劑

        1.1 樣品

        樣品來源于上海市食品藥品檢驗研究院,編號QA03400502、QA03400327、QA03400657,為藥品制劑的冷凍干燥物,采用玻璃西林瓶密封包裝,瓶身貼有編號標(biāo)識。收到樣品后立即放置-20 ℃保存,并盡快檢測。

        1.2 培養(yǎng)基及耗材

        胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基,批號:20210412,海博生物;紅四氮唑(TTC),批號:20171101,天津大茂;一次性無菌培養(yǎng)皿,廣東環(huán)凱,規(guī)格:90 mm×15 mm;實驗用水均為無菌用水。

        1.3 儀器設(shè)備

        超凈工作臺(上海樹立)型號:SW-CJ-2D,生物安全柜(蘇州安泰)型號:BHC-1300IIA2,立式壓力滅菌器(山東新華)型號:LMQ.C-80E,電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海博訊)型號:HPX-9162MBE。

        2 實驗方法

        2.1 檢測方法

        按照《中國藥典》2020 版四部通則1105 非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查:微生物計數(shù)法中需氧菌總數(shù)計數(shù)平皿法[4]和NIFDC-PT-340 藥品中需氧菌總數(shù)計數(shù)能力驗證作業(yè)指導(dǎo)書的要求進(jìn)行檢測。

        2.2 操作步驟

        2.2.1 樣品前處理 首先將樣品放至室溫,用75%乙醇擦拭瓶身,待平衡后,在生物安全柜內(nèi)小心打開西林瓶蓋,向瓶內(nèi)緩緩加入10 mL 滅菌用水,蓋好瓶蓋,將樣品完全溶解且混勻,作為待測供試品10 mL,室溫放置15 min 后操作。依照此方法處理3 份樣品。

        2.2.2 樣品稀釋 用移液管吸取上述待測供試品5 mL,置裝有45 mL 的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,充分振搖,混勻,制成1∶10 的樣品。吸取1 mL 該溶液置9 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,制成1∶100 的樣品,依次稀釋制備至1∶100 000。以此方法,處理3 份樣品。

        2.2.3 樣品培養(yǎng) 陰性對照:吸取1 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基加入到無菌培養(yǎng)皿中;樣品:從各稀釋度取1 mL 加入無菌培養(yǎng)平皿中(平行兩份)。傾注培養(yǎng)基時溫度不超過45 ℃,按反時針方向勻速旋轉(zhuǎn)平皿,注意不要將培養(yǎng)基濺到皿邊及皿蓋上,使混勻,等待凝固后,將平皿倒置在33 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi),培養(yǎng)3~5 d,觀察菌落情況。

        2.2.4 計數(shù)與報告 樣品QA03400502 平板上(1∶1 000 稀釋度)有片狀菌落且菌落之間沒有明顯界限,按1 個菌落計,樣品QA03400327 平板上(1∶100稀釋度)有2 個菌落重疊,肉眼能分辨,按2 個菌落計。其余均按平板上生長良好的菌落數(shù)計數(shù)按照《中國藥典》2020 年版四部通則及本次實驗作業(yè)指導(dǎo)書進(jìn)行報告。

        3 實驗結(jié)果與分析

        3.1 樣品檢測結(jié)果

        樣品檢測結(jié)果及報告數(shù)見表1。相同稀釋度兩個平板的菌落總數(shù)非常相近,說明試驗平行性很好,結(jié)果準(zhǔn)確。陰性對照試驗無菌落生長,說明試驗過程中無污染,試驗結(jié)果有效。對QA03400502 樣品選取1∶1 000 稀釋度進(jìn)行報送,結(jié)果3.8×104cfu/mL。對QA03400327樣品選取1∶10和1∶100 稀釋度進(jìn)行報送,結(jié)果1.6×103cfu/mL。QA03400657 樣品無菌落生長,結(jié)果按<10 cfu/mL報送。

        表1 樣品檢測結(jié)果(cfu/mL)

        3.2 能力驗證結(jié)果與分析

        本實驗室收到中國食品藥品檢定研究院能力驗證結(jié)果報告通知單,見表2。按照│z│≤2 為滿意結(jié)果,2<│z│≤3 為可疑結(jié)果,│z│>3 為不滿意結(jié)果,最終評價為三個樣品結(jié)果均滿意,則最終結(jié)果判定為“滿意”;有一個結(jié)果為“可疑”,則最終結(jié)果判定為“可疑”;有一個結(jié)果為“不滿意”,則最終結(jié)果判定為“不滿意”進(jìn)行評價。從表中得知本實驗室最終結(jié)果為滿意。雖然QA03100657 的指定值<1,而本實驗室測定的結(jié)果是<10 cfu/mL,評價結(jié)果為滿意,但為了提高樣品檢出限,以后進(jìn)行未知樣品的需氧菌總數(shù)計數(shù)檢驗時,應(yīng)對供試品原液進(jìn)行計數(shù)。

        表2 能力驗證評價表

        從中國食品藥品檢定研究院能力驗證結(jié)果計劃報告中獲悉,全國共223 家實驗室報送結(jié)果,按照每個實驗室z 值大小順序排列成柱狀圖,每個柱條對應(yīng)唯一編碼的實驗室,本單位編碼為876。從圖1、圖2 中可直觀地反映出本實驗室測定的數(shù)據(jù)趨近準(zhǔn)確值。實驗室具備很好檢測藥品中需氧菌總數(shù)計數(shù)的能力。

        圖1 樣品QA03400502能力評價統(tǒng)計圖

        圖2 樣品QA03400327能力評價統(tǒng)計圖

        3.3 需氧菌總數(shù)計數(shù)質(zhì)量控制分析

        3.3.1 實驗前的準(zhǔn)備控制 收到樣品,應(yīng)及時檢查樣品是否完好、編號是否與能力驗證平臺顯示的樣品編號一致。若樣品存在破損或污染等情況,應(yīng)及時與實施機(jī)構(gòu)聯(lián)系處理。收樣后應(yīng)立即單獨放置于-20 ℃保存,并盡快檢測。實驗用的培養(yǎng)基、吸管、毛巾、鑷子、剪刀等均需按要求滅菌,并進(jìn)行滅菌效果驗證。為了防止高壓滅菌過程中稀釋液和培養(yǎng)基量的減少及減少傳遞過程中的污染,裝培養(yǎng)基和稀釋液的每支試管和三角瓶應(yīng)用硅膠塞塞住后用牛皮紙單獨包扎。吸管在滅菌前,上端應(yīng)塞入一小段棉花,可避免外界雜菌吹入管內(nèi)或不慎將菌液吸出管外,造成污染。

        3.3.2 操作環(huán)境的控制 檢測環(huán)境不低于生產(chǎn)關(guān)鍵區(qū)環(huán)境的要求[5],所以在D 級背景下的B 級單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。并且要嚴(yán)格按照無菌操作要求進(jìn)行實驗,并做好個人安全防護(hù)。因樣品內(nèi)可能含有致病菌,所以本次實驗在生物安全柜中進(jìn)行。實驗前后要對實驗環(huán)境進(jìn)行滅菌。

        3.3.3 樣品的制備及稀釋過程控制 實驗前先將樣品放至室溫,用75%的乙醇擦拭瓶蓋后,在生物安全柜內(nèi)以無菌操作打開西林瓶,向瓶內(nèi)緩緩加入10 mL 滅菌水,將樣品完全溶解并混勻,作為待測供試品(作業(yè)指導(dǎo)書明確規(guī)定),室溫放置15 min 后再進(jìn)行后續(xù)稀釋操作。為了確保樣品稀釋的準(zhǔn)確性,用無菌吸管吸取待測供試品5 mL,置盛有45 mL 的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基錐形瓶中,充分振搖,制成1∶10 的樣品溶液。參考《中國藥典》2020 年版四部藥品中需氧菌總數(shù)的控制限度,將3 份樣品均稀釋至10-5,每個稀釋級至少制備2 個平板。樣品的制備和稀釋過程中,菌液的均勻性很重要,因此每次稀釋前后,均要在混勻器上充分混勻。混勻過程要注意控制力度,避免菌液飛濺,造成污染。為了提高樣品檢出限,應(yīng)對供試品原液進(jìn)行計數(shù)。

        3.3.4 培養(yǎng)基控制 實驗所使用培養(yǎng)基的pH 值、適用性檢查經(jīng)前期確認(rèn)[6-7],確保所使用的培養(yǎng)基性能良好。培養(yǎng)基應(yīng)臨用新配,配制后,微生物易增殖[8],應(yīng)立即滅菌。滅菌后放入45~50 ℃的水浴中保溫,避免溫度過低或過高影響實驗結(jié)果。培養(yǎng)基傾注量應(yīng)為15~20 mL,太少時在培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基會干裂,太多則容易污染,影響計數(shù)。傾注培養(yǎng)基混勻時應(yīng)注意防止混合物濺到皿邊及皿蓋上。培養(yǎng)皿應(yīng)倒置培養(yǎng),既可防止培養(yǎng)過程中水分蒸發(fā)形成的冷凝水滴落到培養(yǎng)基上造成染菌,也可防止菌落蔓延造成計數(shù)不準(zhǔn)。計數(shù)時,在瓊脂培養(yǎng)基中加入TTC,因TTC 的濃度過高會有抑菌作用[9],經(jīng)試驗,TTC 的使用濃度為0.01 g/L,即每1 000 mL 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基中加入1 mL 無菌的1% TTC 溶液。

        3.3.5 計數(shù)觀察控制 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板在培養(yǎng)2 d 后就應(yīng)進(jìn)行一次觀察計數(shù),以防菌落被覆蓋而影響計數(shù)結(jié)果。之后分別再培養(yǎng)3、4、5 d 各計數(shù)一次,查看菌落變化情況。必須注意計數(shù)應(yīng)在超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行,不要打開培養(yǎng)皿蓋子,輕拿輕放,防止自身及交叉污染。此次實驗中菌落計數(shù)時平板上有2 個菌落重疊,肉眼能分辨,按2 個菌落計。有片狀菌落且菌落之間沒有明顯界限,按1 個菌落計。

        3.3.6 廢棄物的處理控制 所有的實驗用具、含菌溶液或培養(yǎng)物均需經(jīng)過滅菌后洗滌或處理,保證生物安全,減少環(huán)境污染。

        3.3.7 結(jié)果上報控制 點計菌落數(shù)后,計算各稀釋級供試液的平均菌落數(shù),選取平均菌落數(shù)小于300 cfu的稀釋級,作為菌數(shù)報告依據(jù)。若同稀釋級兩個平板的菌落數(shù)平均值不小于15,則兩個平板的菌落數(shù)不能相差1 倍或以上。取最高的平均菌落數(shù),計算每1 mL 供試品中所含的需氧菌總數(shù),取兩位有效數(shù)字報告。若各稀釋級的平板上均無菌落生長,或僅最低稀釋級的平板上有菌落生長,但平均菌落數(shù)小于1 時,以小于1 乘以最低稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。數(shù)據(jù)上傳到能力驗證平臺時應(yīng)仔細(xì)核查校對,確保所填信息準(zhǔn)確無誤,并在截止日期前按要求上報所有數(shù)據(jù)和記錄。

        4 總結(jié)

        根據(jù)能力驗證的結(jié)果反饋情況,說明了本實驗室具備藥品中需氧菌總數(shù)計數(shù)能力測定。能力驗證已逐漸成為實驗室技術(shù)能力和管理水平的考核方法,同時也成為重要且有效的實驗室外部質(zhì)量控制評估手段。通過參加藥品中需氧菌總數(shù)計數(shù)能力驗證,分析總結(jié)檢驗過程中的控制要點,能夠提升實驗室內(nèi)部質(zhì)量控制,進(jìn)一步確保實驗室檢測結(jié)果的真實性、可靠性,同時強化政府監(jiān)管部門對實驗室水平的信任度,最終為人民用藥安全保駕護(hù)航。

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