張煜琳，李哲，王建聲，杜彥輝

1.慶陽市藥品檢驗檢測中心，甘肅 慶陽 745000；2.慶陽市食品檢驗檢測中心，甘肅 慶陽 745000

藥品檢驗檢測能力驗證是藥品質(zhì)量技術(shù)監(jiān)管的重要手段，推動實施藥品檢驗檢測技術(shù)能力持續(xù)有效提升，更加體現(xiàn)權(quán)威性、可靠性、公正性，是藥品檢驗檢測工作高質(zhì)量發(fā)展的永恒課題。本實驗組人員參加了2021 年由上海市食品藥品檢驗研究院負(fù)責(zé)實施的“NIFDC-PT-340 藥品中需氧菌總數(shù)計數(shù)能力驗證”，按照預(yù)先制定的實驗方案和作業(yè)指導(dǎo)書，對3 份未知樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果為滿意。本研究以此為契機(jī)，準(zhǔn)確考量影響實驗結(jié)果的人員、試劑、設(shè)施、環(huán)境等關(guān)鍵因素，全面回顧梳理實驗過程，對比分析全國實驗室數(shù)據(jù)，重點總結(jié)本次實驗結(jié)果，為健全完善微生物檢驗內(nèi)部質(zhì)量控制管理體系［1-3］提供理論和實踐參考。

1 實驗材料與試劑

1.1 樣品

樣品來源于上海市食品藥品檢驗研究院，編號QA03400502、QA03400327、QA03400657，為藥品制劑的冷凍干燥物，采用玻璃西林瓶密封包裝，瓶身貼有編號標(biāo)識。收到樣品后立即放置-20 ℃保存，并盡快檢測。

1.2 培養(yǎng)基及耗材

胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，批號：20210412，海博生物；紅四氮唑（TTC），批號：20171101，天津大茂；一次性無菌培養(yǎng)皿，廣東環(huán)凱，規(guī)格：90 mm×15 mm；實驗用水均為無菌用水。

1.3 儀器設(shè)備

超凈工作臺（上海樹立）型號：SW-CJ-2D，生物安全柜（蘇州安泰）型號：BHC-1300IIA2，立式壓力滅菌器（山東新華）型號：LMQ.C-80E，電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海博訊）型號：HPX-9162MBE。

2 實驗方法

2.1 檢測方法

按照《中國藥典》2020 版四部通則1105 非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法中需氧菌總數(shù)計數(shù)平皿法［4］和NIFDC-PT-340 藥品中需氧菌總數(shù)計數(shù)能力驗證作業(yè)指導(dǎo)書的要求進(jìn)行檢測。

2.2 操作步驟

2.2.1 樣品前處理 首先將樣品放至室溫，用75%乙醇擦拭瓶身，待平衡后，在生物安全柜內(nèi)小心打開西林瓶蓋，向瓶內(nèi)緩緩加入10 mL 滅菌用水，蓋好瓶蓋，將樣品完全溶解且混勻，作為待測供試品10 mL，室溫放置15 min 后操作。依照此方法處理3 份樣品。

2.2.2 樣品稀釋 用移液管吸取上述待測供試品5 mL，置裝有45 mL 的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，充分振搖，混勻，制成1∶10 的樣品。吸取1 mL 該溶液置9 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，制成1∶100 的樣品，依次稀釋制備至1∶100 000。以此方法，處理3 份樣品。

2.2.3 樣品培養(yǎng) 陰性對照：吸取1 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基加入到無菌培養(yǎng)皿中；樣品：從各稀釋度取1 mL 加入無菌培養(yǎng)平皿中（平行兩份）。傾注培養(yǎng)基時溫度不超過45 ℃，按反時針方向勻速旋轉(zhuǎn)平皿，注意不要將培養(yǎng)基濺到皿邊及皿蓋上，使混勻，等待凝固后，將平皿倒置在33 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)3～5 d，觀察菌落情況。

2.2.4 計數(shù)與報告 樣品QA03400502 平板上（1∶1 000 稀釋度）有片狀菌落且菌落之間沒有明顯界限，按1 個菌落計，樣品QA03400327 平板上（1∶100稀釋度）有2 個菌落重疊，肉眼能分辨，按2 個菌落計。其余均按平板上生長良好的菌落數(shù)計數(shù)按照《中國藥典》2020 年版四部通則及本次實驗作業(yè)指導(dǎo)書進(jìn)行報告。

3 實驗結(jié)果與分析

3.1 樣品檢測結(jié)果

樣品檢測結(jié)果及報告數(shù)見表1。相同稀釋度兩個平板的菌落總數(shù)非常相近，說明試驗平行性很好，結(jié)果準(zhǔn)確。陰性對照試驗無菌落生長，說明試驗過程中無污染，試驗結(jié)果有效。對QA03400502 樣品選取1∶1 000 稀釋度進(jìn)行報送，結(jié)果3.8×104cfu/mL。對QA03400327樣品選取1∶10和1∶100 稀釋度進(jìn)行報送，結(jié)果1.6×103cfu/mL。QA03400657 樣品無菌落生長，結(jié)果按＜10 cfu/mL報送。

表1 樣品檢測結(jié)果（cfu/mL）

3.2 能力驗證結(jié)果與分析

本實驗室收到中國食品藥品檢定研究院能力驗證結(jié)果報告通知單，見表2。按照│z│≤2 為滿意結(jié)果，2＜│z│≤3 為可疑結(jié)果，│z│＞3 為不滿意結(jié)果，最終評價為三個樣品結(jié)果均滿意，則最終結(jié)果判定為“滿意”；有一個結(jié)果為“可疑”，則最終結(jié)果判定為“可疑”；有一個結(jié)果為“不滿意”，則最終結(jié)果判定為“不滿意”進(jìn)行評價。從表中得知本實驗室最終結(jié)果為滿意。雖然QA03100657 的指定值＜1，而本實驗室測定的結(jié)果是＜10 cfu/mL，評價結(jié)果為滿意，但為了提高樣品檢出限，以后進(jìn)行未知樣品的需氧菌總數(shù)計數(shù)檢驗時，應(yīng)對供試品原液進(jìn)行計數(shù)。

表2 能力驗證評價表

從中國食品藥品檢定研究院能力驗證結(jié)果計劃報告中獲悉，全國共223 家實驗室報送結(jié)果，按照每個實驗室z 值大小順序排列成柱狀圖，每個柱條對應(yīng)唯一編碼的實驗室，本單位編碼為876。從圖1、圖2 中可直觀地反映出本實驗室測定的數(shù)據(jù)趨近準(zhǔn)確值。實驗室具備很好檢測藥品中需氧菌總數(shù)計數(shù)的能力。

圖1 樣品QA03400502能力評價統(tǒng)計圖

圖2 樣品QA03400327能力評價統(tǒng)計圖

3.3 需氧菌總數(shù)計數(shù)質(zhì)量控制分析

3.3.1 實驗前的準(zhǔn)備控制 收到樣品，應(yīng)及時檢查樣品是否完好、編號是否與能力驗證平臺顯示的樣品編號一致。若樣品存在破損或污染等情況，應(yīng)及時與實施機(jī)構(gòu)聯(lián)系處理。收樣后應(yīng)立即單獨放置于-20 ℃保存，并盡快檢測。實驗用的培養(yǎng)基、吸管、毛巾、鑷子、剪刀等均需按要求滅菌，并進(jìn)行滅菌效果驗證。為了防止高壓滅菌過程中稀釋液和培養(yǎng)基量的減少及減少傳遞過程中的污染，裝培養(yǎng)基和稀釋液的每支試管和三角瓶應(yīng)用硅膠塞塞住后用牛皮紙單獨包扎。吸管在滅菌前，上端應(yīng)塞入一小段棉花，可避免外界雜菌吹入管內(nèi)或不慎將菌液吸出管外，造成污染。

3.3.2 操作環(huán)境的控制 檢測環(huán)境不低于生產(chǎn)關(guān)鍵區(qū)環(huán)境的要求［5］，所以在D 級背景下的B 級單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。并且要嚴(yán)格按照無菌操作要求進(jìn)行實驗，并做好個人安全防護(hù)。因樣品內(nèi)可能含有致病菌，所以本次實驗在生物安全柜中進(jìn)行。實驗前后要對實驗環(huán)境進(jìn)行滅菌。

3.3.3 樣品的制備及稀釋過程控制 實驗前先將樣品放至室溫，用75%的乙醇擦拭瓶蓋后，在生物安全柜內(nèi)以無菌操作打開西林瓶，向瓶內(nèi)緩緩加入10 mL 滅菌水，將樣品完全溶解并混勻，作為待測供試品（作業(yè)指導(dǎo)書明確規(guī)定），室溫放置15 min 后再進(jìn)行后續(xù)稀釋操作。為了確保樣品稀釋的準(zhǔn)確性，用無菌吸管吸取待測供試品5 mL，置盛有45 mL 的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基錐形瓶中，充分振搖，制成1∶10 的樣品溶液。參考《中國藥典》2020 年版四部藥品中需氧菌總數(shù)的控制限度，將3 份樣品均稀釋至10-5，每個稀釋級至少制備2 個平板。樣品的制備和稀釋過程中，菌液的均勻性很重要，因此每次稀釋前后，均要在混勻器上充分混勻。混勻過程要注意控制力度，避免菌液飛濺，造成污染。為了提高樣品檢出限，應(yīng)對供試品原液進(jìn)行計數(shù)。

3.3.4 培養(yǎng)基控制 實驗所使用培養(yǎng)基的pH 值、適用性檢查經(jīng)前期確認(rèn)［6-7］，確保所使用的培養(yǎng)基性能良好。培養(yǎng)基應(yīng)臨用新配，配制后，微生物易增殖［8］，應(yīng)立即滅菌。滅菌后放入45～50 ℃的水浴中保溫，避免溫度過低或過高影響實驗結(jié)果。培養(yǎng)基傾注量應(yīng)為15～20 mL，太少時在培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基會干裂，太多則容易污染，影響計數(shù)。傾注培養(yǎng)基混勻時應(yīng)注意防止混合物濺到皿邊及皿蓋上。培養(yǎng)皿應(yīng)倒置培養(yǎng)，既可防止培養(yǎng)過程中水分蒸發(fā)形成的冷凝水滴落到培養(yǎng)基上造成染菌，也可防止菌落蔓延造成計數(shù)不準(zhǔn)。計數(shù)時，在瓊脂培養(yǎng)基中加入TTC，因TTC 的濃度過高會有抑菌作用［9］，經(jīng)試驗，TTC 的使用濃度為0.01 g/L，即每1 000 mL 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基中加入1 mL 無菌的1% TTC 溶液。

3.3.5 計數(shù)觀察控制 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板在培養(yǎng)2 d 后就應(yīng)進(jìn)行一次觀察計數(shù)，以防菌落被覆蓋而影響計數(shù)結(jié)果。之后分別再培養(yǎng)3、4、5 d 各計數(shù)一次，查看菌落變化情況。必須注意計數(shù)應(yīng)在超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行，不要打開培養(yǎng)皿蓋子，輕拿輕放，防止自身及交叉污染。此次實驗中菌落計數(shù)時平板上有2 個菌落重疊，肉眼能分辨，按2 個菌落計。有片狀菌落且菌落之間沒有明顯界限，按1 個菌落計。

3.3.6 廢棄物的處理控制 所有的實驗用具、含菌溶液或培養(yǎng)物均需經(jīng)過滅菌后洗滌或處理，保證生物安全，減少環(huán)境污染。

3.3.7 結(jié)果上報控制 點計菌落數(shù)后，計算各稀釋級供試液的平均菌落數(shù)，選取平均菌落數(shù)小于300 cfu的稀釋級，作為菌數(shù)報告依據(jù)。若同稀釋級兩個平板的菌落數(shù)平均值不小于15，則兩個平板的菌落數(shù)不能相差1 倍或以上。取最高的平均菌落數(shù)，計算每1 mL 供試品中所含的需氧菌總數(shù)，取兩位有效數(shù)字報告。若各稀釋級的平板上均無菌落生長，或僅最低稀釋級的平板上有菌落生長，但平均菌落數(shù)小于1 時，以小于1 乘以最低稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。數(shù)據(jù)上傳到能力驗證平臺時應(yīng)仔細(xì)核查校對，確保所填信息準(zhǔn)確無誤，并在截止日期前按要求上報所有數(shù)據(jù)和記錄。

4 總結(jié)

根據(jù)能力驗證的結(jié)果反饋情況，說明了本實驗室具備藥品中需氧菌總數(shù)計數(shù)能力測定。能力驗證已逐漸成為實驗室技術(shù)能力和管理水平的考核方法，同時也成為重要且有效的實驗室外部質(zhì)量控制評估手段。通過參加藥品中需氧菌總數(shù)計數(shù)能力驗證，分析總結(jié)檢驗過程中的控制要點，能夠提升實驗室內(nèi)部質(zhì)量控制，進(jìn)一步確保實驗室檢測結(jié)果的真實性、可靠性，同時強化政府監(jiān)管部門對實驗室水平的信任度，最終為人民用藥安全保駕護(hù)航。