張相倫 靳青 趙紅波 劉曉牧 劉桂芬 張冬梅 譚秀文

關(guān)鍵詞：蝦青素;子宮內(nèi)膜細(xì)胞;凋亡;線粒體;Fas/FasL通路;脂多糖（LPS）

子宮內(nèi)膜炎是牛場常見的繁殖障礙性疾病，多發(fā)于產(chǎn)后，如果治療不及時或治療不當(dāng)可造成產(chǎn)后第一次發(fā)情延遲、配種成功率和妊娠率降低，嚴(yán)重者導(dǎo)致不孕，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。已有研究證實(shí)，致病菌感染是導(dǎo)致該病最重要的因素，這些致病菌在母牛分娩后由子宮頸口入侵至子宮內(nèi)膜層，進(jìn)而引起炎癥反應(yīng)[1，2]。目前，臨床上針對子宮內(nèi)膜炎的治療以抗生素為主，但藥物殘留引發(fā)的食品安全隱患以及耐藥菌株的不斷出現(xiàn)使得治療效果愈發(fā)不明顯，因此，開發(fā)新的抗生素替代品迫在眉睫。

研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)誘發(fā)細(xì)胞凋亡，使機(jī)體正常的組織結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重?fù)p傷。Monack等[3]報道，沙門氏菌和志賀氏菌感染巨噬細(xì)胞，造成促炎級聯(lián)反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。Zhang等[4]報道，金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生多種毒素，引起細(xì)胞凋亡;在某些疾病例如特異性皮炎和敗血癥中，金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡會影響疾病的嚴(yán)重程度和預(yù)后結(jié)果。Bhadaniya等[5]利用病毒、細(xì)菌等病原微生物感染人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)炎癥因子IL-6、IL-8和TNF-α表達(dá)水平升高，細(xì)胞凋亡比例升高，說明病原微生物導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡。因此，針對子宮內(nèi)膜炎的防治有必要從抗凋亡角度入手尋找合適的藥物或添加劑。

蝦青素（astaxanthin，AST）是一種酮式類胡蘿卜素，廣泛存在于海洋生物、藻類、真菌及少數(shù)植物中[6]。研究發(fā)現(xiàn)，蝦青素具有多種生物學(xué)效應(yīng)，尤其在抗凋亡方面具有重要作用[7]，迄今為止使用蝦青素抗炎癥誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的報道非常少。因此本研究利用已成功構(gòu)建的奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞炎癥模型[8]，分別從內(nèi)源性和外源性兩種凋亡途徑探討蝦青素在抵御炎癥誘導(dǎo)的子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡方面的作用，為其在炎癥預(yù)防和治療方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1主要試劑 胎牛血清（FBS）、三抗混合液（BiologicalIndustries）;血清白蛋白（BSA）、蝦青素（Sigma）;DMEM/F12培養(yǎng)基、脂多糖（LPS）、0.25%Trypsin-EDTA（Gibco）;引物（濟(jì)南博尚生物技術(shù)有限公司）;FasL酶標(biāo)試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）;AnnexinV凋亡檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）;TRIzonReagent（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）;HiscriptⅡQRTSuperMixforqPCR（+gDNAwiper）、ChamQTMSYBRColorqPCRMasterMix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）

1.1.2主要儀器 倒置相差顯微鏡及全自動顯微攝像裝置（Nikon）、流氏細(xì)胞儀（BD）、高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf）、酶標(biāo)儀（美國伯騰）、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo）、熒光定量PCR儀（羅氏）、化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（Invitrogen）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理 奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞系購自美國ATCC細(xì)胞庫，按說明書要求進(jìn)行復(fù)蘇并繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁80%～90%時用胰酶消化，加入含10%胎牛血清、1%三抗的DMEM/F12培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為1×104個/mL，置于38℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁80%～90%后，隨機(jī)分為4組：對照組（CK組）、脂多糖組（LPS組）、蝦青素保護(hù)組（LPS+AST組）和蝦青素組（AST組），每組6個重復(fù)。具體操作為：棄培養(yǎng)液，LPS組加入終濃度為1μg/mL的LPS培養(yǎng)液作用6h，之后更換為新鮮培養(yǎng)液;LPS+AST組加入終濃度為1μg/mL的LPS培養(yǎng)液作用6h，之后更換為含1μmol/LAST的培養(yǎng)液;AST組加入新鮮培養(yǎng)液作用6h，之后更換為含1μmol/LAST的培養(yǎng)液;CK組加入新鮮培養(yǎng)液作用6h，之后再次更換為新鮮培養(yǎng)液。

1.2.2酶標(biāo)儀檢測 在酶標(biāo)板孔中分別加入100μL標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品，每孔加入100μL酶結(jié)合物工作液，37℃避光孵育60min，洗板5次;每孔加入100μL生物素化抗體工作液，37℃孵育60min，洗板5次;加入100μL顯色底物，37℃避光孵育15min;最后加入100μL終止液，酶標(biāo)儀測定450nm處吸光度，經(jīng)空白校準(zhǔn)后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算每個樣品的蛋白濃度。

1.2.3細(xì)胞凋亡檢測 待測細(xì)胞培養(yǎng)板用PBS液洗兩次，加入胰酶37℃消化5min，待大部分細(xì)胞脫落時加入含10%FBS的細(xì)胞培養(yǎng)液輕輕吹打，收集細(xì)胞懸液到1.5mL離心管中，300×g離心5min，去掉上清液，加入195μL緩沖液輕輕重懸細(xì)胞，然后加入5μLAnnexinV-FITC并輕輕混勻，室溫避光孵育10min，再加入10μLPI染液輕輕混勻，室溫避光孵育5min，立即流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測并利用WinMDI2.9軟件計算細(xì)胞凋亡率。

1.2.4熒光定量RT-PCR 利用Primer5.0軟件設(shè)計PCR引物（表1）。

利用試劑盒進(jìn)行細(xì)胞總RNA提取，通過A260和A280比值和瓊脂糖電泳檢測RNA純度和完整性。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成，-20℃保存?zhèn)溆?。熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系（μL）：SYBRPremix10μL、上下游引物各1μL、cDNA模板2μL、ddH2O6μL。擴(kuò)增條件：95℃30s;95℃10s，60℃30s，共40個循環(huán);95℃15s，60℃60s，95℃15s。設(shè)置內(nèi)參β-actin表達(dá)量作為參照，采用2-△△Ct法計算mRNA的相對表達(dá)量。20

1.2.5WesternBlot 細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗兩次，加入蛋白裂解液反復(fù)吹打，收集裂解液4℃高速離心吸取上清液;將所有樣品的總蛋白濃度調(diào)至1mg/mL;向樣品中加入緩沖液，混勻后置于水中煮沸5min，使蛋白質(zhì)變性;制備5%濃縮膠和12%分離膠，將蛋白樣品加入點(diǎn)樣孔中，濃縮膠和分離膠電泳電壓分別為90V和120V;70V電壓下轉(zhuǎn)膜30min;將PVDF膜取出置于含3%BSA的TBST中室溫封閉1h;取出將PVDF膜置于一抗中4℃過夜，TBST洗膜;將PVDF膜放入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗溶液室溫孵育2h，TBST洗膜;取出PVDF膜，加入化學(xué)發(fā)光液室溫避光孵育2min，使用凝膠成像系統(tǒng)拍照并進(jìn)行灰度分析，計算蛋白相對表達(dá)量。

1.3數(shù)據(jù)分析

采用SPSS19.0軟件的ANOVA進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)先經(jīng)LSD轉(zhuǎn)換后進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05為差異顯著。

2結(jié)果與分析

2.1蝦青素對子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡的影響

利用流式細(xì)胞儀檢測子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡比例，結(jié)果（圖1）發(fā)現(xiàn)，LPS作用6h導(dǎo)致細(xì)胞凋亡比例顯著升高（P<0.05）;加入蝦青素作用24h后，細(xì)胞凋亡比例顯著下降（P<0.05）。說明蝦青素可降低LPS誘導(dǎo)的子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡。

2.2蝦青素對子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

利用熒光定量RT-PCR檢測Bax、Bcl-2、Fas、Caspase8、Caspase3基因的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果（圖2）發(fā)現(xiàn)，與CK組相比，LPS處理顯著提高子宮內(nèi)膜細(xì)胞Bax、Fas、Caspase8、Caspase3基因的mRNA表達(dá)水平（P<0.05），降低Bcl-2基因的mRNA表達(dá)量（P<0.05）;加入蝦青素作用后Bax、Fas、Caspase8、Caspase3的mRNA表達(dá)量顯著低于LPS處理組（P<0.05），Bcl-2的mRNA表達(dá)量顯著高于LPS組（P<0.05）。說明蝦青素通過線粒體途徑和Fas/FasL途徑抑制LPS誘導(dǎo)的子宮內(nèi)膜細(xì)胞促凋亡相關(guān)基因在mRNA水平上的表達(dá)。

2.3蝦青素對子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡相關(guān)基因蛋白表達(dá)的影響

利用WesternBlot法檢測Bax、Bcl-2、Fas、Caspase8、Caspase3蛋白表達(dá)水平，利用酶標(biāo)儀檢測培養(yǎng)液中FasL含量。結(jié)果（圖3）發(fā)現(xiàn)，與CK組相比，LPS處理顯著提高子宮內(nèi)膜細(xì)胞Bax、Fas、Caspase8、Caspase3蛋白表達(dá)水平以及培養(yǎng)液中FasL含量（P<0.05），降低Bcl-2蛋白表達(dá)水平（P<0.05）;加入蝦青素后Bax、Fas、Caspase8、Caspase3蛋白表達(dá)量以及FasL含量顯著低于LPS處理組（P<0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著升高（P<0.05）。說明蝦青素通過線粒體途徑和Fas/FasL途徑抑制LPS誘導(dǎo)的子宮內(nèi)膜細(xì)胞促凋亡相關(guān)基因在蛋白水平上的表達(dá)。

3討論與結(jié)論

蝦青素作為自然界存在的一種高度活性的化合物，具有增強(qiáng)機(jī)體局部和全身免疫的能力，抵抗機(jī)體炎癥，這種抗氧化性與免疫調(diào)節(jié)特性相結(jié)合[8]，降低機(jī)體組織發(fā)生細(xì)胞凋亡，在防止疾病發(fā)生與傳播中發(fā)揮重要作用。Yoshihisa等[9]利用紫外線誘導(dǎo)HaCaT角質(zhì)形成細(xì)胞發(fā)生凋亡，蝦青素處理降低誘導(dǎo)型一氧化氮（iNOS）、環(huán)氧合酶（COX）-2蛋白和mRNA表達(dá)水平，抑制角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡，降低TNF-α、IL-1β和巨噬細(xì)胞遷移抑制因子（MIF）的蛋白質(zhì)和mRNA表達(dá)水平。Lin等[10]發(fā)現(xiàn)蝦青素預(yù)處理可能通過維持氧化還原平衡并抑制鈣內(nèi)流和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，顯著降低谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞活性喪失和細(xì)胞凋亡。Zhang等[11]在小鼠腹腔內(nèi)注射蝦青素然后注射LPS，發(fā)現(xiàn)蝦青素顯著降低血清中TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎細(xì)胞因子水平以及JAK/STAT3活性，說明蝦青素通過靶向JAK/STAT3介導(dǎo)的凋亡和自噬信號通路抑制急性胰腺炎造成的胰腺損傷。Xu等[12]研究發(fā)現(xiàn)，利用碘海醇處理大鼠的腎小管上皮細(xì)胞造成急性腎臟損傷，蝦青素處理提高SIRT1表達(dá)水平，下調(diào)促凋亡蛋白P53和Bax的表達(dá)水平以及上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平，降低凋亡細(xì)胞數(shù)量，從而對腎小管上皮細(xì)胞起到保護(hù)作用。Sj等[13]報道，蝦青素預(yù)處理保護(hù)抗凋亡缺陷菌株釀酒酵母免受乙酸和過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。Xue等[14]利用大鼠口服蝦青素，然后構(gòu)建冠狀動脈微栓塞模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蝦青素預(yù)處理激活Nrf2/HO-1信號通路抑制氧化應(yīng)激，阻止冠狀動脈微栓塞誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡并改善大鼠的心臟功能障礙。本研究利用已成功構(gòu)建的子宮內(nèi)膜細(xì)胞體外炎癥模型[8]，發(fā)現(xiàn)LPS作用6h導(dǎo)致細(xì)胞凋亡比例升高，加入蝦青素處理后凋亡比例顯著下降，說明蝦青素可降低LPS誘導(dǎo)的子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞凋亡在真核細(xì)胞生物的穩(wěn)態(tài)和發(fā)育中起重要調(diào)節(jié)作用。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)信號通路主要有兩種，即線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性通路和死亡受體介導(dǎo)的外源性通路，其受大量促凋亡和抗凋亡分子的調(diào)控。線粒體是參與能量代謝的細(xì)胞器，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、能量轉(zhuǎn)化和細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[15]。研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2蛋白家族是細(xì)胞凋亡中線粒體途徑的主要參與者。細(xì)胞受到外界刺激后，促凋亡蛋白Bax寡聚化并在線粒體外膜中形成大孔，導(dǎo)致凋亡因子（如細(xì)胞色素c）釋放到細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)而啟動凋亡信號級聯(lián)反應(yīng)[16]。相比之下，Bcl-2家族的抗凋亡蛋白阻止Bax寡聚化，協(xié)助它們重新易位到細(xì)胞質(zhì)中，從而保持線粒體完整性并抑制細(xì)胞凋亡[17]。本研究中LPS誘導(dǎo)的子宮內(nèi)膜細(xì)胞炎癥模型，Bax在mRNA和蛋白水平上表達(dá)均升高，Bcl-2表達(dá)量降低;蝦青素作用24h后，Bax表達(dá)降低而Bcl-2表達(dá)升高。說明蝦青素通過調(diào)控線粒體介導(dǎo)的Bcl-2家族促凋亡和抗凋亡蛋白水平保護(hù)子宮內(nèi)膜細(xì)胞免受LPS誘導(dǎo)的凋亡損傷。

另一種凋亡途徑是外源性凋亡途徑，該途徑由位于細(xì)胞表面的膜受體與對應(yīng)的配體結(jié)合啟動，激活細(xì)胞凋亡的信號級聯(lián)反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)as是細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)最重要的上游信號分子，配體FasL與Fas的死亡域結(jié)合啟動細(xì)胞凋亡[18]。FasL可以作為膜分子或作為哺乳動物細(xì)胞表面的可溶性分子存在[19]。多項研究表明，F(xiàn)as存在于正常哺乳動物胸腺[20]、心臟[21]、肝臟[22]、肺[23]、睪丸[24]和其他組織，而FasL存在于大網(wǎng)膜[25]、睪丸[26]、胎盤[27]和其他器官中。Fas相關(guān)蛋白死亡域（FADD）、Fas、FasL和Caspase8形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物（DISC），促進(jìn)Caspase8激活。本研究中，LPS誘導(dǎo)的子宮內(nèi)膜細(xì)胞Fas、FasL和Caspase8的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平升高;蝦青素處理后降低了LPS對子宮內(nèi)膜細(xì)胞造成的凋亡損傷。因此，蝦青素不僅通過線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑，還通過Fas/FasL凋亡途徑的關(guān)鍵蛋白調(diào)控細(xì)胞凋亡。

Caspase3激活是觸發(fā)細(xì)胞凋亡關(guān)鍵且不可逆事件。Caspase3的非活性前體Pro-Caspase3存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)細(xì)胞發(fā)出死亡信號時，這種前體轉(zhuǎn)化為活性異二聚體。許多研究表明，Caspase3被各種刺激激活，包括受體介導(dǎo)的Caspase8激活、Caspase9激活、凋亡蛋白Bax和Bcl-2表達(dá)改變以及活性氧等[28，29]。本研究中，蝦青素顯著抑制LPS誘導(dǎo)的子宮內(nèi)膜細(xì)胞Caspase3活性。由于Bcl-2家族蛋白和Fas死亡受體在Caspase3表達(dá)和激活的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，因此Caspase3水平下降可能是蝦青素能夠抑制抗凋亡Bcl-2蛋白下調(diào)以及Fas/FasL關(guān)鍵蛋白上調(diào)。

本試驗(yàn)表明，蝦青素通過調(diào)控線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性和Fas/FasL介導(dǎo)的外源性凋亡途徑中促凋亡因子和抗凋亡因子的表達(dá)，抑制LPS誘導(dǎo)的子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡。本研究首次報道了蝦青素對奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞抗凋亡作用的可能機(jī)制，但僅限于細(xì)胞范圍，因此后續(xù)需要臨床研究來評估蝦青素是否可應(yīng)用于奶牛子宮內(nèi)膜炎的防治。