馮光寶 ，閆躍飛，高 娜，岳婷婷，潘 磊，侯玉芳，閆 磊

(1.新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河南 新鄉(xiāng) 453000； 2.河南省種牛遺傳性能測(cè)定中心，河南 鄭州 450000； 3.河南省奶牛生產(chǎn)性能測(cè)定有限公司，河南 鄭州 450000)

三聚氰胺，俗稱蛋白精，是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，常被不良商家添加到飼料中以提高蛋白質(zhì)含量。農(nóng)業(yè)部第1218號(hào)公告明令禁止在飼料中人為添加三聚氰胺，并將飼料原料和飼料產(chǎn)品中三聚氰胺的限量值定為2.5 mg/kg。

目前檢測(cè)三聚氰胺常用的檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)法(ELSAE)、高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)法(GC-MS)、液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用法(HPLC-MS/MS)等[1-8]。ELISA 方法受非特異性吸附影響，易導(dǎo)致假陽性；HPLC方法靈敏度低，檢出限偏高，易造成假陽性，適合于飼料中高含量的三聚氰胺的定量分析；GC-MS法用N,O-雙三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA)衍生化，衍生過程中不定因素多，影響檢測(cè)結(jié)果。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)以液相色譜作為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜作為檢測(cè)系統(tǒng)，將色譜高分離能力和質(zhì)譜的高靈敏度和高選擇性優(yōu)點(diǎn)相結(jié)合[9-10]，與傳統(tǒng)定量檢測(cè)方法相比，該方法不僅可以實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)，還可以實(shí)現(xiàn)定性檢測(cè)。目前，該方法在食品、環(huán)境和飼料等許多領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[11-13]，且由于其智能化，處理后的多個(gè)樣品能夠完全機(jī)械化上機(jī)進(jìn)樣，省時(shí)省力。目前飼料中三聚氰胺檢測(cè)，農(nóng)業(yè)部NY/T 1372—2007的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中采用的是高效液相色譜和氣質(zhì)聯(lián)用儀，標(biāo)準(zhǔn)中還沒有專門針對(duì)飼料中三聚氰胺檢測(cè)的液質(zhì)方法。因此，我們?cè)趥鹘y(tǒng)方法基礎(chǔ)上，研究建立配合飼料中三聚氰胺的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法，旨在為配合飼料中三聚氰胺的檢測(cè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1試劑耗材

對(duì)照品：三聚氰胺，純度99.4%；甲醇、乙腈和甲酸，色譜純；乙二胺四乙酸二鈉，分析純。固相萃取柱：Agela Cleanert PCX SPE，60 mg/3 ml。

1.1.2儀器與設(shè)備

1290 Infinity Ⅱ-6460 Triple Quad超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國安捷倫;超純水儀,Millipore synergy；電子天平,梅特勒-托利多。

1.1.3溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取適量三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容至100 ml，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，冷凍保存。

標(biāo)準(zhǔn)中間液：吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.00 ml于10 ml容量瓶?jī)?nèi)，用甲醇定容至10 ml，該溶液質(zhì)量濃度為100 μg/ml，4℃冰箱內(nèi)冷藏。

三氯乙酸溶液：稱取10 g三氯乙酸加水定容至1 000 ml。飽和乙酸鉛溶液：在50 ml水中加入一定量的乙酸鉛，超聲5 min，直至固體不再溶解。

氨水甲醇溶液：量取5 ml氨水于100 ml容量瓶中，用水定容至100 ml。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1色譜條件

色譜柱為C18(2.1 mm×50 mm，1.8 μm); 柱溫為40℃；進(jìn)樣體積為10 μl；流動(dòng)相A為水，B為甲醇，梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.2.2質(zhì)譜參數(shù)

離子源為ESI；離子化模式為正離子模式；干燥氣溫度為350℃；干燥氣流速為11 L/min；干燥氣壓力為275.8 kPa；毛細(xì)管電壓為4 000 V。

1.2.3提取與凈化

(1)提取

稱取配合飼料2 g(精確至0.001 g)于50 ml離心管中，準(zhǔn)確加入18 ml三氯乙酸溶液和2 ml飽和乙酸鉛溶液，混合均勻，超聲提取20 min，0～4℃條件下，10 000 r/min離心10 min，上清液備用。

(2)凈化

固相萃取小柱先用3 ml甲醇和3 ml水進(jìn)行預(yù)處理。取上清液3 ml過柱，濾液以1滴/s的速度過柱，待樣液完全流出后，依次用3 ml 水和3 ml甲醇淋洗，棄去全部流出液。最后用5 ml的氨水甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，將洗脫液于50℃氮?dú)獯蹈桑贸跏剂鲃?dòng)相1 ml復(fù)溶，濾膜過濾，供高效液相色-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定。

(3)基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取空白配合飼料2 g，分別精密量取三聚氰胺中間液適量，添加到空白飼料中，制得濃度范圍為5～500 μg/kg的基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)曲線，供超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定。

1.2.4檢出限和定量限

稱取空白配合飼料2 g(精確至0.001 g)，精密量取三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加到空白配合飼料中，制備成三聚氰胺含量分別為0.5 μg/kg和1.0 μg/kg飼料樣品，按照1.2.3節(jié)的方法進(jìn)行提取和凈化。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

采用ESI源(電噴霧離子源)對(duì)三聚氰胺的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行掃描，通過優(yōu)化解離電壓，讓準(zhǔn)離子分子[M+H]+豐度達(dá)到最大，通過優(yōu)化碰撞電壓，使子離子的豐度最大化，選擇干擾小和豐度大的離子作為定型離子和定量離子。優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 質(zhì)譜參數(shù)

2.2 液相色譜條件優(yōu)化

化合物采用正離子模式進(jìn)行掃描，以水和甲醇為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫，為了獲得良好的化合物峰形，對(duì)梯度洗脫條件進(jìn)行優(yōu)化。三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖見圖1。

圖1 三聚氰胺總離子流圖

從圖1中可以看出，三聚氰胺峰尖峭，且峰形對(duì)稱，無雜質(zhì)干擾。

2.3 線性范圍

根據(jù)上述的儀器條件，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，以三聚氰胺的濃度為橫坐標(biāo)，響應(yīng)面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

由圖2可以看出，三聚氰胺在1.0～100 ng/ml時(shí)呈現(xiàn)出了良好的線性關(guān)系，其相關(guān)系R2大于0.999。

圖2 三聚氰胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 準(zhǔn)確度及精密度實(shí)驗(yàn)

在空白樣品中加入不同濃度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入量分別1、20、50和100 μg/kg，每個(gè)加標(biāo)量同時(shí)做6個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，按照上述的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行樣品處理，通過數(shù)據(jù)處理計(jì)算方法的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，結(jié)果見表3。

由表3可見，在4個(gè)不同加標(biāo)量水平條件下，回收率85.5%～95.2%，RSD≤3.3%(n=6)，說明本方法具有較好的精密度。

表3 三聚氰胺的回收率和精密度(n=6)

2.5 檢出限和定量限

該方法的檢出限(LOD)通過信噪比(S/N)≥3來確定，定量限(LOQ)通過信噪比(S/N)≥10來確定。該方法的檢出限為0.5 μg/kg，定量限為1.0 μg/kg。

3 結(jié)論

建立了超高效液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜測(cè)定配合飼料中三聚氰胺的檢測(cè)方法，通過優(yōu)化儀器條件和前處理?xiàng)l件，該方法的檢出限為0.5 μg/kg，定量限為1.0 μg/kg，與NY/T 1372—2007標(biāo)準(zhǔn)相比，本方法的定量限更低，可以檢測(cè)配合飼料中微量添加的三聚氰胺，而且本方法中采用了基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線，大大提高了加標(biāo)回收率和準(zhǔn)確度。結(jié)果證明該方法具有靈敏度高、特異性好、重復(fù)性高和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，適合測(cè)定配合飼料中的三聚氰胺。