竇彥麗，陳金鰲

（1.呂梁學(xué)院體育系，山西 呂梁 033001；2.常州大學(xué)體育學(xué)院，江蘇 常州 213164）

進(jìn)入21世紀(jì)后，我國(guó)經(jīng)濟(jì)呈現(xiàn)高速發(fā)展，居民的飲食結(jié)構(gòu)也隨之發(fā)生了較大變化，由低脂飲食轉(zhuǎn)向高脂肪飲食[1]。高脂飲食最顯著的特點(diǎn)之一就是其中包含大量的飽和脂肪酸，而伴隨飽和脂肪酸的大量攝入，高脂血癥的發(fā)病率出現(xiàn)了顯著提升[2]。現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)研究顯示，高血脂癥誘導(dǎo)的脂質(zhì)代謝異常是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化最主要的影響因素，當(dāng)血脂過(guò)高時(shí)，大量脂質(zhì)會(huì)沉積在機(jī)體動(dòng)脈，從而導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化。動(dòng)脈粥樣硬化會(huì)引起血管管腔狹窄，是引起心腦血管疾病發(fā)生、發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素[3?5]。因此，如何科學(xué)健康的飲食，預(yù)防心腦血管疾病的發(fā)生，愈發(fā)受到相關(guān)學(xué)者的關(guān)注。

靈芝（Ganodema lingzhi）在我國(guó)栽培歷史悠久，針對(duì)其藥理作用的論述頗多[6?8]。大量研究表明，多糖是靈芝的主要活性物質(zhì)，相關(guān)研究證實(shí)，靈芝多糖具有降血脂、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化及防輻射等生理活性[9]。有氧運(yùn)動(dòng)是一種不間斷且連續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)的中等強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)[10]。相關(guān)研究證實(shí)，在脂肪氧化分解的過(guò)程中，脂肪酶的活性會(huì)隨著有氧運(yùn)動(dòng)時(shí)間的增加而上升，隨之而來(lái)的效應(yīng)是有氧運(yùn)動(dòng)可以促進(jìn)脂肪代謝，減少脂肪堆積所帶來(lái)的病癥[11]。但是，相較于運(yùn)動(dòng)控食相結(jié)合，單純依靠節(jié)食和運(yùn)動(dòng)在減肥降脂方面的效果則不甚理想[12]?；谝陨戏治?，本實(shí)驗(yàn)采用熱水浸提法提取靈芝子實(shí)體粗多糖，然后去蛋白、分離純化得到靈芝多糖純品。采用高脂飼料飼喂法構(gòu)建高血脂癥小鼠模型，通過(guò)灌胃靈芝多糖結(jié)合有氧運(yùn)動(dòng)，評(píng)價(jià)其對(duì)小鼠高血脂癥的緩解作用。獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)能夠?yàn)槿斯ぴ耘囔`芝的藥理作用研究提供支撐，以期為靈芝多糖的降血脂作用研究及其在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

靈芝子實(shí)體 金華壽仙谷藥業(yè)有限公司主栽靈芝品種仙芝2號(hào)的靈芝子實(shí)體，經(jīng)張蕾[13]鑒定為赤靈芝（Ganodema lingzhi）。栽培模式：青岡樹(shù)段木栽培（批號(hào)：20190625）；昆明小鼠60只（SPF級(jí)，雄性，4周齡），體質(zhì)量14～16 g 購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0011；小鼠高脂飼料（含有1.5%的膽固醇和34%的蔗糖，編號(hào)D12451）、小鼠普通飼料（編號(hào)D12450B）、玉米芯墊料（編號(hào)：D12453C） 均購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

DEAE纖維素DE-52柱（貨號(hào)：S14024-500 g）源葉生物；甘油三酯（TG）試劑盒（批號(hào)：A054-1-1）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）試劑盒（批號(hào)：A082-3-1）、總膽固醇（T-CHO）試劑盒（批號(hào)：A032-1-1）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）試劑盒（批號(hào)：A016-1-1）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（批號(hào)：A001-3）、過(guò)氧化氫酶（CAT）試劑盒（批號(hào)：A007-1-1）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）試劑盒（批號(hào)：A006-2-1）、丙二醛（MDA）試劑盒（批號(hào)：A003-1-2）

均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；無(wú)水乙醇（CAS號(hào)：64-17-5）、甲醛溶液（CAS號(hào)：67-56-1）、磷酸鹽緩沖液（PBS，貨號(hào)：17202）等試劑 均購(gòu)自于西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；其余實(shí)驗(yàn)涉及試劑均為分析純級(jí)。

FD-1B-50真空冷凍干燥機(jī)（冷凝溫度?50 ℃）上海繼譜；Multiskan GO酶標(biāo)儀 Thermo賽默飛；離子濺射儀 英國(guó)Quotrue;FEG 250型掃描電鏡

美國(guó)Quanta；IX73倒置顯微鏡 日本Olympus；N1200-B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 東京理化；VOSHIN-1000W超聲波清洗器 無(wú)錫沃信；XR-PT-10A型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)（跑道長(zhǎng)580 mm、寬85 mm、高120 mm） 上海欣軟信息科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 靈芝多糖的提取 參考熊川等[14]的方法提取靈芝子實(shí)體多糖。將靈芝子實(shí)體置于37 ℃烘箱中恒溫鼓風(fēng)干燥12 h，干燥后的靈芝子實(shí)體切片，用中藥材粉碎機(jī)粉碎，過(guò)60目塞（孔徑0.25 mm）。稱(chēng)取1000 g靈芝子實(shí)體粉末，加入20 L 95%的乙醇浸泡過(guò)夜脫脂，離心除去浸泡液，粉末自然風(fēng)干。已脫脂的靈芝子實(shí)體粉末中加入蒸餾水（料液比為1:30），95 ℃水浴8 h，5000 r·min?1離心后收集上清液，重復(fù)操作3次，獲得足量上清液后減壓蒸餾濃縮。濃縮產(chǎn)物中加入無(wú)水乙醇醇沉（料液比1:9），醇沉12 h。5000 r·min?1離心收集醇沉產(chǎn)物并用適量蒸餾水溶解，進(jìn)一步通過(guò)Savage法除蛋白。配制Savage試劑（氯仿:正丁醇=4:1，V/V）并加入到粗多糖溶液中，振蕩后靜置分層，收集上層液體，重復(fù)操作直至蛋白除盡，除蛋白后的產(chǎn)物減壓蒸餾濃縮，經(jīng)7500 Da分子量透析袋流水透析，去除小分子雜質(zhì)，截留透析液并冷凍干燥得到靈芝粗多糖。

1.2.2 靈芝多糖分離純化 稱(chēng)取方法1.2.1冷凍干燥后得到的靈芝粗多糖樣品25 g，加入無(wú)菌蒸餾水250 mL，充分溶解后，4000 r·min?1條件下離心5 min，去掉下層沉淀，將上清液再經(jīng)0.45 μm膜過(guò)濾，隨之加入到柱層析DEAE纖維素DE-52柱中分離，洗脫液為0.5 mol·L?1NaCl，洗脫速度為1.5 mL/min，多管收集，每管10 mL，在45 ℃條件下將收集的洗脫液通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，濃縮至50 mL，再將濃縮液在冷凍干燥機(jī)上進(jìn)行冷凍干燥，得到多糖樣品備用。稱(chēng)取冷凍干燥后的樣品，溶解于無(wú)菌蒸餾水中，配制成25 mg·mL?1的多糖溶液，再將溶液上樣到Sephad凝膠柱（2.6 cm×100 cm）進(jìn)行分離，洗脫液為0.1 mol·L?1NaCl，流速為0.5 mL·min?1，分管連續(xù)收集30管，每管收集10 mL，苯酚硫酸法在490 nm處測(cè)定吸光值檢測(cè)樣品多糖含量[15]，45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，冷凍干燥得到多糖純品。

1.2.3 多糖形貌觀察 取質(zhì)量為1 mg的靈芝多糖置于附有銅膠帶的樣品臺(tái)，通過(guò)離子濺射儀在多糖樣品表面鍍上一層導(dǎo)電金粉，然后置于掃描電鏡下觀察。樣品在20.0 kV加速電壓下進(jìn)行檢查[16]，選擇清晰的視野100倍拍照。

1.2.4 多糖紅外光譜分析 參考彭天祥等[17]使用傅立葉紅外光譜儀對(duì)靈芝純化多糖的功能基團(tuán)進(jìn)行分析，掃描參數(shù)：掃描范圍4000～500 cm?1，掃描32次，分辨率為4 cm?1。

1.2.5 小鼠飼喂與處理 將60只昆明小鼠用普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，1周后再分為5組，每組12只。依次設(shè)定為正常喂養(yǎng)組（Control group，CG）、高脂喂養(yǎng)組（High-fat diet group，HD）、靈芝多糖組（Ganodema lingzhipolysaccharide group，GLP）、有氧運(yùn)動(dòng)組（Aerobic exercise control group，AE）和靈芝多糖與有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合組（Ganodema lingzhipolysaccharide combined with aerobic exercise control group，GLP/AE）。其中CG組飼喂普通飼料，其余4組飼喂高脂飼料，持續(xù)飼喂3周建模。依據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，從第4周開(kāi)始進(jìn)行多糖灌胃和有氧運(yùn)動(dòng)，其中GLP和GLP/AE組進(jìn)行靈芝多糖灌胃，劑量為2.0 g/kg/d，用無(wú)菌蒸餾水配制，灌胃體積1 mL，其余組灌胃相同量的生理鹽水。另外，AE組和GLP/AE組進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，每天持續(xù)運(yùn)動(dòng)1 h，速度10 m/min，跑臺(tái)坡度0°，每周5 d，周一至周五上午10點(diǎn)開(kāi)始，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行8周，在此期間所有小鼠自由飲水和進(jìn)食。

1.2.6 樣品收集與指標(biāo)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)處理結(jié)束后，小鼠禁食12 h（正常飲水），腹部注射2%戊巴比妥鈉溶液麻醉小鼠，采用引頸法處死小鼠，摘取眼球并及時(shí)取血，血液常溫存放2 h，后于4 ℃下，3000 r·min?1離心15 min，分離血清，將血清轉(zhuǎn)移至新EP管中并于?80 ℃條件下保存，備用；解剖摘取小鼠肝臟組織，用生理鹽水漂洗3次，用吸水紙吸干表面水分，置于?80 ℃下保存，備用。測(cè)定小鼠肝臟的重量及肝臟系數(shù)（Liver index，LI）。

式中，M為小鼠肝臟組織重量，單位為g，M0為小鼠最終體重，單位為g。

取小鼠血清，測(cè)定血清中抗氧化酶系活力，包括SOD、CAT、GSH-Px，同時(shí)測(cè)定MDA的濃度；血清中TC、TG、HDL-C和LDL-C的濃度，在此基礎(chǔ)上，計(jì)算動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)（Atherosclerosis index，AI）。

式中，CTC為血清中TC濃度，單位為mmol·L?1；CHDL-C為血清中HDL-C濃度，單位為mmol·L?1。

1.2.7 肝臟組織病理學(xué)觀察 參考曹智[18]的方法進(jìn)行肝臟組織染色制片。配制蘇木精染液、伊紅染液及1%的鹽酸乙醇分化液。選定肝臟組織，在同一位置上切取組織塊，修整成合適大小，流水沖洗12 h，依次進(jìn)行脫水透明，包埋修塊，脫蠟復(fù)水、染色封片后，于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，所得數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0軟件分析，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，通過(guò)t檢驗(yàn)，確認(rèn)差異的顯著性，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈芝多糖的電鏡觀察

冷凍干燥后的靈芝多糖得率為3.54%，純度95.62%，靈芝多糖的表面結(jié)構(gòu)如圖1，從圖中可以看出其呈現(xiàn)不規(guī)則的片狀結(jié)構(gòu)，表面不光滑，部分表面呈纖維絲狀，部分表面有凸起斑點(diǎn)，推測(cè)這些凸起斑點(diǎn)就是多糖粒子。張軍等[19]觀察到靈芝多糖表面有較多的皺褶，且表面有絲帶狀連接結(jié)構(gòu)，另外金鑫等[20]觀察到靈芝多糖呈現(xiàn)塊狀，塊狀中部分表面出現(xiàn)絨毛狀，這些多糖的表面結(jié)構(gòu)都與研究的靈芝多糖表面結(jié)構(gòu)相似。

圖1 靈芝多糖的形貌觀察Fig.1 Morphology of the polysaccharide isolated from Ganodema lingzhi

2.2 靈芝多糖紅外光譜分析

從圖2可以看出，靈芝多糖樣品的特征吸收峰主要出現(xiàn)在3365、2927、1656、1407、1075、876 cm?1處。相較于其他特征吸收峰值，在3365 cm?1處出現(xiàn)的特征吸收峰較寬，這是由O-H的伸縮振動(dòng)引起，因?yàn)槎嗵欠肿觾?nèi)的羥基間形成的氫鍵從而使特征吸收峰變寬[21]；在2927 cm?1處和1407 cm?1處出現(xiàn)的弱吸收峰是由C-H的伸縮振動(dòng)和變角振動(dòng)引起，這兩個(gè)特征吸收峰是典型的糖類(lèi)吸收峰，表明靈芝多糖內(nèi)含有-CH2和-CH3基團(tuán)[22]；在1656和1075 cm?1處出現(xiàn)了2個(gè)較強(qiáng)的吸收峰，出現(xiàn)這兩個(gè)吸收峰是由于多糖分子內(nèi)C-O伸縮振動(dòng)引起，一種情況是C-O-H伸縮振動(dòng)，另一種情況是出現(xiàn)了糖環(huán)鍵C-O-C伸縮振動(dòng)[23]；876 cm?1左右較小的吸收峰是典型的吡喃葡聚糖和β-型糖苷鍵連接特征吸收峰，說(shuō)明靈芝多糖含有β-吡喃糖苷鍵[24]。該結(jié)果表明靈芝多糖的異頭碳為β構(gòu)型。

圖2 靈芝多糖紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectrum of Ganodema lingzhi polysaccharide

2.3 各組小鼠生長(zhǎng)狀態(tài)分析

試驗(yàn)期間，所有動(dòng)物狀態(tài)良好，未出現(xiàn)死亡情況。各組小鼠間均未出現(xiàn)異常情況，飲食飲水正常。在1周普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)5組小鼠間體重差異不顯著（P>0.05），不會(huì)對(duì)后續(xù)試驗(yàn)和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)造成顯著性差異，見(jiàn)表1。在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，小鼠的體重逐步上升，通過(guò)高脂飼料飼喂組最先與其他各組出現(xiàn)顯著差異（P<0.05），2周時(shí)，高脂飼料組小鼠體重為（30.13±0.35）g，與正常飼喂組相比顯著升高（P<0.05）。第4周時(shí)，正常喂養(yǎng)組與其他處理組都出現(xiàn)顯著性差異（P<0.05），此外，與高脂飼養(yǎng)組相比，靈芝多糖組、有氧運(yùn)動(dòng)組及聯(lián)合組均出現(xiàn)顯著差異（P<0.05）。第6周時(shí)，高脂喂養(yǎng)組體重為（38.41±0.41）g，較正常組增加了31.45%，靈芝多糖組和有氧運(yùn)動(dòng)組能夠顯著降低高脂小鼠的體重（P<0.05），降幅分別為12.47%和10.75%，此外，6周的靈芝多糖和有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合處理，使得小鼠體重降幅為18.87%。在第8周時(shí)，與正常喂養(yǎng)組比較，高脂喂養(yǎng)組體重增加了32.95%，靈芝多糖組體重增加了21.95%，有氧運(yùn)動(dòng)組體重增加了19.19%，有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合靈芝多糖組增加了4.12%；相比高脂喂養(yǎng)組，靈芝多糖組、有氧運(yùn)動(dòng)組、靈芝多糖結(jié)合有氧運(yùn)動(dòng)組小鼠體重降幅分別為8.27%、10.35%和21.68%?？梢?jiàn)，靈芝多糖和有氧運(yùn)動(dòng)均能顯著降低小鼠的體重。

表1 靈芝多糖聯(lián)合有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠體重的影響Table 1 Effect of Ganodema lingzhi polysaccharides combined with aerobic exercise on body weight in mice

2.4 靈芝多糖聯(lián)合有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)高脂小鼠血脂水平的影響

靈芝多糖和有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)8周后，高脂小鼠的血脂水平如圖3所示。高脂飼料組（HD）的小鼠，其TC、TG及LDL-C的含量顯著高于普通飼喂組（CG組）（P<0.05），而HDL-C則顯著低于CG組。靈芝多糖結(jié)合有氧運(yùn)動(dòng)組（GLP/AE）對(duì)TC、TG及LDLC具有最好的清除作用，相較于HD組，其含量分別降低55.79%，22.54%及62.52%，而HDL-C含量則增加了21.23%。

圖3 靈芝多糖聯(lián)合有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)高脂小鼠血脂水平的影響Fig.3 Effect of Ganoderma lingzhi polysaccharide combined with aerobic exercise on the blood lipid level in hyperlipidemic mice

本實(shí)驗(yàn)中，高脂喂養(yǎng)將小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)顯著提升（表2），相較于正常喂養(yǎng)組，增加了近1倍。相較于高脂喂養(yǎng)組，靈芝多糖和有氧運(yùn)動(dòng)都能夠顯著降低動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)（P<0.05），聯(lián)合干預(yù)組則具有最好的降低效果。

表2 小鼠動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)Table 2 The atherosclerosis index (AI) in mice

2.5 靈芝多糖聯(lián)合有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)高脂小鼠內(nèi)源性抗氧化酶系活力的影響

高脂飼料的喂養(yǎng)引發(fā)小鼠的高血脂癥，高血脂癥的發(fā)生會(huì)對(duì)小鼠內(nèi)源性抗氧化酶系的活力造成損傷。從圖4中可以看出，相較于普通飼料的喂養(yǎng)（CG組），8周的高脂飼料處理，使得小鼠體內(nèi)的SOD、CAT和GSH-Px的活力依次降低為對(duì)照組的52.23%±2.47%、43.75%±1.88%和50.56%±3.02%，而MDA的含量則顯著上升（P<0.05），為對(duì)照組的262.68%±7.09%。靈芝多糖（GLP組）、有氧運(yùn)動(dòng)（AE組）及聯(lián)合處理組（GLP/AE組）都能重塑內(nèi)源性抗氧化酶系的活力，其中，靈芝多糖（GLP組）和聯(lián)合處理（GLP/AE組）效果較好。此外，有氧運(yùn)動(dòng)（AE組）及聯(lián)合處理組（GLP/AE組）對(duì)MDA含量的降低效果較好。

圖4 靈芝多糖聯(lián)合有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)高脂小鼠內(nèi)源性抗氧化酶系活力的影響Fig.4 Effect of Ganoderma lingzhi polysaccharide combined with aerobic exercise on the activity of endogenous antioxidant enzymes in hyperlipidemic mice

2.6 靈芝多糖結(jié)合有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)高脂小鼠肝臟重量及肝臟系數(shù)的影響

處理8周后的小鼠的肝臟重量和肝臟系數(shù)如表3所示。高脂喂養(yǎng)組小鼠肝臟重量和肝臟系數(shù)皆顯著高于正常組（P<0.05），肝臟重量增加了40.19%。靈芝多糖組小鼠肝臟重量也顯著高于正常喂養(yǎng)組（P<0.05），但顯著低于高脂喂養(yǎng)組（P<0.05），但靈芝多糖對(duì)高脂小鼠的肝臟系數(shù)未見(jiàn)明顯影響。有氧運(yùn)動(dòng)組、靈芝多糖結(jié)合有氧運(yùn)動(dòng)組肝臟重量和肝臟系數(shù)均顯著低于高脂喂養(yǎng)組（P<0.05），表明高脂喂養(yǎng)組小鼠肝臟受到損傷，出現(xiàn)了充血或水腫的情況，靈芝多糖組、有氧運(yùn)動(dòng)組和聯(lián)合組的肝系數(shù)分別較高脂喂養(yǎng)組降低了1.40%、2.68%和4.80%，其中有氧運(yùn)動(dòng)組和聯(lián)合組與高脂喂養(yǎng)組出現(xiàn)了顯著差異（P<0.05），表明靈芝多糖和有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)高脂小鼠肝充血和肝腫脹具有明顯改善作用。

表3 小鼠肝臟重量與肝臟系數(shù)Table 3 Liver weight and liver index in mice

2.7 靈芝多糖聯(lián)合有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)高脂小鼠肝臟組織細(xì)胞病理切片的影響

小鼠肝臟組織經(jīng)過(guò)蘇木精-伊紅染色（hematoxylineosin staining）后采用石蠟切片觀察，結(jié)果如圖5所示，正常喂養(yǎng)組（CG）的小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)完整（圖5 A），觀測(cè)發(fā)現(xiàn)小鼠肝細(xì)胞形態(tài)及大小正常，細(xì)胞質(zhì)均勻，未觀測(cè)到脂肪變性，細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有出現(xiàn)脂滴，幾乎觀察不到炎性細(xì)胞及細(xì)胞中的脂肪顆粒沉淀。高脂飼料處理后，小鼠肝細(xì)胞發(fā)生腫脹，細(xì)胞核偏移，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量的脂滴小空泡，提示肝臟脂肪變形較為嚴(yán)重（圖5 B）。通過(guò)靈芝多糖和有氧運(yùn)動(dòng)的干預(yù)，小鼠干細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)正常，細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量明顯減少，脂肪變性程度減輕（圖5 C～E），可見(jiàn)，補(bǔ)充靈芝多糖和有氧運(yùn)動(dòng)可以緩解或消除小鼠肝臟的炎癥癥狀，并降低脂肪組織中的脂肪分解。

圖5 小鼠肝臟組織病理學(xué)變化（100×）Fig.5 Pathology changes of liver in mice (100×)

3 討論

3.1 高脂飼料對(duì)小鼠高血脂癥的影響

高脂飼料的飼喂使得小鼠的體重快速增長(zhǎng)，第2周時(shí)的觀測(cè)數(shù)據(jù)顯示，所有處理組與正常喂養(yǎng)組皆存在顯著性差異（P<0.05），而處理組之間則未見(jiàn)顯著性差異（P>0.05），數(shù)據(jù)說(shuō)明多糖或有氧運(yùn)動(dòng)的處理需要一定的持續(xù)時(shí)間，短期的作用并不能緩解小鼠體重的異常增長(zhǎng)。此外，第6周時(shí)，靈芝多糖結(jié)合有氧運(yùn)動(dòng)組首次與多糖和運(yùn)動(dòng)單獨(dú)處理組出現(xiàn)差異，第8周時(shí)，多糖組、有氧運(yùn)動(dòng)組及多糖結(jié)合有氧運(yùn)動(dòng)組首次分別出現(xiàn)差異，且效果逐漸增強(qiáng)，可以推測(cè)，有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)于高脂小鼠體重異常增長(zhǎng)的抑制作用緩慢但效果較多糖更好，二者聯(lián)合處理則具有最好的效果。

飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠在一定程度上與人類(lèi)單純性肥胖的形成具有相似的發(fā)病機(jī)制，高脂飼料的喂養(yǎng)，會(huì)引起血脂升高及紊亂，進(jìn)而誘發(fā)一系列心血管疾病。血清中TC或TG水平過(guò)高或血漿中HDL-C水平過(guò)低，極易誘導(dǎo)動(dòng)脈內(nèi)皮損傷，使得其通透性增高，加速LDL-C在血管內(nèi)皮下沉積，進(jìn)而加速了動(dòng)脈硬化的形成[25]。已有研究證實(shí)，血清中TC及LDL-C的水平過(guò)高是導(dǎo)致心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，臨床研究確認(rèn)，TC和LDL-C水平的降低能有效地預(yù)防或減少心血管疾病的發(fā)生[26]。

此外，低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）是人體內(nèi)血漿固醇的主要載體，LDL-C含量過(guò)高，容易導(dǎo)致膽固醇在細(xì)胞內(nèi)，包括在血管內(nèi)皮細(xì)胞的堆積，這是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的主要原因之一[27]。AI指數(shù)是評(píng)判、衡量動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)的指標(biāo)，其意義大于單項(xiàng)血脂指標(biāo)[28]。本實(shí)驗(yàn)中，所設(shè)定的干預(yù)（靈芝多糖組、有氧運(yùn)動(dòng)組、靈芝多糖結(jié)合有氧運(yùn)動(dòng)組）皆能降低動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)，說(shuō)明靈芝多糖和有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)于高脂引發(fā)的動(dòng)脈粥樣硬化有一定的預(yù)防和治療作用。

3.2 高血脂癥的發(fā)生與氧化壓力

生物體內(nèi)源性抗氧化酶，包括超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）以及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）等，作為機(jī)體天然的抗氧化應(yīng)激防御系統(tǒng)的核心部分而存在[29]。其中，SOD水平反映了細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)的負(fù)荷，可間接反映細(xì)胞內(nèi)自由基的水平。由此推測(cè)，長(zhǎng)時(shí)間高脂飼料的喂養(yǎng)，使得小鼠體內(nèi)氧化壓力升高，此時(shí)小鼠細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶系明顯超過(guò)正常負(fù)荷，通過(guò)靈芝多糖和有氧運(yùn)動(dòng)的處理，SOD的活性部分得到恢復(fù)，說(shuō)明靈芝多糖和有氧運(yùn)動(dòng)能夠清除自由基，緩解高脂帶來(lái)的氧化壓力。GSH-Px通常可作為細(xì)胞抗氧化防御的核心成分，一般情況下是活性氧（ROS）的電子供體[30]，高脂飼料顯著抑制了GSH-Px的活力，而靈芝多糖及有氧運(yùn)動(dòng)能夠部分恢復(fù)，提示靈芝多糖及有氧運(yùn)動(dòng)可能作為另一種解毒系統(tǒng)，從而影響GSH的代謝，減輕高脂引起的氧化壓力對(duì)機(jī)體的損傷。MDA通常作為脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物，一方面能夠靈敏地反應(yīng)機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化的水平，另一方面，MDA會(huì)改變細(xì)胞膜的通透性，阻止細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)的流通，從而造成高脂血癥病情加重[31]。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)反應(yīng)，有氧運(yùn)動(dòng)組、靈芝多糖組和靈芝多糖結(jié)合有氧運(yùn)動(dòng)組均具有較好的MDA清除率?？傮w來(lái)看，靈芝多糖在重塑酶活上效果更好，而有氧運(yùn)動(dòng)的作用則主要體現(xiàn)在清除MDA上。

3.3 靈芝多糖與有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠肝臟的影響

肝臟是機(jī)體能量代謝的中心器官，脂肪代謝、蛋白質(zhì)代謝及糖類(lèi)物質(zhì)等代謝途徑中均有肝臟的參與，肝臟在脂類(lèi)的消化、吸收、運(yùn)輸、分解與合成等方面均起重要作用[32]。基于此，很多代謝性疾病的發(fā)生都可歸因于肝臟的病變。結(jié)合肝臟重量和肝臟系數(shù)分析可知，高脂喂養(yǎng)組（HD）中的小鼠由于大量脂類(lèi)物質(zhì)的攝入，肝臟已經(jīng)出現(xiàn)了脂質(zhì)代謝障礙，出現(xiàn)肝臟脂肪沉積，繼而引發(fā)肝臟脂肪性病變。從能量代謝來(lái)講，有氧運(yùn)動(dòng)（AE）對(duì)MDA清除及肝臟中脂滴的減少上具有較好的作用；而靈芝多糖（GLP）更多的是調(diào)節(jié)酶活，從源頭強(qiáng)化脂肪的代謝，這與傳統(tǒng)中醫(yī)中靈芝“扶正固本”的描述一致[33]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用靈芝多糖結(jié)合有氧運(yùn)動(dòng)來(lái)對(duì)高脂小鼠進(jìn)行降血脂的處理，實(shí)質(zhì)上起到了一種標(biāo)本兼治的作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，靈芝多糖結(jié)合有氧運(yùn)動(dòng)具有最好的降脂效果。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)提取分離純化得到的靈芝子實(shí)體多糖，通過(guò)高脂飼料喂養(yǎng)構(gòu)建高血脂小鼠模型，經(jīng)過(guò)靈芝多糖和有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，驗(yàn)證其對(duì)小鼠的降血脂和抗氧化作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示靈芝多糖能夠重塑小鼠內(nèi)源性抗氧化酶系活力，增強(qiáng)小鼠對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化引發(fā)的氧化損傷的抵御能力，而有氧運(yùn)動(dòng)能夠清除MDA，降低血液中TC、TG和LDL-C的含量，升高HDL-C的含量，二者聯(lián)合干預(yù)則能夠清除血脂，降低動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)，預(yù)防由于過(guò)量脂質(zhì)攝入而引發(fā)的肥胖和高血脂癥等疾病。因此，靈芝多糖有望作為一種減肥降脂的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)，而靈芝多糖結(jié)合有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)則能成為日常生活中預(yù)防“三高”的一種健康方式。