葉灝鐸，苗建銀, ，李龍星，黃嘉芹，劉本英，孫云南，鄒 琴，曹 庸

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院廣東省功能食品活性物重點實驗室，廣東 廣州 510642；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所云南省茶學(xué)重點實驗室，云南勐海 666201；3.廣東科貿(mào)職業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，廣東 廣州 510000）

高脂血癥，尤其是高膽固醇血癥是心臟病和缺血性心臟病最主要的危險因素之一[1]。高脂血癥是由于體內(nèi)脂質(zhì)代謝或轉(zhuǎn)運異常導(dǎo)致的一種慢性疾病，主要表現(xiàn)為體內(nèi)甘油三酯或膽固醇水平過高[2]。近年來，隨著人們生活水平的提高和飲食習(xí)慣的改變，高脂血癥患者比例急劇上升，中國成人血脂異?？傮w患病率高達41.90%[3]，已經(jīng)成為現(xiàn)代社會高發(fā)病率之一的疾病[4?5]。傳統(tǒng)的降血脂藥物如他汀類[6]、貝特類等，價格昂貴、服用周期長，且往往具有一定的臨床副作用[7]。從天然產(chǎn)物中開發(fā)出安全有效的降血脂活性成分成為當(dāng)下的研究熱點[8]，如火麻籽降脂肽[9]，駝乳蛋白降脂肽[10]和可可種子蛋白降脂肽[11]等。

茶葉在我國具有豐富的原料資源，飲茶以及茶文化也有數(shù)千年的歷史[12]。茶葉中含有大量有益于人體健康的物質(zhì)[13]，長期飲用有助于延緩衰老，降低血壓血脂。近年來不斷擴大的茶飲料加工過程中產(chǎn)生大量茶渣廢棄物[14]，廢棄的茶渣中還含有18%～20%的粗蛋白[15]，茶葉蛋白質(zhì)有比較合理的氨基酸組成，是優(yōu)質(zhì)的植物蛋白[16]，作為營養(yǎng)和功能性成分在食品工業(yè)中有良好的應(yīng)用前景[17]。但目前關(guān)于茶葉蛋白肽的深度開發(fā)和研究較少，若能對茶渣中存留的蛋白等營養(yǎng)物質(zhì)進行高值化利用開發(fā)，將創(chuàng)造巨大的經(jīng)濟效益和社會效益[18]。勐庫大葉茶是原產(chǎn)于云南省雙江縣勐庫鎮(zhèn)的有性系國家良種，是云南大葉種的代表性品種，其具有生長力強、芽葉生育力強和持嫩性強等特點，并且茶葉內(nèi)含物質(zhì)豐富，萌發(fā)期早、產(chǎn)量高，可大量采集和加工，是目前云南茶葉加工中的主要資源品種[19?20]。目前，對勐庫大葉種茶的研究大多集中于茶葉加工[21]、茶葉水浸出物[22]以及茶葉中的多酚氧化酶[23]等，而對茶葉或茶渣中含量較高的蛋白資源研究較少，這在一定程度上造成了資源的浪費。茶葉中優(yōu)質(zhì)的植物蛋白可以進一步開發(fā)制備成功能性多肽，值得深入研究。

本研究以勐庫大葉茶為原料，通過堿提酸沉獲得茶葉蛋白，以膽酸鹽結(jié)合率為指標(biāo)，采用酶解法制備茶葉蛋白降血脂肽，并對其進行降血脂活性檢測和氨基酸組成分析。本研究有助于茶葉蛋白資源的高值化利用，為相關(guān)健康食品的開發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

勐庫大葉茶凍干茶葉 云南省茶學(xué)重點實驗室提供；胃蛋白酶（3×106U/mg）、中性蛋白酶（1×105U/g）、胰蛋白酶（2.5×105U/g）、木瓜蛋白酶（2×105U/g） 南寧龐博生物工程有限公司；牛磺膽酸鈉（STC）、豬胰脂肪酶（90 U/mg）、對硝基苯基月桂酸酯（pNP月桂酸酯）、對硝基苯基丁酸酯（PNPB） 上海麥克林生化有限公司；膽固醇酯酶（150 U/mg）上海源葉生物科技有限公司；其他化學(xué)品和試劑均為分析純。

AL104電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；PHS-3C臺式pH計 上海佑科儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市華城海龍實驗儀器廠；L530臺式低速自動平衡離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；2300多功能酶標(biāo)儀PerkinElmer公司；FD-1型冷凍干燥機 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；DH5000BII電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津泰斯特儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 勐庫大葉茶蛋白的提取 基于堿提酸沉的原理，參考王忠英[24]的方法進行勐庫大葉茶蛋白的提取。勐庫大葉茶葉粉碎后過20目篩，稱取一定量粉碎的茶葉，以固液比1:40（g:mL）加入0.1 mol/L的NaOH溶液，45 ℃下水浴4 h后過濾，并以4000 r/min離心20 min，收集上清液并用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至4.5，靜置20 min后，再以4000 r/min離心20 min。棄去上清，收集蛋白沉淀，冷凍干燥后即得勐庫大葉茶蛋白粗提物。

1.2.2 勐庫大葉茶蛋白肽的制備 參考鄭天芝[25]的方法進行茶葉蛋白肽的制備，將一定量的勐庫大葉茶蛋白粗提物加入適量蒸餾水配成溶液，調(diào)節(jié)pH后加入一定量的酶，一定溫度下恒溫水浴酶解一定時間后于沸水中滅酶10 min，冷卻至室溫，4000 r/min離心20 min，收集上清液即為含有多肽的酶解液。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 蛋白酶的篩選 選取實驗室常用的4種蛋白酶分別在其最適條件下對勐庫大葉茶蛋白進行酶解，胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和中性蛋白酶四種蛋白酶的pH和溫度分別為8.0、37 ℃；6.5、55 ℃；1.5、37 ℃；和7.0、45 ℃。在底物濃度為3%，酶底比為0.3%的條件下，酶解3 h，滅酶，離心，取上清酶解液測定膽酸鹽結(jié)合率，選擇最優(yōu)的蛋白酶。

1.2.3.2 酶解時間對酶解物活性的影響 在底物濃度為3%，酶底比為0.3%，pH1.5，37 ℃條件下，用胃蛋白酶進行酶解，以?；悄懰徕c結(jié)合能力為指標(biāo)，考察酶解時間（1、2、3、4、5 h），對酶解液活性的影響并確定最佳酶解時間條件。

1.2.3.3 酶解溫度對酶解物活性的影響 在底物濃度為3%，酶底比為0.3%，pH1.5條件下，用胃蛋白酶酶解3 h，以?；悄懰徕c結(jié)合能力為指標(biāo)，考察酶解溫度（32、37、42、47、52 ℃），對酶解液活性的影響并確定最佳酶解溫度條件。

1.2.3.4 pH對酶解物活性的影響 在底物濃度為3%，酶底比為0.3%，37 ℃條件下，用胃蛋白酶酶解3 h，以?；悄懰徕c結(jié)合能力為指標(biāo)，考察pH（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0），對酶解液活性的影響并確定最佳pH條件。

1.2.3.5 酶底比對酶解物活性的影響 在底物濃度為3%，pH1.5，37 ℃條件下，用胃蛋白酶酶解3 h，以?；悄懰徕c結(jié)合能力為指標(biāo)，考察酶底比（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%），對酶解液活性的影響并確定最佳酶底比條件。

1.2.3.6 底物濃度對酶解物活性的影響 在酶底比為0.3%，pH1.5，37 ℃條件下，用胃蛋白酶酶解3 h，以?；悄懰徕c結(jié)合能力為指標(biāo)，考察底物濃度（1%、2%、3%、4%、5%），對酶解液活性的影響并確定最佳底物濃度條件。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗 在單因素實驗基礎(chǔ)上，以pH、底物濃度和酶底比為自變量，以膽酸鹽結(jié)合率為響應(yīng)值，設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面試驗。響應(yīng)面實驗設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平設(shè)計Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.5 膽酸鹽結(jié)合率的測定 參考李成龍[26]的方法檢測體外膽酸鹽結(jié)合能力，并略有修改。將1 mL待測樣品轉(zhuǎn)移至帶塞離心管中。每管加入1 mL 0.01 mol/L HCl溶液以模擬人體胃酸環(huán)境，37 ℃振蕩水浴孵育1 h。之后，用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH至6.3后加入5 mL配制好的?；悄懰徕c（STC）標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 mmol/L），5 mL 磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH6.3）添加到空白管中。37 ℃恒溫振蕩1 h后，以4000 r/min離心20 min，然后將2.5 mL上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入7.5 mL 60%硫酸溶液，在70 ℃下孵育30 min后冷卻至室溫。最后在387 nm波長處測量每個樣品的吸光度。每個樣品重復(fù)分析三次，通過膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線測定數(shù)值，標(biāo)準(zhǔn)曲線由溶液濃度為1 mmol/L，體積分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL的?；悄懰徕c溶液制定。使用下式計算膽酸鹽結(jié)合率：

式中：C0是膽酸鹽空白（不含肽）的濃度，μmol/mL；C1是添加肽后上清液中膽酸鹽的濃度，μmol/mL。

1.2.6 勐庫大葉茶蛋白肽降血脂活性分析

1.2.6.1 勐庫大葉茶蛋白肽對膽酸鹽的吸附能力通過最優(yōu)工藝條件得到的酶解液，冷凍干燥后，用磷酸緩沖溶液配制成不同濃度的樣品溶液（0.25、0.5、

1、2、4 mg/mL），分別測定膽酸鹽結(jié)合率，并測定EC50值，即膽酸鹽結(jié)合率達到50%時的多肽濃度。

1.2.6.2 勐庫大葉茶蛋白肽對胰脂肪酶的抑制作用參照萬林[27]的方法并略作修改，檢測勐庫大葉茶蛋白酶解物對胰脂肪酶的抑制作用。Ⅱ型豬胰脂肪酶用一級水配制成5 mg/mL，取一定量的反應(yīng)底物對硝基苯基月桂酸酯（pNP月桂酸酯）溶解于含1%Triton X-100的0.05 mol/L醋酸鈉水溶液中，配成0.1%（w/v）的pNP月桂酸酯溶液，將配好的溶液置于熱水中加速溶解，完全混勻溶解后室溫冷卻備用。酶解物用Tris-HCl緩沖溶液（0.1 mol/L，pH8.2）配置成濃度為0.25、0.5、1、2、4 mg/mL的溶液。于離心管中加入250 μL的反應(yīng)底物，100 μL樣品溶液和200 μL反應(yīng)緩沖液，最后加入150 μL脂肪酶溶液啟動反應(yīng)。置于37 ℃反應(yīng)2 h后10000 r/min離心1 min，在420 nm波長下測上清液的吸光值。空白對照將樣品換成緩沖溶液，樣品對照將脂肪酶溶液換成反應(yīng)緩沖液。計算脂肪酶抑制率，并求出IC50值，按以下公式計算：

式中：A1為樣品上清液的吸光值；A2為樣品對照上清液的吸光值；A0為空白上清液的吸光值。

1.2.6.3 勐庫大葉茶蛋白肽對膽固醇酯酶的抑制作用 參照蘇建輝等[28]的方法并略做修改，檢測勐庫大葉茶蛋白酶解物對膽固醇酯酶的抑制作用。豬胰腺膽固醇酯酶用一級水配制成4.2 μg/mL，所有的反應(yīng)在含有NaCl（0.1 mol/L）、對硝基苯基丁酸酯PNPB（0.2 mmol/L）和?；悄懰徕cSTC（5.16 mmol/L）的磷酸鈉緩沖液（0.1 mol/L，pH7.0）中進行。于離心管中加入10 μL反應(yīng)底物PNPB（0.2 mmol/L），25 μL的樣品溶液和1 mL緩沖液，最后加入50 μL膽固醇酯酶溶液啟動反應(yīng)，25 ℃反應(yīng)5 min，在405 nm處測量吸光值?？瞻坠苡靡患壦鏄悠啡芤海瞻讓φ展苡靡患壦婷敢汉蜆悠啡芤?，背景對照管用一級水代替酶液。計算膽固醇酯酶抑制率，并求IC50值，按下式計算：

式中：A為空白管的吸光值；B為空白對照管的吸光值；C為樣品管的吸光值；D為背景對照管的吸光值。

1.2.7 氨基酸組成測定 采用GB 5009.124－2016《食品中氨基酸的測定》，測定最優(yōu)酶解物中的氨基酸組成[29]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗至少進行三次重復(fù)。使用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。采用Design Expert 8.0.6.1軟件進行響應(yīng)面優(yōu)化實驗設(shè)計和分析。采用單因素方差分析（ANOVA）分析樣品間差異的顯著性（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 蛋白酶的篩選 由于不同的蛋白酶具有不同的特異性，為了獲得具有較好生物活性的蛋白質(zhì)水解物和多肽，應(yīng)考慮酶的選擇和加工條件[30]。本研究分別采用胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶從勐庫大葉茶蛋白中制備蛋白質(zhì)水解物，結(jié)果如圖1所示。胃蛋白酶水解物與其他蛋白酶水解物相比具有最高的膽酸鹽結(jié)合能力，其結(jié)合?；悄懰徕c的能力為（65.91%±1.21%）?？赡苁怯捎谄涿盖形稽c更有利于降血脂水解物的生成[2]，制備豆清夜肽[31]和鷹嘴豆肽[32]時，也都采用了胃蛋白酶進行酶解，可見胃蛋白酶比較適宜酶解植物蛋白。因此，后續(xù)實驗將采用胃蛋白酶進行蛋白質(zhì)水解物的制備。

圖1 蛋白酶種類對酶解物?；悄懰徕c結(jié)合率的影響Fig.1 Effect of protease types on the binding rate of sodium taurocholate

2.1.2 酶解時間對酶解物活性的影響 不同酶解時間對酶解物活性的影響如圖2所示。從圖中可以看出，勐庫大葉茶蛋白水解物結(jié)合?；悄懰徕c的能力隨著酶解時間的延長出現(xiàn)先升后降趨勢，酶解3 h得到的酶解液活性最強，?；悄懰徕c結(jié)合率為（66.46%±0.29%）。這可能是因為隨著反應(yīng)的進行，酶解逐漸徹底，多肽含量增加，多肽與蛋白質(zhì)出現(xiàn)競爭性抑制作用，而酶活力可能隨著體系的改變而降低[31]。4 h酶解物的?；悄懰徕c結(jié)合能力與3 h接近，但無顯著性差異（P>0.05），考慮到酶解時間過長會增加能耗，因此，確定最佳酶解時間為3 h。

圖2 酶解時間對酶解物?；悄懰徕c結(jié)合率的影響Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis time on the binding rate of sodium taurocholate

2.1.3 酶解溫度對酶解物活性的影響 如圖3所示，當(dāng)溫度達到37 ℃時，酶解物結(jié)合牛磺膽酸鈉的能力達到最高值（68.10%±0.36%），隨后逐漸下降。這可能是由于受到酶活力的影響，胃蛋白酶的最適水解溫度為35～45 ℃，在此范圍內(nèi)的酶活力最高。此外，溫度的升高可以使分子的熱運動加快，溶劑的溶解能力也會隨之增大，從而達到良好的溶質(zhì)擴散和溶劑滲透效果，產(chǎn)出高活性的酶解物。但溫度過高也會導(dǎo)致酶活力下降甚至失活，影響酶解效果[2,33]。因此，確定最佳酶解溫度為37 ℃。

圖3 酶解溫度對酶解物?；悄懰徕c結(jié)合率的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the binding rate of sodium taurocholate

2.1.4 pH對酶解物活性的影響 如圖4所示，不同pH對應(yīng)的酶解效果有顯著差異（P<0.05）。酶解物的?；悄懰徕c結(jié)合能力隨著pH升高，先增大后減小，在pH2.0時酶解效果最好，?；悄懰徕c結(jié)合率達到（70.06%±0.32%）。pH也是影響酶活力的重要因素之一，胃蛋白酶在pH1.0～2.0之間，酶活力較高，而過酸過堿都會影響酶活力，從而降低酶解效果[34]。因此，確定最佳pH為2.0。

圖4 pH對酶解物?；悄懰徕c結(jié)合率的影響Fig.4 Effect of pH on the binding rate of sodium taurocholate

2.1.5 酶底比對酶解物活性的影響 如圖5所示，隨著酶底比的增加，酶解物結(jié)合?；悄懰徕c的能力呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，在酶底比0.3%時，酶解物活性最好，結(jié)合能力達到（67.09%±1.23%）。酶的添加量較低時，可能會導(dǎo)致酶與底物的結(jié)合能力變差，而較高的酶比例又會使蛋白過度水解，生成活性較差的酶解物，導(dǎo)致與?；悄懰徕c的結(jié)合能力下降，且過高的加酶量也會造成資源浪費[35]。因此，確定適宜的酶底比為0.3%。

圖5 酶底比對酶解物?；悄懰徕c結(jié)合率的影響Fig.5 Effect of enzyme to substrate ratio on the binding rate of sodium taurocholate

2.1.6 底物濃度對酶解物活性的影響 由圖6可知，底物濃度為3%時，酶解物結(jié)合?；悄懰徕c的能力達到最高，結(jié)合率為（67.01%±0.41%），而增大底物濃度，酶解物的活性卻反而下降，這一現(xiàn)象可能是因為過高的底物濃度影響了底物與酶的接觸面積，從而影響酶解效果，使酶解物與?；悄懰徕c的結(jié)合能力減小[36]。因此，確定適宜的底物濃度為3%。

圖6 底物濃度對酶解物?；悄懰徕c結(jié)合率的影響Fig.6 Effect of substrate concentration on the binding rate of sodium taurocholate

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

基于單因素實驗，以pH（A）、底物濃度（B）和酶底比（C）三個因素為自變量，以?；悄懰徕c結(jié)合率為活性指標(biāo)，設(shè)計并進行三因素三水平試驗。響應(yīng)面試驗結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面設(shè)計方案及結(jié)果Table 2 The design and results of the response surface experiment

采用Design Expert 8.0.6.1軟件對表2中的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到三個影響因素與響應(yīng)值?；悄懰徕c結(jié)合率（Y）之間的二次多項回歸方程：

對回歸模型及方程進行顯著性檢驗，如表3所示，該模型的F值為9.54，P=0.0036<0.01，表明建立的回歸模型存在極顯著差異[37]，失擬項F值為4.66，P=0.0857>0.05，差異不顯著說明由實驗操作等偶然因素對試驗結(jié)果的影響較小[38]，變異系數(shù)CV值為2.88%<10%，說明實驗結(jié)果較為可靠[2]。綜上，本次實驗穩(wěn)定性良好，建立的回歸模型有較好的擬合度，可用于觀察勐庫大葉茶蛋白酶解產(chǎn)物隨實驗條件變化而變化的規(guī)律，分析和預(yù)測酶解物具有最高膽酸鹽結(jié)合能力時的最優(yōu)工藝條件[39]。

表3 回歸模型顯著性檢驗Table 3 Analysis of variance for response surface quadratic model

顯著性檢驗表3中的F值、P值，可以反映出各個因素對酶解物結(jié)合膽酸鹽能力的影響，F(xiàn)值越大，則該因素影響效果越強[40]，從表中可以看出，三個變量pH、底物濃度和酶底比對酶解物結(jié)合膽酸鹽能力都有顯著性影響，其中，底物濃度和酶底比呈現(xiàn)極顯著性影響（P<0.01），據(jù)此可推測三個因素對酶解物膽酸鹽結(jié)合能力的影響程度依次為：酶底比>底物濃度>pH。

兩個因素之間的交互作用可以通過響應(yīng)等高線圖與曲面圖反映出[41]。如圖7所示，三個因素兩兩之間形成的圖形，其形狀都趨向橢圓，且其軸線與坐標(biāo)軸之間都能形成一個明顯的角度，即說明三個因素之間都存在較強的相互作用[42]。由圖7可以看出，隨著pH、底物濃度和酶底比的增大，膽酸鹽結(jié)合率呈先上升后下降趨勢，即說明具有極大值。隨著底物濃度和酶底比的變化，圖中響應(yīng)面的陡峭程度起伏較大，說明底物濃度和酶底比對膽酸鹽結(jié)合率的影響大于pH，與表3中方差分析結(jié)論一致[43]。

圖7 pH、底物濃度、酶底比交互作用對?；悄懰徕c結(jié)合率的影響Fig.7 Effect of the interaction of pH, substrate concentration and enzyme to substrate ratio on the binding rate of sodium taurocholate

通過軟件分析及預(yù)測，得出胃蛋白酶酶解勐庫大葉茶蛋白制備降血脂肽的最佳工藝條件：pH2.13、底物濃度2.73%、酶底比0.33%。在此條件下，軟件預(yù)測酶解物與?；悄懰徕c的結(jié)合率為70.79%。對預(yù)測的最優(yōu)條件進行實驗驗證，設(shè)置條件參數(shù)為pH2.1、底物濃度2.7%、酶底比0.3%、溫度37 ℃，酶解時間3 h，得到的酶解產(chǎn)物與?；悄懰徕c的實際結(jié)合率為（70.92%±0.12%），與軟件預(yù)測值相接近，相對誤差為（0.18%±0.14%）。說明該響應(yīng)面模型具有可行性，軟件的分析預(yù)測具有一定的準(zhǔn)確性。

2.3 勐庫大葉茶蛋白肽降血脂活性分析

2.3.1 茶葉蛋白肽對膽酸鹽的吸附能力 膽汁酸是膽汁的主要成分，是膽固醇在肝臟代謝分解的產(chǎn)物，也是人體清除膽固醇的主要途徑，而體內(nèi)大部分膽汁酸是以膽酸鹽的形式存在，因此，具有一定的膽酸鹽結(jié)合能力的物質(zhì)可被鑒定為具有一定的降脂活性[44]。膽酸鹽大部分是以鈉鹽的形式存在，且據(jù)報道，牛磺膽酸鈉（STC）是一種較難結(jié)合的共軛膽酸鹽[45]。因此，以?；悄懰徕c結(jié)合能力作為評價指標(biāo)具有一定的代表性。

如圖8所示，勐庫大葉茶蛋白肽結(jié)合?；悄懰徕c的能力，隨著濃度升高而增大，即膽酸鹽吸附能力與肽濃度呈依賴關(guān)系。在樣品濃度為4 mg/mL時，?；悄懰徕c的結(jié)合率達到了（45.15%±1.64%），活性高于漢麻降脂肽[46]（100 mg/mL時為28.1%）和卵形鯧鲹蛋白水解物[30]（100 mg/mL時為30.07%）。通過SPSS軟件計算得到此條件下勐庫大葉茶蛋白肽吸附膽酸鹽能力的EC50，如表4所示為6.466 mg/mL。由此可見，勐庫大葉茶蛋白肽具有顯著的膽酸鹽結(jié)合能力，其原因可能和膽酸鹽與活性肽之間的結(jié)合力以及氨基酸的疏水性等因素相關(guān)[47]，具體活性關(guān)系還需后續(xù)進一步分離純化后進行深入研究。

表4 勐庫大葉茶蛋白肽降血脂活性評價Table 4 Evaluation of lipid-lowering activity of peptide from Mengku-dayecha protein

圖8 不同樣品濃度的?；悄懰徕c結(jié)合率Fig.8 Binding rate of sodium taurocholate at different sample concentrations

2.3.2 茶葉蛋白肽對胰脂肪酶的抑制作用 胰腺腺泡細(xì)胞產(chǎn)生的胰脂肪酶（PL），負(fù)責(zé)將膳食三酰甘油水解為二酰甘油、單酰甘油、甘油和脂肪酸陰離子[48]，抑制胰腺脂肪酶的活性可以有效降低小腸對脂肪的吸收效率，從而達到降脂的目的[49]。勐庫大葉茶蛋白肽抑制胰脂肪酶的能力如圖9所示。在0.5 mg/mL時，胰脂肪酶抑制率已超過50%，當(dāng)濃度為4 mg/mL時，抑制率達到（74.33%±1.45%），通過軟件計算得樣品抑制胰脂肪酶活性的IC50，如表4所示為0.310 mg/mL，活性優(yōu)于猴頭菇多肽[50]（IC50：2.750 mg/mL）和駝乳蛋白水解物[51]（IC50：20.465 mg/mL）?？梢钥闯觯聨齑笕~茶蛋白肽具有較強的抑制胰脂肪酶作用，其原因可能是茶葉蛋白肽能夠阻止胰脂肪酶電子分布的改變，使酶的催化中心無法暴露，不能與底物結(jié)合，從而達到抑制酶活性的作用[52]。

圖9 不同樣品濃度的胰脂肪酶抑制作用Fig.9 Inhibition of pancreatic lipase at different sample concentrations

2.3.3 茶葉蛋白肽對膽固醇酯酶的抑制作用 胰腺膽固醇酯酶是α/β水解酶家族中的一員，是一種膽鹽激活的脂肪酶，它能催化膳食膽固醇酯在小腸的管腔內(nèi)水解成游離膽固醇[53]。抑制胰膽固醇酯酶的活性可以使飲食中的血清膽固醇水平以合理的速度下降。因此，它被認(rèn)為是治療膽固醇相關(guān)疾病的重要靶點[54]。如圖10所示，勐庫大葉茶蛋白肽抑制胰膽固醇酯酶的能力與樣品濃度呈劑量依賴關(guān)系，其抑制膽固醇酯酶活性的IC50如表4所示為1.557 mg/mL，遠低于六堡茶茶褐素[55]（IC50：57.20 mg/mL）和亞麻籽肽[56]（IC50：4.57 mg/mL）。這可能是勐庫大葉茶蛋白肽中的酸性氨基酸與酶形成了相互作用[57]。綜上所述，酶解制備的勐庫大葉茶蛋白肽展現(xiàn)出了潛在的降血脂能力，后續(xù)將通過進一步分離純化得到降血脂活性更強的單體。

圖10 不同樣品濃度的胰膽固醇酯酶抑制作用Fig.10 Inhibition of pancreatic cholesterol esterase at different sample concentrations

2.4 氨基酸組成分析

勐庫大葉茶蛋白肽的氨基酸組成如表5所示，必需氨基酸的含量占總氨基酸的34.35%，疏水性氨基酸的比例高達31.94%，酸性氨基酸的含量很高，達到了41.06%。許多研究表明，疏水性氨基酸在降低膽固醇的活性中起重要作用，尤其是影響膽酸鹽的結(jié)合能力[58]，疏水性氨基酸和膽汁酸之間的相互作用，會形成不溶性復(fù)合物，并以糞便形式排出體外，這是人體清除膽固醇的主要途徑[59]。本研究中酶解物活性肽展現(xiàn)出了良好的膽酸鹽結(jié)合能力，豐富的疏水性氨基酸可能發(fā)揮了重要作用。研究表明，酸性氨基酸的存在也有助于降血脂作用的發(fā)揮[60]，本研究中酸性氨基酸天冬氨酸和谷氨酸的含量占比最大，分別達到了11.50%和29.56%。另外，低比例的Met/Gly也會對降低膽固醇作用產(chǎn)生影響[59]，本研究中Met/Gly的比值約為1:5，這可能也對茶葉蛋白肽的降血脂作用起到了積極作用。綜上，本研究中的勐庫大葉茶蛋白酶解物活性肽在多個方面都展現(xiàn)出了具有潛在的降血脂作用，其具體的多肽組成和氨基酸序列分析有待進一步深入研究。

表5 勐庫大葉茶蛋白酶解物的氨基酸組成Table 5 Amino acid composition of hydrolysate from Mengkudayecha protein

3 結(jié)論

本研究以勐庫大葉茶蛋白為原料，以?；悄懰徕c結(jié)合率為主要指標(biāo)，通過單因素實驗和響應(yīng)面試驗，獲得酶解勐庫大葉茶蛋白制備降血脂肽的最佳工藝條件。結(jié)果表明：在pH2.1、底物濃度2.7%、酶底比0.3%、溫度37 ℃條件下，用胃蛋白酶酶解3 h得到的酶解物，其?；悄懰徕c結(jié)合率為（70.92%±0.12%），與軟件預(yù)測值70.79%的相對誤差僅為（0.18%±0.14%），說明該模型可以較準(zhǔn)確地描述與預(yù)測水解勐庫大葉茶蛋白的最優(yōu)工藝條件。

對最優(yōu)酶解物活性肽進行降血脂活性評價，發(fā)現(xiàn)其具有較強的?；悄懰徕c結(jié)合能力（EC50=6.466 mg/mL），有利于機體分解代謝膽固醇并排出。勐庫茶葉蛋白肽同時具有較好的胰脂肪酶抑制作用（IC50=0.310 mg/mL）和膽固醇酯酶抑制作用（IC50=1.557 mg/mL），有利于抑制機體對脂肪和膽固醇的吸收利用。對茶葉蛋白肽進行氨基酸組成分析，發(fā)現(xiàn)其中含量豐富的必需氨基酸（34.35%）、疏水性氨基酸（31.94%）和酸性氨基酸（41.06%），都在降血脂活性中發(fā)揮著重要作用。

本研究為茶葉蛋白資源的開發(fā)利用提供了新思路，為大葉茶蛋白肽的降血脂作用研究提供了前期理論依據(jù)。后續(xù)將對茶葉蛋白降血脂肽進一步分離純化，并在細(xì)胞及動物水平上深入探討其具體作用機制。