岳翠男，秦丹丹，李文金, ，吳華玲, ，蔡海蘭，李 琛，楊普香

（1.江西省蠶桑茶葉研究所，江西 南昌 330043；2.江西省茶葉質(zhì)量與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330043；3.江西省經(jīng)濟(jì)作物研究所，江西 南昌 330043；4.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，廣東 廣州 510640）

浮梁產(chǎn)茶歷史悠久，南北朝時(shí)期就已成為南方茶葉主要集散地，唐代詩(shī)人白居易的《琵琶行》中寫有“商人重利輕別離，前月浮梁買茶去”，素有“古茶市”之稱[1]。浮梁工夫紅茶，又“浮梁紅茶”，創(chuàng)制于清道光年間，簡(jiǎn)稱“浮紅”，其品質(zhì)特征干茶緊細(xì)，有鋒苗，茶湯紅亮，香氣呈甜香，時(shí)有玫瑰花香，芬芳馥郁持久，滋味鮮爽醇厚，回甘顯，葉底紅銅色，嫩勻整[2]。因其獨(dú)特風(fēng)味品質(zhì)特征，同祁紅與斯里蘭卡、大吉嶺紅茶統(tǒng)稱為世界三大高香茶，并在1915年的巴拿馬“萬(wàn)國(guó)博覽會(huì)”上榮獲金質(zhì)獎(jiǎng)?wù)潞酮?jiǎng)狀，足見(jiàn)其獨(dú)特品質(zhì)與國(guó)際地位[3]。茶葉特征性風(fēng)味品質(zhì)來(lái)源于其非揮發(fā)性與揮發(fā)性代謝物組分[4]。前期，蔡海蘭等[5]對(duì)浮梁紅茶的滋味物質(zhì)基礎(chǔ)與品質(zhì)評(píng)價(jià)進(jìn)行了探討。而關(guān)于浮梁紅茶的揮發(fā)性香氣組分與關(guān)鍵呈香物質(zhì)尚無(wú)研究，因此，研究浮梁紅茶的揮發(fā)性香氣組分對(duì)解析浮紅的特征性風(fēng)味品質(zhì)與品質(zhì)定向調(diào)控具有重要意義。

香氣是決定茶葉品質(zhì)的重要因素之一，對(duì)茶葉風(fēng)味、評(píng)判等級(jí)以及消費(fèi)者導(dǎo)向等都具有十分重要的作用。茶香是不同的揮發(fā)性物質(zhì)通過(guò)不同濃度組合，對(duì)嗅覺(jué)神經(jīng)綜合作用所形成的特有香型[6]。在茶葉的揮發(fā)性成分中存在少量關(guān)鍵呈香成分，對(duì)茶葉的風(fēng)味品質(zhì)具有重要影響[6]。目前，在眾多揮發(fā)性物質(zhì)檢測(cè)方法中，HS-SPME-GC-MS具有簡(jiǎn)單、快速、分析成本低及接近真實(shí)茶香等優(yōu)勢(shì)，在茶葉揮發(fā)性成分檢測(cè)中廣泛運(yùn)用[7]。OAV是揮發(fā)性物質(zhì)濃度與其對(duì)應(yīng)介質(zhì)中氣味閾值的比值，其值越大，說(shuō)明該物質(zhì)對(duì)呈香越重要，是關(guān)鍵呈香成分分析的重要手段，此方法可通過(guò)理論值的計(jì)算來(lái)表征揮發(fā)性物質(zhì)香氣的貢獻(xiàn)度[8]。多元統(tǒng)計(jì)分析方法中PCA能將重復(fù)和交互的變量進(jìn)行簡(jiǎn)化，用最關(guān)鍵的變量來(lái)解決復(fù)雜的問(wèn)題[9]?；诖?，本研究擬采用HS-SPME-GC-MS來(lái)定性與定量浮梁紅茶的揮發(fā)性組分，運(yùn)用OAV與PCA方法相結(jié)合篩選浮紅的關(guān)鍵呈香揮發(fā)性物質(zhì)，以期為解析浮紅的特征性風(fēng)味品質(zhì)與明確其香氣物質(zhì)前體提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

3份具有代表性的市售浮梁紅茶成品 分別購(gòu)買于浮梁縣3個(gè)不同的鄉(xiāng)鎮(zhèn)，其中，浮紅1生產(chǎn)于瑤里鎮(zhèn)，樣品標(biāo)準(zhǔn)為一芽一、二葉，生產(chǎn)時(shí)間為2019年4月上旬；浮紅2生產(chǎn)于西湖鄉(xiāng)，樣品標(biāo)準(zhǔn)為一芽二葉，生產(chǎn)時(shí)間為2019年4月中旬；浮紅3生產(chǎn)于江村鄉(xiāng)，樣品標(biāo)準(zhǔn)為一芽二、三葉，生產(chǎn)時(shí)間為2019年4月中旬；茶樹(shù)品種均為浮梁櫧葉群體種；各浮梁紅茶樣品的加工工藝流程為：鮮葉→萎凋→揉捻→發(fā)酵→干燥→提香→包裝；采購(gòu)的每個(gè)樣品采用統(tǒng)一規(guī)格的茶葉專用鋁箔袋包裝，存放于?4 ℃冰箱，用于揮發(fā)性成分檢測(cè)；癸酸乙酯（99%）Sigma公司。

Agilent 7890B-5977B_PAL RSI 120氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、DB-WAX色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm） 安捷倫科技（中國(guó)）有限公司；固相微萃取裝置SPME AllowCond、老化裝置Fiber Conditioning Station、樣品加熱箱Agitator 瑞士思特斯分析儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 頂空固相微萃取 將3份茶樣進(jìn)行粉碎，分別稱取1.5 g粉碎后的茶樣，放入20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，在進(jìn)樣瓶中加入20 μL癸酸乙酯（濃度為0.02 mg/mL），加入5 mL沸騰的蒸餾水。將上述進(jìn)樣瓶在60 ℃恒溫條件下振蕩15 min，振蕩器速度控制為450 r/min（時(shí)間為5 s開(kāi)，2 s關(guān)），使用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭（Sigma公司）萃取，萃取頭萃取前先在Fiber Conditioning Station中老化2 h，采樣前后分別在Fiber Conditioning Station中加熱解吸去雜10 min，將萃取頭插入進(jìn)樣瓶頂空部分，萃取60 min，在250 ℃下解析5 min，最后采用GC-MS鑒定[10]。每個(gè)樣品采用3次重復(fù)。

1.2.2 色譜與質(zhì)譜條件 GC-MS設(shè)備為Agilent 7890B-5977B（GC-MS）PAL RSI 120。色譜條件：采用DB-WAX毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm，Agilent J&W Scientific，F(xiàn)olsom，CA，USA），載氣使用高純氦氣（純度大于99.999%），進(jìn)樣口溫度為260 ℃，恒流流速為1.0 mL/min，不分流進(jìn)樣，溶劑延遲為1.5 min。程序升溫以40 ℃保持3 min，以4 ℃/min升至220 ℃，保持10 min。質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源（EI），離子源溫度為230 ℃，質(zhì)譜接口溫度為280 ℃，四極桿溫度為150 ℃，檢測(cè)器電壓為901 V，電子能量為70 eV，掃描方式使用全掃描模式（SCAN），質(zhì)量掃描范圍為20～650 m/z。

1.2.3 揮發(fā)性成分定性 將GC-MS分析得到的各色譜峰的質(zhì)譜圖在鹿明生物自主研發(fā)的LUG數(shù)據(jù)庫(kù)Lumingbio進(jìn)行相似度比對(duì)，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖和保留時(shí)間對(duì)各峰進(jìn)行確認(rèn)，以比對(duì)相似度大于90%作為鑒定標(biāo)準(zhǔn)，獲得定性揮發(fā)性化合物[10]。

1.2.4 揮發(fā)性成分定量 采用內(nèi)標(biāo)癸酸乙酯定量香氣成分，每個(gè)揮發(fā)性成分的含量按照公式（1）計(jì)算：

式中：Wi表示每個(gè)揮發(fā)性成分的含量（μg/kg）；Si表示揮發(fā)性成分的峰面積；Mis表示內(nèi)標(biāo)癸酸乙酯的質(zhì)量（μg/kg）；Sis表示內(nèi)標(biāo)癸酸乙酯的峰面積；Mi表示樣品的質(zhì)量（kg）[11?12]。

1.2.5 氣味活度值計(jì)算 OAV為揮發(fā)性化合物質(zhì)量濃度與該物質(zhì)嗅覺(jué)閾值的比值，按公式（2）計(jì)算：

式中：Oi表示揮發(fā)性成分的氣味活度值；Wi表示每個(gè)揮發(fā)性成分的含量（μg/kg）；Qi表示每個(gè)揮發(fā)性成分在參考文獻(xiàn)中的氣味閾值（μg/kg）[13?14]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

揮發(fā)性成分百分比圖采用Origin 2018制作；采用SPSS 19.0進(jìn)行LSD方差分析，采用The Unscrambler Version 9.7進(jìn)行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 浮梁紅茶揮發(fā)性物質(zhì)組分分析

浮梁紅茶的揮發(fā)性組分總離子流圖見(jiàn)圖1，其揮發(fā)性成分定性定量及香氣類型描述見(jiàn)表1。浮梁紅茶揮發(fā)性成分總量為6268.60～9123.38 μg/kg，均值為7899.32 μg/kg，其中樣品浮紅2的揮發(fā)性成分含量最高，浮紅1的最低。在浮梁紅茶中共檢測(cè)到73種揮發(fā)性成分，包括醇類16種、酯類12種、碳?xì)浠衔?1種、酮類10種、醛類9種、酸類6種、雜環(huán)類6種和酚類及其衍生物3種。差異性分析顯示在檢測(cè)到的揮發(fā)性化合物中44種無(wú)顯著性差異（P>0.05），29種在部分樣品之間存在顯著性差異（P<0.05），說(shuō)明此44種無(wú)顯著性差異的揮發(fā)性成分為浮紅的基本香氣成分，如芳樟醇、2-呋喃甲醇、Z-3-己烯-1-醇、水楊酸甲酯、2-甲基吡嗪等，以酸類、酮類、酯類和雜環(huán)類居多；存在顯著性差異的29種揮發(fā)性成分是讓浮紅產(chǎn)生品質(zhì)差異（花香、甜香、蜜香、木香等）的主要原因，如香葉醇、橙花醇、苯乙醇、苯乙醛、α-紫羅酮等，以醇類和醛類居多。

表1 浮梁紅茶的揮發(fā)性物質(zhì)及定量結(jié)果（μg/kg）Table 1 Volatile compounds and quantitative results of Fuliang black tea (μg/kg)

圖1 3份浮梁紅茶揮發(fā)性成分總離子流圖Fig.1 Total ion flow diagram of volatile components in three Fuliang black teas

從浮紅揮發(fā)性成分含量上來(lái)看，含量較高的成分為香葉醇、苯乙醇、水楊酸甲酯、苯甲醇、反式芳樟醇氧化物（呋喃型）、己酸、芳樟醇、二氫芳樟醇、α-紫羅酮、苯甲醛、羅勒烯、苯乙醛、2-呋喃甲醇和香葉基丙酮，其中，香葉醇含量為1631.0～2937.8 μg/kg，均值為2444.84 μg/kg；苯乙醇含量為906.46～

1740.25 μg/kg，均值為1308.7 μg/kg；水楊酸甲酯含量為705.74～967.18 μg/kg，均值為843.79 μg/kg，這些成分的香型均為典型的甜香、花香、果香、蜜香等。竹尾忠一對(duì)中國(guó)工夫紅茶香氣特征進(jìn)行研究，表明閩紅與祁紅的香葉醇含量高，兩廣地區(qū)紅茶芳樟醇及其氧化物含量較高，把紅茶分為三種類型，第一種是以芳樟醇及其氧化物為主，第二種是中間型，以芳樟醇和香葉醇為主，第三種類型是以香葉醇為主[15]。由此來(lái)看，浮紅與閩紅和祁紅在高揮發(fā)性成分含量上相似，均以香葉醇為主，在分類屬于第三種類型，在香氣上均有較強(qiáng)的甜香、花香[2]。

從揮發(fā)性成分香氣類型描述上來(lái)看，對(duì)浮紅香氣風(fēng)味品質(zhì)呈正貢獻(xiàn)（甜香、花香、果香、清香、焙烤香等）的有57種、對(duì)香氣風(fēng)味品質(zhì)有負(fù)貢獻(xiàn)的（苦辣氣味、刺激臭味、苦杏仁味、青氣、粗老氣、酸味）有16種，以刺激性酸味的酸類物質(zhì)為主。這些呈負(fù)貢獻(xiàn)的物質(zhì)在浮梁紅茶中含量相比與正貢獻(xiàn)成分的含量和數(shù)量明顯較少，這可能是浮梁紅茶香氣整體呈甜香、花香且馥郁持久的重要原因，但在浮紅加工過(guò)程中，應(yīng)最大可能地降低這些負(fù)貢獻(xiàn)物質(zhì)的含量，增加正貢獻(xiàn)物質(zhì)的含量。

續(xù)表 1

2.2 浮梁紅茶揮發(fā)性物質(zhì)種類分析

浮梁紅茶揮發(fā)性成分的種類占比見(jiàn)圖2，共分為8類，此8類共同構(gòu)成了浮紅的香氣特征，其中以醇類含量最高，占揮發(fā)性成分的64%～71%，其次為酯類，占揮發(fā)性成分的10%～18%，依次為醛類（5%～6%）、酸類（5%）、酮類（3%～5%）、碳?xì)浠衔镱悾?%）、酚類及其衍生物（0～1%）和雜環(huán)類（0～1%）。肖作兵等[19]在坦洋工夫紅茶、宜昌工夫紅茶、祁門工夫紅茶、滇紅工夫紅茶中共檢測(cè)到揮發(fā)性成分75～77種，4種工夫紅茶醇類物質(zhì)含量最高，其次是醛類、酯類。尹鵬等[20]在信陽(yáng)紅中檢測(cè)到88種揮發(fā)性成分，醇類含量最高，其次為醛類、酯類、酮類。與此相比，浮紅也以醇類含量最高，不同的是，浮紅的酯類含量比醛類、酸類和酮類的含量都高，這可能是浮紅特征性香氣與其他工夫紅茶香氣產(chǎn)生差異的主要原因。不同浮紅樣品之間存在部分差異，浮紅2在3個(gè)樣品中醇類含量占比最高，酯類含量占比最低；浮紅1在3個(gè)樣品中酯類含量占比最高，醇類含量占比最低，浮紅3介于兩者之間。3個(gè)樣品來(lái)源于不同的鄉(xiāng)鎮(zhèn)，但品種與加工工藝相同，由此來(lái)看，浮梁縣不同區(qū)域的地理微環(huán)境可對(duì)浮紅香氣物質(zhì)種類和含量產(chǎn)生一定的影響，進(jìn)而影響其品質(zhì)特征，進(jìn)一步需擴(kuò)大樣本并結(jié)合分子感官科學(xué)技術(shù)探討其差異機(jī)理。

圖2 浮梁紅茶的揮發(fā)性組分種類Fig.2 Types of volatile components in Fuliang black tea

2.3 浮梁紅茶揮發(fā)性物質(zhì)的OAV分析

揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)工夫紅茶特征風(fēng)味的貢獻(xiàn)不僅與該物質(zhì)在茶湯中的質(zhì)量濃度有關(guān)，其閾值也是非常重要的參考依據(jù)[21]。OAV是香氣化合物質(zhì)量濃度與閾值的比值，可以表明單一揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)風(fēng)味的貢獻(xiàn)度。一般認(rèn)為OAV不小于1的化合物為呈香的重要物質(zhì)[22]。通過(guò)對(duì)73種揮發(fā)性成分中已明確閾值的查詢與計(jì)算，發(fā)現(xiàn)其中15種揮發(fā)性成分的OAV不小于1，結(jié)果見(jiàn)表2。15種揮發(fā)性成分的OAV在10以上的由高到低依次為香葉醇、α-紫羅酮、芳樟醇、苯乙醛和水楊酸甲酯；OAV在1到10之間的由高到低依次為苯甲醇、香葉基丙酮、反式芳樟醇氧化物（呋喃型）、檸檬醛、2-甲基吡嗪和2-正戊基呋喃；OAV在部分樣品中OAV不小于1的由高到低依次為香葉基丙酮、二氫芳樟醇、苯乙醇、反式-橙花叔醇和正己醛。

表2 浮梁紅茶中主要香氣化合物的閾值與氣味活度值Table 2 Threshold values and OAV of main aroma compounds in Fuliang black tea

香葉醇在浮紅中含量最高，其閾值相對(duì)較低（40 μg/kg），所以其OAV最高，前人研究結(jié)果表明香葉醇是祁門紅茶、大吉嶺紅茶、信陽(yáng)紅、滇紅及安吉紅茶的重要香氣成分[6,23?24]；α-紫羅酮在浮紅中含量中等，但其閾值極低（2.6 μg/kg），所以O(shè)AV相對(duì)較高，α-紫羅酮在Kangra正統(tǒng)紅茶、碧螺春和青磚茶中均是重要香氣成分[6]；芳樟醇、苯乙醛和水楊酸甲酯均是信陽(yáng)紅、滇紅的重要香氣成分[6]。2-正戊基呋喃、檸檬醛、二氫芳樟醇、正己醛在其他工夫紅茶中的OAV小于1[20]，但在浮紅中OAV大于1。此外這些重要香氣成分來(lái)源于不同的香氣前體，其中香葉醇、水楊酸甲酯、苯甲醇、反式芳樟醇氧化物（呋喃型）和苯乙醇的香氣前體物質(zhì)為糖苷；芳樟醇的香氣前體物質(zhì)為糖苷和類胡蘿卜素；α-紫羅酮、香葉基丙酮、反式-橙花叔醇的香氣前體物質(zhì)為類胡蘿卜素；苯乙醛和2-甲基吡嗪來(lái)源于美拉德反應(yīng)[25?27]。

因OAV是單一物質(zhì)在水溶液中人們能夠識(shí)別到的最低濃度，但在茶湯中存在大量的代謝產(chǎn)物，物質(zhì)之間存在復(fù)雜的協(xié)同、加和、抑制等交互作用[28]。因此在篩選關(guān)鍵呈香物質(zhì)時(shí)，需進(jìn)一步結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析方法，明確各重要揮發(fā)性成分的貢獻(xiàn)度。

2.4 浮梁紅茶關(guān)鍵呈香物質(zhì)分析

在分子感官科學(xué)中建立的變量之間往往有一定的相關(guān)關(guān)系，當(dāng)兩個(gè)變量之間有一定相關(guān)關(guān)系時(shí)，可以解釋為這兩個(gè)變量反映此問(wèn)題的信息有一定的重疊[30]。主成分分析是對(duì)于原先提出的所有變量，將重復(fù)或交互的變量刪去多余，建立盡可能少的新變量，使得這些新變量是兩兩不相關(guān)的，而且這些新變量在反映問(wèn)題的信息方面盡可能保持原有的信息[31]。因此主成分分析能夠應(yīng)用在分子感官科學(xué)中篩選關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)。

對(duì)浮紅中15種香氣活度值大于1的揮發(fā)性成分進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見(jiàn)圖3和圖4，主成分分析中提取了前2個(gè)主成分，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到100%，其中主成分1的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到94%，主成分2的累計(jì)貢獻(xiàn)率為6%。在圖3中，大橢圓（R2=1.0）表示100%的解釋方差，小橢圓（R2=0.5）表示50%的解釋方差，如有成分處于小橢圓之內(nèi)，說(shuō)明此成分不能被主成分解釋[28]。15個(gè)揮發(fā)性成分均在大橢圓的邊緣，表示能夠100%解釋，表明這些成分對(duì)浮紅的香氣均有貢獻(xiàn)。以各主成分中載荷值在0.9以上的香氣成分作為浮梁紅茶的關(guān)鍵呈香物質(zhì)（圖4），按照載荷值大小依次為檸檬醛、苯甲醇、香葉醇、α-紫羅酮、反式-橙花叔醇、香葉基丙酮、苯乙醇、水楊酸甲酯、正己醛、芳樟醇和2-甲基吡嗪等11種，其中香葉醇、芳樟醇、苯乙醇的香氣類型主要為甜香，玫瑰花香等，檸檬醛、正己醛、α-紫羅酮、香葉基丙酮和水楊酸甲酯的香氣類型為果香、木香等，2-甲基吡嗪為典型的焙烤香。此結(jié)論與浮紅的香氣特征描述（香氣芬芳馥郁持久，有明顯的甜香，有時(shí)帶有玫瑰花香[2]）相近。

圖3 浮梁紅茶主要香氣成分主成分分析載荷圖Fig.3 Load chart of PCA of main aroma components in Fuliang black tea

圖4 浮梁紅茶主要香氣成分主成分分析的載荷值Fig.4 Load value of PCA of main aroma components in Fuliang black tea

3 結(jié)論

采用HS-SPME-GC-MS方法從選用的浮梁紅茶樣品中共鑒定到73種揮發(fā)性成分，總量均值為7899.32 μg/kg，以醇類含量最高，其次為酯類、醛類、酸類、酮類、碳?xì)浠衔镱悺⒎宇惣捌溲苌锖碗s環(huán)類，其中，29種成分在樣品之間存在顯著性差異（P<0.05）。揮發(fā)性成分中對(duì)浮梁紅茶香氣風(fēng)味呈正相關(guān)的有57種、有負(fù)相關(guān)的有16種，以刺激性的酸類物質(zhì)為主。15種揮發(fā)性成分的OAV大于1，以香葉醇、α-紫羅酮和芳樟醇的最高。使用OAV與PCA綜合篩選出檸檬醛、苯甲醇、香葉醇、α-紫羅酮、反式-橙花叔醇、香葉基丙酮、苯乙醇、水楊酸甲酯、正己醛、芳樟醇和2-甲基吡嗪等11種為浮梁紅茶的關(guān)鍵呈香物質(zhì)。本研究初步明確了浮梁紅茶的揮發(fā)性香氣組分與關(guān)鍵呈香物質(zhì)，后續(xù)將進(jìn)一步使用分子感官科學(xué)與代謝組學(xué)相結(jié)合解析浮梁紅茶的特征性風(fēng)味品質(zhì)及其香氣物質(zhì)前體。