祝晴 王瑞娟 覃冬云 陳浩 代曉彥 劉艷 周紫章 翟一凡

摘要：斑翅果蠅（Drosophilasuzukii）是一種農(nóng)業(yè)害蟲，在世界范圍內(nèi)分布廣泛，可對(duì)多種水果產(chǎn)生不可逆損害，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。本試驗(yàn)對(duì)斑翅果蠅YolkProtein1（Ds-YP1）基因進(jìn)行原核表達(dá)，并對(duì)Ds-YP1蛋白的功能結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測，克隆多肽并構(gòu)建pET-32a-c（+）-Ds-YP1原核表達(dá)載體，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)并免疫小鼠制備抗體;用成功制備的抗體進(jìn)行斑翅果蠅蛋白WesternBlot驗(yàn)證。結(jié)果表明構(gòu)建的pET-32a-c（+）-Ds-YP1表達(dá)載體在大腸桿菌中表達(dá)了His-Ds-YP1融合蛋白，通過免疫小鼠成功制備并純化了Ds-YP1多克隆抗體。制備的Ds-YP1多克隆抗體不但能識(shí)別His-Ds-YP1融合蛋白，而且能識(shí)別斑翅果蠅Ds-YP1蛋白，具有較好的特異性。本研究成功制備了斑翅果蠅Ds-YP1的多克隆抗體，對(duì)進(jìn)一步研究YolkProtein蛋白作用機(jī)制具有重要意義。

關(guān)鍵詞：斑翅果蠅;卵黃蛋白;原核表達(dá);抗體

斑翅果蠅（Drosophilasuzukii）是一種入侵性、破壞性作物害蟲，最早在日本發(fā)現(xiàn)[1]，雄性在每個(gè)翅膀上均有一個(gè)黑點(diǎn)[2，3]。斑翅果蠅不像其他大多數(shù)果蠅物種只攻擊腐爛的水果[4，5]，其更喜歡未受損的成熟水果[4，5];利用鋸齒狀產(chǎn)卵器可刺穿果實(shí)（如櫻桃和一些漿果）相對(duì)堅(jiān)硬的表皮并在其中產(chǎn)卵，在2008年首次侵入美國時(shí)就對(duì)其造成了約50億美元的損失[6-8]。

卵黃蛋白（yolkprotein）是一種對(duì)生殖極為重要的糖脂蛋白，是所有卵生脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物卵黃的主要成分[9，10]。其前體在雌性脂肪體內(nèi)合成，釋放到循環(huán)系統(tǒng)中，并通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用運(yùn)輸?shù)缴L中的卵母細(xì)胞中，或由卵巢濾泡細(xì)胞直接合成作為營養(yǎng)源被利用;經(jīng)20-羥基蛻皮酮調(diào)控后也可在少數(shù)雄性體內(nèi)合成，但量比雌蟲低數(shù)千倍[11，12]。大多數(shù)果蠅體內(nèi)存在至少兩種YP基因，有些果蠅例如黑腹果蠅（D.melanogaster）存在3種[13]。在表達(dá)方面YP1表達(dá)含量往往更高，其次是YP2，其在卵巢與脂肪體中的表達(dá)也并不一致[14]。

有關(guān)果蠅的生殖滯育已有報(bào)道，但關(guān)于斑翅果蠅的滯育卻鮮有人研究[15]。本實(shí)驗(yàn)室前期已對(duì)其滯育溫度、光周期與滯育率進(jìn)行研究，在此基礎(chǔ)上繼續(xù)對(duì)其滯育機(jī)制進(jìn)行探究[16，17]。本研究通過對(duì)斑翅果蠅的YolkProtein1（Ds-YP1）基因進(jìn)行分析，構(gòu)建pET-32a-c（+）-Ds-YP1原核表達(dá)載體，表達(dá)并制備蛋白特異性抗體，以期為卵黃蛋白的作用機(jī)制研究提供支持。

1材料與方法

1.1供試?yán)ハx

斑翅果蠅采自山東省泰安市櫻桃園，由本實(shí)驗(yàn)室人工飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件：溫度（25±1）℃，濕度（50±5）%，光周期16L∶8D。成、幼蟲皆用人工飼料飼喂，成蟲期補(bǔ)給20%糖水。人工飼料配方：麥麩39.1g、蔗糖20.8g、啤酒酵母5.3g、山梨酸0.17g、尼泊金乙酯0.1g、對(duì)羥基苯甲酸甲酯0.07g、抗壞血酸0.09g、維生素溶液1mL、水100mL

1.2序列分析

斑翅果蠅YP1基因序列下載自NCBI，序列AccessionNO.為XM_017081211.2。分別用InterProScan5（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan5/）和signalP4.1Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）對(duì)Ds-YP1的功能結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測。用DNAMAN（version6）進(jìn)行序列翻譯及展示。

1.3引物設(shè)計(jì)

用VectorNTI軟件與NCBI的Primer-BLAST進(jìn)行引物設(shè)計(jì)（表1）。由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4RNA提取和cDNA合成

取10只斑翅果蠅置于1.5mL離心管中，放于液氮速凍研磨，按R6934-01TotalRNAKitⅡ（Omega）試劑盒使用說明提取RNA，最后加入20μLNuclease-FreeWater洗脫RNA，-80℃保存。

按TQ2501-02M-MLVFirstStrandcDNASynthesisKit（Omega）試劑盒說明書合成cDNA，合成產(chǎn)物保存于-20℃冰箱備用。

1.5PCR擴(kuò)增

以斑翅果蠅cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系（50μL）：2×phantaMaxBuffer25μL，dNTPMix（10mmol/Leach）1μL，上下游引物Ds-YP1-1F/R或Ds-YP1-2F/R各2μL，cDNA1μL，phantaMaxSuper-FidelityDNAPolymerase1μL，Nuclease-FreeWater補(bǔ)足至50μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min;94℃變性30s，62℃退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán);72℃延伸5min。PCR結(jié)束后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測（120V、25min）。

1.6重組表達(dá)載體構(gòu)建

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，切取凝膠中的目標(biāo)條帶，用膠回收試劑盒（北京聚合美生物科技有限公司）進(jìn)行回收。將膠回收產(chǎn)物與pET-32a-c（+）（Novagen）一起用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ（Thermo）、NotⅠ（Thermo）進(jìn)行雙酶切。將酶切后DNA產(chǎn)物與載體產(chǎn)物膠回收后，用T4連接酶（Takara）進(jìn)行連接，組成pET-32a-c（+）-Ds-YP1重組表達(dá)載體。

將酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)入EscherichiacoliDH5α（天根生化科技有限公司），在含有氨芐青霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基上涂板，用無菌玻璃涂布器將菌液輕輕涂布均勻，封口膜封口后，倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12～16h。挑取單菌落至LB液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)，進(jìn)行陽性克隆鑒定，體系為10μL：2×TaqMasterMix5μL，T70.4μL，T7Terminator0.4μL，菌液1μL，ddH2O補(bǔ)足至10μL，反應(yīng)程序同1.5。

將鑒定正確的菌液送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果用VectorNTI軟件進(jìn)行比對(duì)。選擇測序結(jié)果正確的克隆提取質(zhì)粒（Vazyme，F(xiàn)astPurePlasmidMiniKit），-20℃保存。

1.7蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliBL21（天根生化科技有限公司）中，在含有氨芐青霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基上%板，待長出菌落后挑單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220r/min培養(yǎng)，菌液OD600值達(dá)到0.6左右時(shí)加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度0.1mmol/L，37℃、150r/min培養(yǎng)6h，之后4℃、8000r/min離心10min收集菌體。

在未誘導(dǎo)與誘導(dǎo)6h樣品菌體中加1×PBS（0.2g/mL），振蕩懸浮后用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技有限公司）進(jìn)行破碎：功率20%，超聲每次2s，間隔3s，破碎至菌體均勻清亮。

離心收集上清和沉淀，上清作為蛋白上清樣品;沉淀經(jīng)含8mol/L脲的1×PBS溶解后再離心得到上清液作為包涵體;超聲破碎后未經(jīng)離心的樣品作為混合物樣品。

將蛋白上清、包涵體和混合物樣品在蛋白電泳儀（Bio-Rad）上進(jìn)行SDS-PAGE電泳，恒壓120V電泳至溴酚藍(lán)條帶跑出膠板下邊緣關(guān)閉電泳儀。將蛋白膠于考馬斯亮藍(lán)R250染色液中染色30min，過夜脫色后觀察蛋白表達(dá)情況。

1.8WesternBl

在SDS-PAGE電泳結(jié)束后，用濕轉(zhuǎn)電泳儀（Bio-Rad）在冰浴條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，300mA恒流轉(zhuǎn)膜120min。結(jié)束后將0.45μmPVDF膜（MilliPore）浸入封閉液中，搖床常溫孵育1h，用TBST漂洗10min;加入用BSA稀釋10000倍的MouseantiHis-TagmAb（ABclonal）4℃過夜孵育;回收一抗后再用TBST漂洗3遍，每遍10min;加入用BSA稀釋10000倍的辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），常溫?fù)u床孵育2h;TBST漂洗4遍，每遍10min;最后使用極超敏化學(xué)發(fā)光試劑盒（山東思科捷生物技術(shù)有限公司）顯色，于ChemiScope系列熒光及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）中顯影。

1.9抗體制備

目的蛋白條帶切膠-20℃保存。將蛋白膠條放入干凈研缽中，研磨至黏稠狀，加0.9%生理鹽水稀釋備用。SPF級(jí)KM小鼠（濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司）7只，每只20g左右，喂養(yǎng)3天后用1mL針管45度角注射腹部位，每次每只小鼠注射300～500μL，注意排盡針管空氣。每周免疫一次，連續(xù)4周，第5周摘眼球取血。

血液放于1.5mL離心管中，立即放入37℃水浴鍋1h，然后4℃放置6h，之后4℃、12000r/min離心15min，取上清，液氮速凍后放于-80℃凍存。

1.10果蠅總蛋白提取

提取蛋白全程均在冰上操作，研磨棒需預(yù)冷。取15只斑翅果蠅放入液氮速凍，加200μL研磨液進(jìn)行冰浴研磨，然后冰上靜置30min，每隔幾分鐘混勻一次;離心機(jī)預(yù)冷至4℃，12000r/min離心5min，取上清;加入蛋白上樣緩沖液100℃金屬浴5min;-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2結(jié)果與分析

2.1序列分析及克隆

Ds-YP1序列開放閱讀框?yàn)?320bp，編碼蛋白共439個(gè)氨基酸。Ds-YP1蛋白具有信號(hào)肽（1～19aa）和完整的vitellgenin功能結(jié)構(gòu)域（129～410aa，圖1），去除信號(hào)肽后經(jīng)軟件預(yù)測分析，分子量為46.96kD。對(duì)完整的開放閱讀框進(jìn)行PCR克隆及測序，結(jié)果表明，序列長度與數(shù)據(jù)庫序列一致，且無突變堿基（圖2）。

2.2重組表達(dá)載體的構(gòu)建

首先選取不含信號(hào)肽的部分序列進(jìn)行擴(kuò)增（圖3），將擴(kuò)增目的片段與pET-32a-c（+）載體經(jīng)EcoRⅠ、NotⅠ酶切，經(jīng)連接轉(zhuǎn)化后構(gòu)成重組表達(dá)載體pET-32a-c（+）-Ds-YP1。構(gòu)建的載體用通用引物經(jīng)PCR和雙酶切鑒定，得到的片段大小與預(yù)期一致（圖4）。測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組表達(dá)載體中的插入片段與Ds-YP1基因的序列完全一致，且無移碼現(xiàn)象。以上結(jié)果說明，pET-32a-c（+）-Ds-YP1重組表達(dá)載體構(gòu)建成功，可以用來誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白。

2.3重組蛋白在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)

將未誘導(dǎo)與誘導(dǎo)樣品的蛋白上清、包涵體和混合物樣品分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)R250染色后，發(fā)現(xiàn)目的蛋白在蛋白上清、包涵體及混合物中都有表達(dá)，且包涵體中表達(dá)量最高（圖5）。從WesternBlot檢測結(jié)果也可看出，目的蛋白與His抗體發(fā)生特異結(jié)合且與預(yù)期大小一致，證明重組蛋白正確表達(dá)（圖6）。

2.4抗體制備與檢測

將包涵體中的重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后切膠回收免疫KM小鼠，4周后收集血清，檢測血清中的抗體Anti-Ds-YP1。將血清稀釋5000倍后，檢測未誘導(dǎo)與誘導(dǎo)樣品，結(jié)果顯示，條帶單一且效價(jià)高（圖7）。隨后用制備的Anti-Ds-YP1抗體WesternBlot檢測斑翅果蠅蛋白樣品，結(jié)果顯示，在抗體稀釋18000倍時(shí)，條帶清晰，信號(hào)強(qiáng)（圖8）。

以上結(jié)果表明制備的Anti-Ds-YP1特異性強(qiáng)且效價(jià)高，結(jié)果與預(yù)期相符，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

3討論與結(jié)論

卵黃蛋白是卵黃發(fā)生時(shí)沉積在卵內(nèi)供胚胎發(fā)育營養(yǎng)所需的卵內(nèi)貯藏蛋白。昆蟲的卵黃蛋白主要分為卵黃蛋白原（vitellogenin）、卵黃多肽（yolkpolypeptides）和小卵黃蛋白（minorYP）三種[18]。其中卵黃蛋白原是一類大分子量的糖脂復(fù)合蛋白，與非昆蟲的卵黃蛋白原進(jìn)化上同源，可能起源于共同的祖先[19]。卵黃多肽存在于高等雙翅目昆蟲中，功能等同于其它昆蟲卵黃蛋白原，但是分子量較小，約為45kD[20]。小卵黃蛋白是在鱗翅目昆蟲卵內(nèi)分布的一類特異性蛋白[21]。本研究中，斑翅果蠅的卵黃蛋白大小為46.96kD，屬于卵黃多肽。

雖然卵黃多肽功能上與卵黃蛋白原相似，但其進(jìn)化上卻完全不同，卵黃蛋白原與脊椎動(dòng)物的血清載脂蛋白B（apolipoproteinB）具有較高的同源性，卵黃多肽與肝酯酶（hepaticlipases）和胰酯酶（pancreaticlipases）進(jìn)化上同源。在黑腹果蠅中有3種YP，主要在脂肪體和卵巢泡細(xì)胞中合成，但在不同組織中的分布和表達(dá)不同[22]。果蠅（Drosophilagrimshawi）中也有3種YP，在脂肪體中YP1合成最多，而YP2和YP3較少;在卵巢內(nèi)，YP2合成最多，YP1較少，而YP3幾乎不存在[23]。本試驗(yàn)用抗體檢測斑翅果蠅YP（圖8），發(fā)現(xiàn)在目的條帶上方存在條帶，這可能是斑翅果蠅的其它YP，其不同YP的含量不同可能與果蠅的發(fā)育時(shí)期和組織分布有關(guān)。

本試驗(yàn)通過構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后進(jìn)行原核表達(dá)，并用小鼠進(jìn)行抗原免疫，成功獲得了高質(zhì)量抗體。后續(xù)研究將利用該抗體對(duì)卵黃蛋白在斑翅果蠅中的功能進(jìn)行分析。本研究結(jié)果將有助于對(duì)斑翅果蠅生殖發(fā)育等機(jī)制開展更深入的研究，為果蠅防治工作提供新的途徑。