李 靜，李明源，王繼蓮，張 甜，周 茜

（喀什大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院，葉爾羌綠洲生態(tài)與生物資源研究高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆帕米爾高原生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 喀什 844000）

纖維素是由葡萄糖以β-1,4糖苷鍵連接而成的線性鏈多糖[1]，結(jié)構(gòu)緊密、排列有序，具有高結(jié)晶度和難溶性等特點(diǎn)[2]，是植物細(xì)胞壁的主要組成成分（圖1）。纖維素類物質(zhì)是世界上年產(chǎn)量最多的二次資源[3]，每年通過(guò)光合作用合成的有機(jī)物約有1×1011t，而纖維素就占50%，它們的再利用對(duì)社會(huì)的可持續(xù)發(fā)展和環(huán)境保護(hù)具有重要意義[4]。

圖1 纖維素結(jié)構(gòu)示意圖[5]Fig.1 The structure of cellulose[5]

纖維素的預(yù)處理是目前制約生物質(zhì)資源高效利用的技術(shù)瓶頸之一。物理方法可以有效降低纖維素的結(jié)晶度，包括破碎、高溫?zé)峤狻⑽⒉ㄌ幚砗透吣茌椛涞确绞?，具有操作?jiǎn)單、污染少的優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)能耗大，成本高?；瘜W(xué)方法操作繁瑣程度較低，短時(shí)間就可達(dá)到降解效果，方式主要包括酸降解、堿降解、有機(jī)溶劑預(yù)處理和氧化預(yù)處理等。但所需試劑濃度較高，且后續(xù)需進(jìn)行pH調(diào)節(jié)，生成的化學(xué)殘留物也會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，因此處理過(guò)的酸堿必須進(jìn)行回收處理[6]。而微生物預(yù)處理是利用高產(chǎn)纖維素酶降解菌對(duì)其進(jìn)行酶解，具有環(huán)保、專一性強(qiáng)、處理成本低、反應(yīng)條件溫和、能耗低等優(yōu)點(diǎn)，備受科研人員關(guān)注[7?8]。研究者們相繼開(kāi)展了纖維素酶生產(chǎn)菌的選育及降解特性研究，得到了一批寶貴的菌種資源[9]。本文總結(jié)歸納了纖維素降解菌的篩選方法和研究策略，探討了各策略的優(yōu)勢(shì)特點(diǎn)和應(yīng)用價(jià)值，并闡釋了纖維素的微生物降解機(jī)理，對(duì)未來(lái)如何進(jìn)一步高效利用纖維素進(jìn)行了展望，以期為纖維素類物質(zhì)的降解提供進(jìn)一步理論支撐，促進(jìn)二次資源的綜合利用。

1 篩選單一菌株降解纖維素

環(huán)境中存在著豐富的纖維素降解菌，主要包括真菌、放線菌及細(xì)菌等。它們的類群龐雜，相互協(xié)調(diào)，但絕大多數(shù)難以進(jìn)行人工培養(yǎng)。目前已分離200多種，主要來(lái)源于枯腐樹葉或衣服、秸稈還田的土壤、反芻動(dòng)物糞便等，多使用單一碳源（濾紙條或羧甲基纖維素鈉CMC-Na）進(jìn)行富集培養(yǎng)[10?11]。由表1可見(jiàn)，降解菌種主要包括青霉屬（Penicillium）、曲霉屬（Aspergillus）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、假單胞菌（Pseudomonas）、芽孢桿菌（Bacillus）等，以真菌居多，不同菌種對(duì)底物的降解效率參差不齊。

表1 單一菌株的纖維素降解特性Table 1 Characteristics of cellulose degradation activity of single strain

纖維素分子間主要靠氫鍵連接，鍵能相對(duì)較弱，其降解主要靠微生物產(chǎn)生的纖維素酶（包括外切β-1,4葡萄糖苷酶、內(nèi)切β-1, 4葡萄糖苷酶和β-葡聚糖苷酶）破壞其氫鍵和β-1, 4糖苷鍵，將其多結(jié)構(gòu)變?yōu)閱谓Y(jié)構(gòu)。但纖維素酶活力受到諸多因素的影響，與培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間密切相關(guān)，溫度過(guò)高會(huì)造成菌株提前失活[12]，微生物培養(yǎng)基的pH、營(yíng)養(yǎng)成分比例、接種量等也會(huì)對(duì)酶活力產(chǎn)生明顯影響，影響降解率。而相關(guān)研究報(bào)道證明通過(guò)向培養(yǎng)基中添加一定量的Fe2+和VB12等附加因子，可以起到穩(wěn)定酶空間構(gòu)象及提高微生物代謝效率的作用[20]，有效提高纖維素降解率。此外，培養(yǎng)基中可添加適宜的產(chǎn)酶誘導(dǎo)物也可以提高纖維素酶產(chǎn)量，加速纖維素降解。槐糖是已報(bào)道誘導(dǎo)力最強(qiáng)的產(chǎn)纖維素酶誘導(dǎo)物，但大規(guī)模生產(chǎn)不具備經(jīng)濟(jì)可行性。而以稻草粉代替槐糖作為碳源和誘導(dǎo)物，采用固體發(fā)酵法優(yōu)化綠色木霉的產(chǎn)酶條件，纖維素酶活力得到有效提升[21]。

近年來(lái)，環(huán)境耐受性良好的高效降解纖維素菌株也被逐步發(fā)掘。某些冷適應(yīng)降解菌的產(chǎn)酶條件經(jīng)優(yōu)化后在低溫下可保持高效產(chǎn)酶能力。放線菌Clavibacter michiganensisCF11在低于10 ℃、pH為6.5、培養(yǎng)時(shí)間為10 d的條件下纖維素酶活力顯著提升[22]。而一些耐高溫纖維素酶菌株具有高溫偏好性，熱穩(wěn)定性強(qiáng)，在高溫環(huán)境下的纖維素降解能力較強(qiáng)[23]。如解淀粉芽孢桿菌Bacillus methylotrophicusY3-2在55 ℃條件下，不僅能高效降解纖維素，還具有抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等病原菌的能力，具有潛在應(yīng)用前景[24]。但超高溫好氧發(fā)酵技術(shù)過(guò)程中會(huì)流失較多的營(yíng)養(yǎng)成分，如何在高效降解和保持較多的營(yíng)養(yǎng)成分之間找一個(gè)平衡點(diǎn)，有待深層次研究[25]。

2 微生物協(xié)同降解纖維素

單一菌株生成的纖維素酶種類相對(duì)單一，產(chǎn)酶能力薄弱，降解能力有限。1950年，Gilligan[26]首次發(fā)現(xiàn)木霉所產(chǎn)的纖維素酶可通過(guò)協(xié)同作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)纖維素的高效降解。微生物協(xié)同降解的優(yōu)勢(shì)在于產(chǎn)酶種類多、耗時(shí)少、降解覆蓋率高、針對(duì)性強(qiáng)[27]，但對(duì)培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基成分、比例等的要求相對(duì)嚴(yán)格。工業(yè)生產(chǎn)中，常利用微生物的協(xié)同作用達(dá)到降解纖維素作物的目的[28]。

2.1 篩選復(fù)合微生物菌系

直接從自然界篩選的天然復(fù)合菌群，基于微生物間的協(xié)同作用能有效增強(qiáng)纖維素降解速度，不僅擁有健全的酶系，還可以將不同pH的培養(yǎng)液緩沖到中性，更適合菌系生存。崔宗均等[29]采用酸堿反應(yīng)互補(bǔ)原則，在傳代時(shí)重新優(yōu)化組合馴化出的復(fù)合菌系MC1可在72 h內(nèi)將濾紙和脫脂棉等較純的纖維素材料完全降解，對(duì)麥稈、鋸末等材料也有較強(qiáng)的降解能力。

復(fù)合體系中微生物產(chǎn)生的纖維素酶可降解纖維素生成葡萄糖，起到為菌供能、促進(jìn)增殖等作用，多組分酶體系在降解過(guò)程中互補(bǔ)互利，共同完成降解過(guò)程。而復(fù)合菌系的構(gòu)建增加了酶的環(huán)境適應(yīng)性和功能穩(wěn)定性，彌補(bǔ)了單一菌種的纖維素酶種類不全和纖維素酶配比不協(xié)調(diào)等缺點(diǎn)，從而提升降解速度。因此可以說(shuō)，各組成菌之間、組成菌與纖維素酶、各酶與酶之間的協(xié)同和拮抗作用，是保持復(fù)合菌系穩(wěn)定的重要機(jī)制。即使混入其它雜菌，也很難將這個(gè)平衡系統(tǒng)破壞。

復(fù)合菌系雖然在降解效果上優(yōu)于單一菌株，但降解過(guò)程中出現(xiàn)的不確定因素也較多，如微生物群落和代謝類型不明確、高溫或低溫環(huán)境中部分酶系易失活、菌系的組成和結(jié)構(gòu)會(huì)因培養(yǎng)條件的差異而改變等。因此，要想達(dá)到快速、低成本降解纖維素的目的，高效降解菌的篩選還存在一些亟待解決的瓶頸問(wèn)題：a.明確復(fù)合菌系中菌株組成類別，進(jìn)而準(zhǔn)確判斷菌株習(xí)性，構(gòu)建最優(yōu)培養(yǎng)條件；b.深入解析各酶組分之間的重要協(xié)同作用關(guān)系；c.解析復(fù)合菌系中的代謝調(diào)控；d.增強(qiáng)對(duì)環(huán)境耐受性的復(fù)合菌系的研究?，F(xiàn)階段可對(duì)菌株培養(yǎng)條件（溫度、pH、培養(yǎng)時(shí)間等）進(jìn)行變量-非變量研究，觀察纖維素降解效率及纖維素酶活峰值的變化，從而確定菌群的最優(yōu)培養(yǎng)條件[30?31]?；蛑匦陆M合已有的復(fù)合菌群和功能菌群，檢測(cè)、對(duì)比新復(fù)合菌系的降解效率、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性及功能性，從而進(jìn)一步明確復(fù)合體系中各組分間的協(xié)同作用關(guān)系。此外，還可聯(lián)合生物工程技術(shù)構(gòu)建基因工程菌，將難培養(yǎng)的微生物中的纖維素酶編碼基因克隆到大腸桿菌或釀酒酵母上進(jìn)行表達(dá)，以期獲得產(chǎn)率更大、酶系更完整的高活性降解菌。而通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)提取復(fù)合菌群的微生物總DNA，從構(gòu)建的基因組文庫(kù)中篩選高產(chǎn)纖維素酶基因，也可提升降解菌系的結(jié)構(gòu)和功能分析效率。

2.2 優(yōu)化組合純培養(yǎng)菌株

將單一高活性產(chǎn)酶菌株混合培養(yǎng)，基于不同微生物類群的優(yōu)化組合可以彌補(bǔ)菌種間的性質(zhì)差異，所構(gòu)成的完全酶系可充分發(fā)揮各酶系間的協(xié)同作用，綜合提高酶活性，最大限度發(fā)揮纖維素降解潛力，毫不遜于直接篩選到的復(fù)合菌系（表2）。多數(shù)學(xué)者對(duì)霉菌的組合研究較多[32]，對(duì)細(xì)菌和放線菌的協(xié)同作用鮮見(jiàn)報(bào)道。細(xì)菌的基因無(wú)內(nèi)含子，可直接克隆目的基因，方便構(gòu)建高效纖維素酶工程菌[33]。而放線菌作為土壤微生物的重要組成部分，參與了大部分高分子聚合物的降解，還可以產(chǎn)生具有抑制雜菌生長(zhǎng)的抗菌素[34]。因此，構(gòu)建細(xì)菌與放線菌的復(fù)合菌系具有廣闊的研究前景。此外，菌株的培養(yǎng)環(huán)境也會(huì)深刻影響降解效果，原位生長(zhǎng)環(huán)境的模擬能顯著提升其降解效果。

表2 組合菌株的纖維素降解特性Table 2 Characteristics of cellulose degradation activity of mixed strains

針對(duì)分離到的不同單一菌株，總結(jié)其相互間的拮抗活性、酶種類和代謝產(chǎn)物，將具有互補(bǔ)差異的幾種高酶活菌株進(jìn)行復(fù)配，介導(dǎo)菌株之間的協(xié)同作用可起到提高菌系的降解能力和穩(wěn)定性目的。同時(shí)此類復(fù)合體系每個(gè)菌株的特性明確，在實(shí)際應(yīng)用中能較好地控制其活性，可操作性強(qiáng)。但缺陷在于優(yōu)化組合單一菌株的過(guò)程相比天然復(fù)合菌系繁瑣復(fù)雜。另外需注意的是，并不是所有混合菌的發(fā)酵一定比單菌株發(fā)酵能力強(qiáng)，因復(fù)合菌系之間可能存在競(jìng)爭(zhēng)或拮抗作用，不利于菌株的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶。因此，在進(jìn)行不同組合的菌株培養(yǎng)時(shí)，要充分考慮菌株間的拮抗作用、物種組成和比例、菌株的生長(zhǎng)周期和整體酶系的穩(wěn)定等因素[45]。

3 微生物降解纖維素機(jī)理

微生物直接通過(guò)胞吞方式將纖維素等大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜內(nèi)進(jìn)行代謝是很難實(shí)現(xiàn)的，因此，其對(duì)纖維素的降解主要靠分泌至胞外的纖維素酶氧化分解。由于纖維素結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，其確切的降解機(jī)理至今尚無(wú)定論。目前被大家普遍接受的主要有3種理論[46]，分別是C1-CX假說(shuō)、協(xié)同理論和原初反應(yīng)假說(shuō)。

3.1 C1-CX假說(shuō)

此假說(shuō)認(rèn)為在纖維素降解過(guò)程中，纖維素酶與各個(gè)酶或物質(zhì)要依據(jù)一定的步驟順序才能完成整個(gè)水解過(guò)程[47]。相關(guān)研究表明，需要C1酶（外切β-1,4葡萄糖苷酶）、CX酶（內(nèi)切β-1, 4葡萄糖苷酶）和CB酶（β-葡聚糖苷酶）同時(shí)存在才能將天然纖維素水解為葡萄糖。如果在降解結(jié)晶纖維素時(shí)首先加入C1酶，反應(yīng)過(guò)后除去C1酶的同時(shí)再加入CX酶，則反應(yīng)過(guò)程無(wú)法完成。根據(jù)C1-CX假說(shuō)，先是結(jié)晶纖維素在C1酶的作用下將已形成結(jié)晶結(jié)構(gòu)的纖維素鏈斷裂，使長(zhǎng)鏈分子的末端脫離，形成非結(jié)晶無(wú)定型纖維素或可溶性低聚糖，從而導(dǎo)致纖維素鏈易水解。接著CX酶作用于非結(jié)晶無(wú)定型纖維素或可溶性低聚糖，產(chǎn)生纖維二糖，最后在CB酶的水解作用下生成葡萄糖（圖2）。

圖2 C1-CX假說(shuō)理論[48?49]Fig.2 The C1-CX hypothesis theory [48?49]

C1酶可作用于纖維素的結(jié)晶區(qū)，使之轉(zhuǎn)變?yōu)榭杀籆X酶作用的形式。但該學(xué)說(shuō)沒(méi)有很好地解釋C1酶的作用機(jī)理。有學(xué)者對(duì)其提出了種種推測(cè)及猜想，如C1酶可能作用于連接纖維素分子間的氫鍵、纖維素分子中的β-1, 4糖苷鍵、其它一些不規(guī)則的鍵或薄弱鍵等，但都沒(méi)有得到證實(shí)[50]。CX酶在水解過(guò)程中起著舉足輕重的作用，在一定程度上影響著纖維素大分子水解為纖維二糖的程度，可以用來(lái)表征纖維素酶降解纖維素的能力。C1酶和CX酶對(duì)纖維素的水解作用是分階段協(xié)調(diào)的，C1酶只起到轉(zhuǎn)化纖維素的結(jié)晶區(qū)但不水解的作用，而CX酶可將部分無(wú)定型纖維素水解為可溶性產(chǎn)物。

3.2 協(xié)同理論

協(xié)同理論是3個(gè)理論中接受度最高的理論[51]，其降解過(guò)程也是由CX酶、C1酶和CB酶3種酶協(xié)同完成[52]。其中CX酶的作用是可以給C1酶和CB酶創(chuàng)造酶切位點(diǎn)，再通過(guò)水解作用，作用于β-1,4糖苷鍵，長(zhǎng)鏈寡糖被裂解為短鏈寡糖，此時(shí)一些帶有非還原性末端的纖維素分子就會(huì)顯現(xiàn)出來(lái)。最后，C1酶作用于這些帶有非還原性末端的小分子纖維素末端，使纖維二糖分子脫下，再在CB酶的水解作用下水解為葡萄糖分子[53]（圖3）。Wood[54]發(fā)現(xiàn)赤木霉Trichoderma reesei和青霉菌Penicillium funiculosumde產(chǎn)生的纖維素酶在水解微晶纖維素和棉纖維時(shí)具有協(xié)同性。這種現(xiàn)象可能是由于兩種纖維素酶底物的立體特異性不同所致。在協(xié)同過(guò)程中，每種纖維素酶作用于兩個(gè)不同的非還原性鏈末端中的一個(gè)。當(dāng)一種纖維素酶切斷一種非還原鏈末端的一個(gè)纖維二糖單元時(shí)，另一種非還原鏈將暴露出來(lái)，并且具有不同底物立體特異性的第二種纖維素酶將切斷纖維二糖單元。在這個(gè)過(guò)程中，這兩種酶的協(xié)調(diào)可以解釋協(xié)同效應(yīng)。而在晶態(tài)幾丁質(zhì)降解過(guò)程中，通過(guò)幾丁質(zhì)降解酶系的內(nèi)外協(xié)同，促進(jìn)了外切幾丁質(zhì)酶在幾丁質(zhì)纖維上“持續(xù)奔跑”的耐力，進(jìn)而增強(qiáng)昆蟲在蛻皮過(guò)程中表皮的快速降解[55]。

圖3 協(xié)同作用降解纖維素示意圖[56?57]Fig.3 Schematic diagram of synergistic cellulose degradation[56?57]

與C1-CX假說(shuō)不同的是，在協(xié)同理論中，纖維素酶的順序沒(méi)有固定性和單一性。由于每種纖維素酶組分在水解過(guò)程中的確切作用還不清楚，纖維素酶的類型也沒(méi)有嚴(yán)格的區(qū)別。因此，雖然協(xié)同理論可以解釋大多數(shù)纖維素的降解過(guò)程，但對(duì)起始反應(yīng)是如何開(kāi)始的及天然纖維素結(jié)晶區(qū)的降解機(jī)制尚不能完全闡明[58]。

3.3 原初反應(yīng)假說(shuō)

原初反應(yīng)是一個(gè)無(wú)序反應(yīng)，最早是在褐腐菌的水解研究中提出的。褐腐菌菌絲處于靠近次生木質(zhì)細(xì)胞壁的S3層，在降解纖維素過(guò)程中菌絲可產(chǎn)生降解劑，擴(kuò)散到S2層，從而導(dǎo)致擴(kuò)散性腐爛（圖4）。當(dāng)褐腐菌開(kāi)始降解纖維素時(shí)，機(jī)械強(qiáng)度急劇下降，在此過(guò)程中只有少量的重量損失和少量的還原糖生成[59]，這與纖維素酶水解過(guò)程中產(chǎn)生的聚合度降低而生成的還原糖含量增加的變化明顯不同。因此Coughlan[60]提出原初反應(yīng)可以改變纖維素的結(jié)晶狀態(tài)，更有利于纖維素的水解。褐腐菌的獨(dú)特之處在于，當(dāng)木材完全降解時(shí)，木質(zhì)素很少被降解，這有利于纖維素和半纖維素的快速解聚。鑒于褐腐菌在降解天然纖維素方面的獨(dú)特性，有學(xué)者推測(cè)，褐腐菌可能存在一種特殊的非酶木材降解系統(tǒng)，其中一小部分物質(zhì)可進(jìn)入S2解聚纖維素[61]。

圖4 木質(zhì)細(xì)胞壁模型Fig.4 Wood cell wall model

另外霉菌在降解時(shí)首先會(huì)進(jìn)入纖維細(xì)胞壁里面，通過(guò)CX酶和C1酶的協(xié)同作用降解纖維素。而褐腐菌不含C1酶，CX酶的作用可能只打開(kāi)一小部分的糖苷鍵，能降低纖維素的強(qiáng)度，削弱纖維的表面，所以只能看到機(jī)械強(qiáng)度的下降等物理變化，其他變化很小，比如其還原糖含量用還原糖分析方法則無(wú)法測(cè)出。

4 展望

不同菌種生成的纖維素酶之間可能存在某種程度的拮抗作用，從而影響纖維素降解效率。單一菌株易培養(yǎng)、易獲取，但酶活性較低，降解不徹底。而多種微生物協(xié)同作用在降解中表現(xiàn)出的優(yōu)勢(shì)更明顯，降解效果更理想，尤其是復(fù)合菌系的環(huán)境耐受性和穩(wěn)定性，對(duì)纖維素的降解意義重大。但天然復(fù)合菌系和優(yōu)化組合單一菌株的各方面條件相對(duì)嚴(yán)格，因此篩選過(guò)程中還需注重培養(yǎng)環(huán)境的優(yōu)化。同時(shí)，聯(lián)合基因工程組學(xué)，通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)分離纖維素酶編碼基因，促進(jìn)基因表達(dá)，包括排除對(duì)阻遏敏感的操縱基因、提高轉(zhuǎn)譯效率和將基因連到強(qiáng)啟動(dòng)子上等，都可有效改善纖維素酶穩(wěn)定性，達(dá)到提高降解率目的[63?64]。

天然纖維素在降解過(guò)程中涉及到的能量變化、新陳代謝復(fù)雜多變，具體的生物降解過(guò)程尚不完全明確。因此，仍需進(jìn)一步探究纖維素酶類的不同組分和小分子活性物質(zhì)之間的作用，從酶學(xué)、動(dòng)力學(xué)等多個(gè)角度綜合揭示纖維素的降解機(jī)理。待深入闡明其降解機(jī)制過(guò)后，就可以實(shí)現(xiàn)菌群的人工調(diào)控，基于理論分析和應(yīng)用研究的有機(jī)結(jié)合，使纖維素酶的水解達(dá)到極致，實(shí)現(xiàn)纖維素作物的最大限度利用?？傊?，實(shí)現(xiàn)纖維素的微生物降解和資源化利用，是將閑置纖維素類作物變廢為寶、保護(hù)環(huán)境、緩解世界能源危機(jī)、推動(dòng)綠色可持續(xù)發(fā)展的重要手段。