冼麗清，李 珊 ，馮 彬，梁 儉，劉曉鳳

（1.桂西區(qū)域生態(tài)環(huán)境分析和污染控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 百色 533000；2.百色學(xué)院材料科學(xué)與工程學(xué)院，廣西 百色 533000；3.百色學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，廣西 百色 533000）

茶葉中含有豐富的生物活性物質(zhì)，如黃酮[1]、多酚[2]、生物堿[3]、茶多糖等。其中，茶多糖是一種包含單糖鏈、蛋白質(zhì)及礦物質(zhì)元素等物質(zhì)的復(fù)合物[4]。醫(yī)學(xué)及生理學(xué)試驗(yàn)證實(shí)，茶多糖具有廣泛的生理活性，如抗氧化、抗過敏、抗腫瘤、降血脂、降血壓、抑菌消炎、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力等[5]，尤其在治療糖尿病方面具有特殊的療效[6]。茶多糖已被認(rèn)定為茶葉中茶多酚之外的另一極具開發(fā)價(jià)值的天然產(chǎn)物。凌云白毫為百色凌云、樂業(yè)地區(qū)特產(chǎn)的喬木類大葉茶種，因芽、葉被滿白色絨毛而得名，為當(dāng)?shù)孛撠毠?jiān)的關(guān)鍵經(jīng)濟(jì)作物[7]。受限于當(dāng)?shù)夭话l(fā)達(dá)的地方經(jīng)濟(jì)，凌云白毫作為當(dāng)?shù)氐拿a(chǎn)品，其生物活性物質(zhì)如茶多糖的含量及性質(zhì)研究尚未系統(tǒng)開展，導(dǎo)致評估凌云白毫的生理功能缺乏具體數(shù)據(jù)支撐，推廣乏力。

熱水浸提法是提取多糖類物質(zhì)的常用方法，可最大程度地保留其物質(zhì)結(jié)構(gòu)及生物活性的完整性，但也存在耗時(shí)長、提取效率低等缺點(diǎn)。為提高提取效率，酶解提取、微波輔助提取、超臨界萃取提取、亞臨界水萃取提取、超聲波輔助提取等提取方法相繼被發(fā)展出來[8]。各種提取方法中，酶解提取受限條件多，酶的活性難以完全發(fā)揮，微波輔助提取產(chǎn)生的瞬時(shí)高溫對產(chǎn)物的生物活性有較大影響，超臨界萃取提取、亞臨界水萃取提取需要使用專門的設(shè)備，成本高昂。超聲波輔助提取則主要通過超聲波的機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)及熱效應(yīng)提高小分子物質(zhì)在介質(zhì)中的穿透能力，提高其得率的同時(shí)對分子結(jié)構(gòu)的破壞性較小，并且操作簡便[9]。劉小辰等[10]比較了熱水浸提、酸輔助提取、堿輔助提取、酶解提取、高壓熱水浸提、超聲波輔助熱水浸提等6種方法對香蕉皮粗多糖提取率的影響，結(jié)果顯示超聲波輔助熱水浸提法提取物中多糖含量最高。此外，超聲波也經(jīng)常聯(lián)用其它技術(shù)用于植物活性成分的提取以期發(fā)揮更加優(yōu)越的提取性能[11]。

因此，本文采用超聲波輔助熱水浸提法提取凌云白毫中的茶多糖，優(yōu)化提取工藝，并初步探討多糖類物質(zhì)的抗氧化效果，填補(bǔ)凌云白毫中茶多糖提取工藝及生物活性研究的空白，并依據(jù)所得數(shù)據(jù)評估茶多糖的含量及其對機(jī)體的保健效果，推動(dòng)凌云白毫在國內(nèi)的深入推廣。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

凌云白毫 有機(jī)綠茶，廣西浪伏茶業(yè)有限公司；玉米油 魯花玉米胚芽油（物理壓榨，單烯脂肪酸+多烯脂肪酸>85%），購于百色市盛輝超市；葡萄糖、苯酚、30%過氧化氫、抗壞血酸（VC）、1,1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH自由基） 均為分析純，上海麥克林生化科技有限公司。

BSA123-CW電子分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；820DP高功率數(shù)控超聲波清洗器 深圳市光點(diǎn)超聲波設(shè)備有限公司；UV-27000島津紫外可見分光光度計(jì) 島津企業(yè)管理（中國）有限公司；SHA-C水浴恒溫振蕩器 常州市億能實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 凌云白毫中茶多糖的提取 市售凌云白毫50 g，60 ℃干燥至恒重（前后質(zhì)量差<0.01 g），粉碎，過篩（d=0.42 mm），得茶粉原料。稱取1.000 g茶粉原料，按比例混合純水，在設(shè)定的提取溫度、超聲時(shí)間、超聲功率等條件下進(jìn)行提取，反復(fù)2次，合并提取液。Sevage法除蛋白，體系濃縮至50 mL，過濾。濾液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，純水定容，即為多糖提取液[12]。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 稱取1.000 g茶粉原料，固定基準(zhǔn)提取條件：液料比60:1 mL/g、提取溫度50 ℃、超聲時(shí)間 20 min、超聲功率150 W[13]。在上述基準(zhǔn)提取條件下開展單因素實(shí)驗(yàn)，依次考察液料比（50:1、60:1、70:1、80:1、90:1 mL/g）、提取溫度（40、50、60、70、80 ℃）、超聲時(shí)間（10、15、20、25、30 min）及超聲功率（100、150、200、250、300 W）等因素對茶多糖提取效果的影響。

1.2.3 Box-Bohnken法優(yōu)化茶多糖提取工藝 依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果，選取其中的顯著因素為自變量，茶多糖得率為響應(yīng)值，利用響應(yīng)面法中的Box-Bohnken法優(yōu)化各因素的水平組合[14?15]，因素水平表如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.4 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品回歸方程的建立及茶多糖得率的計(jì)算 移取濃度為0.1000 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL至具塞試管中，加純水稀釋至2.00 mL。振蕩過程中，添加5.0%苯酚水溶液1.00 mL、濃硫酸 5.00 mL（分批加入），50 ℃恒溫振蕩10 min，在489 nm處測定體系吸光度A[16]。以吸光度A對葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度c進(jìn)行線性回歸，得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品回歸方程：A=17.61c+0.0899，R2=0.9980。按上述方法測定多糖提取液吸光度Aa，帶入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品回歸方程求得多糖濃度ca，按下式計(jì)算茶多糖得率：

式中：ca為經(jīng)計(jì)算所得茶多糖濃度， mg/mL；D為茶多糖稀釋倍數(shù)；V為茶多糖提取液體積， mL；m為茶粉原料質(zhì)量，mg。

1.2.5 茶多糖的純化及體外抗氧化效果測定

1.2.5.1 茶多糖的純化 混合多批次茶多糖提取液，濃縮至100 mL，過濾。濾液混合4倍量無水乙醇并于4 ℃冷藏24 h，可見容器底部有白色絲狀沉淀。抽濾，固體用丙酮-純水反復(fù)沖洗至洗液無色。固體用少量水溶解，DEAE纖維素-52柱層析純化（層析柱1.5 cm×25 cm；純水為洗脫劑，5 mL/min）。洗脫液濃縮，快速冷凍，減壓抽干得灰白色固體，即為茶多糖測試品[17]。稱取一定量測試品茶多糖，配制濃度分別為0.2、0.3、0.5、0.8、1.2 mg/mL茶多糖待測液。

1.2.5.2 茶多糖對羥基自由基（·OH）清除效果的測定

取5支潔凈試管，分別加入不同濃度多糖待測液2.00 mL，8.000 mmol/L硫酸亞鐵溶液2.00 mL、1.0%過氧化氫溶液2.00 mL。振蕩均勻后，繼續(xù)加入7.000 mmol/L水楊酸-乙醇溶液2.00 mL。上述5個(gè)反應(yīng)體系25 ℃繼續(xù)振蕩60 min，于510 nm處測定體系吸光度Ax1[18?19]，按下式計(jì)算茶多糖對·OH的清除率：

式中：Ax1為標(biāo)準(zhǔn)測試組測定體系吸光度；Ap1為對照組（以純水取代過氧化氫溶液）測定體系吸光度；A01為空白組（以純水取代多糖待測液）測定體系吸光度。

1.2.5.3 茶多糖對DPPH·清除效果的測定 取5支潔凈試管，分別加入不同濃度多糖待測液2.00 mL、0.2000 mmol/L DPPH-乙醇溶液2.00 mL。上述5個(gè)反應(yīng)體系置于黑暗環(huán)境中25 ℃振蕩30 min，于517 nm處測定體系吸光度Ax2[20?21]，按下式計(jì)算茶多糖對DPPH自由基的清除率：

式中：Ax2為標(biāo)準(zhǔn)測試組測定體系吸光度；Ap2為對照組（以無水乙醇取代DPPH-乙醇溶液）測定體系吸光度；A02為空白組（以純水取代多糖待測液）測定體系吸光度。

1.2.5.4 茶多糖對油脂（玉米油為例）的抗氧化效果的測定 稱取一定質(zhì)量的純品茶多糖，混合至玉米油中，使茶多糖在測試樣品中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0、0.02%、0.05%。以Schall烘箱法[22]考察茶多糖對玉米油的抗氧化效果，每隔2 d取樣一次并按照國標(biāo)GB 5009.227-2016[23]中的滴定法測定油體樣品中的過氧化值（POV）。VC作為對照，根據(jù)POV值的波動(dòng)幅度衡量茶多糖對油脂的抗氧化效果。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本文利用origin 9.0軟件對數(shù)據(jù)作圖處理；利用SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析（P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著）及IC50的計(jì)算；利用Design-Expert 8.5 軟件中的Box-Bohnken法優(yōu)化試驗(yàn)方案并處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 液料比對茶多糖提取效果的影響 圖1展示，當(dāng)液料比<60:1 mL/g時(shí)，茶多糖得率隨液料比的增加而迅速升高。當(dāng)液料比>60:1 mL/g時(shí)，茶多糖得率略微升高后處于平衡狀態(tài)。提高溶劑用量可增大體系擴(kuò)散壓并促進(jìn)茶多糖的溶出。當(dāng)茶多糖完全溶出或濃度達(dá)到平衡時(shí)，得率不再發(fā)生顯著變化（P>0.05），而過高的溶劑用量將增加體系的雜質(zhì)含量及提取成本[24]。所得數(shù)據(jù)經(jīng)單因素方差分析得P=0.032<0.05，差異性顯著，表明考察范圍內(nèi)液料比對茶多糖提取具有顯著的影響效果，并選用液料比50:1、60:1、70:1 mL/g進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)。

圖1 液料比對茶多糖提取效果的影響Fig.1 The effect of liquid-material ratio on extraction of tea polysaccharides

2.1.2 提取溫度對茶多糖提取效果的影響 圖2展示，當(dāng)提取溫度<60 ℃時(shí)，茶多糖得率隨體系溫度的升高而升高，當(dāng)體系溫度為60 ℃時(shí)的峰值3.72%。繼續(xù)提高體系溫度，茶多糖得率顯著下降（P<0.05）。茶多糖分子的運(yùn)動(dòng)活性隨體系溫度的升高而增強(qiáng)，但長時(shí)間在高溫環(huán)境中多糖的分子結(jié)構(gòu)易降解并失去生物活性，得率下降[25]。所得數(shù)據(jù)經(jīng)單因素方差分析得P=0.007<0.01，差異性極顯著，表明考察范圍內(nèi)提取溫度對茶多糖提取具有極顯著的影響效果，并選用提取溫度50、60、70 ℃進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)。

圖2 提取溫度對茶多糖提取效果的影響Fig.2 The effect of temperature on extraction of tea polysaccharides

2.1.3 超聲時(shí)間對茶多糖提取效果的影響 如圖3所示，當(dāng)超聲時(shí)間<25 min時(shí)，茶多糖得率隨超聲時(shí)間的延長而升高，但增速逐漸減慢，當(dāng)超聲時(shí)間為25 min時(shí)的峰值3.17%。繼續(xù)延長超聲時(shí)間，茶多糖得率下降。延長超聲時(shí)間可使植物細(xì)胞壁被超聲波充分破碎，但多糖的分子結(jié)構(gòu)長時(shí)間在超聲波機(jī)械震蕩作用下易被破壞，得率下降[26]。所得數(shù)據(jù)經(jīng)單因素方差分析得P=0.044<0.05，差異性顯著，表明考察范圍內(nèi)超聲時(shí)間對茶多糖提取具有顯著的影響效果，并選用超聲時(shí)間15、20、25 min進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)。

圖3 超聲時(shí)間對茶多糖提取效果的影響Fig.3 The effect of ultrasonic time on extraction of tea polysaccharides

2.1.4 超聲功率對茶多糖提取效果的影響 如圖4所示，當(dāng)超聲功率<200 W時(shí)，茶多糖得率隨超聲功率的增加而升高，當(dāng)超聲功率為200 W時(shí)的峰值3.42%。繼續(xù)增加超聲功率，茶多糖得率下降。超聲波通過機(jī)械作用破碎植物細(xì)胞壁，加速多糖的溶出。過高的超聲功率將引發(fā)體系較為劇烈的空化作用，致使多糖分子失活降解，得率下降[27]。所得數(shù)據(jù)經(jīng)單因素方差分析得P=0.027<0.05，差異性顯著，表明考察范圍內(nèi)超聲功率對茶多糖提取具有顯著的影響效果，并選用超聲功率150、200、250 W進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)。

圖4 超聲功率對茶多糖提取效果的影響Fig.4 The effect of ultrasonic power on extraction of tea polysaccharides

2.2 Box-Bohnken法優(yōu)化茶多糖提取工藝

2.2.1 Box-Bohnken法優(yōu)化提取試驗(yàn)方案 各考察因素A液料比（mL/g）、B提取溫度（℃）、C超聲時(shí)間（min）及D超聲功率（W）為自變量，茶多糖得率（%）為響應(yīng)值，利用Box-Bohnken法優(yōu)化提取試驗(yàn)方案，確定29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)。試驗(yàn)方案及結(jié)果如表2所示。

表2 Box-Bohnken法建立提取試驗(yàn)方案Table 2 Extraction scheme designed by Box-Bohnken method

2.2.2 回歸方程的建立及顯著性檢驗(yàn) 以Box-Bohnken法對表2所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲得茶多糖得率（%）與各考察因素：液料比（A）、提取溫度（B）、超聲時(shí)間（C）及超聲功率（D）的回歸方程：

茶多糖得率（%）=?47.64867+0.83778A+0.73370B+0.47527C?4.90000×10?4D?4.87500×10?3AB+1.15000×10?3AC+1.05000×10?4AD+1.50000×10?3BC+2.65000×10?4BD+5.90000×10?4CD?4.56833×10?3A2?4.58083×10?3B2?0.017823C2?9.17333×10?5D2

采用方差分析法對所得回歸方程進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)[28?29]，結(jié)果見表3。該方程P<0.0001，極顯著；失擬項(xiàng)P=0.0992>0.05，不顯著，說明所得方程可良好匹配試驗(yàn)操作。決定系數(shù)R2=0.9622，調(diào)整決定系數(shù)RAdj2=0.9244，說明因素選取合理，誤差主要由隨機(jī)誤差產(chǎn)生并且可控，所得回歸方程可用于試驗(yàn)預(yù)測茶多糖得率隨因素、水平變化的趨勢及幅度。

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Variance analysis of regression equation

回歸方程一次項(xiàng)液料比（A）、提取溫度（B）、超聲時(shí)間（C）及超聲功率（D）對茶多糖得率的影響均極顯著（P<0.01），根據(jù)F值大小，可知其顯著性順序?yàn)橐毫媳?提取溫度>超聲時(shí)間>超聲功率。交互項(xiàng)中交互作用AB的影響效果為極顯著水平（P<0.0001），其它交互作用的影響不顯著（P>0.05）。二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2的影響均極顯著，其顯著性順序?yàn)锽2≈A2>C2>>D2。

2.2.3 交互作用的響應(yīng)面分析 如圖5所示，交互作用的顯著程度與響應(yīng)面的曲面曲率、等高線中心橢圓率成正比[30]。交互作用AB可見一顯著的下滑曲面，且中心橢圓率最高。其它交互作用各方向曲面下滑平緩，等高線中心橢圓率較低甚至偏圓形。以上結(jié)果說明交互作用AB的影響效果顯著高于其它交互作用，此結(jié)果與方差分析結(jié)果一致。

圖5 交互作用AB對茶多糖提取效果的影響Fig.5 The effect of interactive AB on extraction of tea polysaccharides

2.2.4 最佳提取工藝的獲取及穩(wěn)定性驗(yàn)證 對回歸方程進(jìn)行最優(yōu)化處理，獲得茶多糖提取工藝的最佳條件：液料比68.51:1 mL/g、提取溫度52.19 ℃、超聲時(shí)間20.70 min、超聲功率178.46 W，茶多糖得率可達(dá)5.06%。根據(jù)試驗(yàn)操作可達(dá)水平，將上述條件調(diào)整為：液料比69:1 mL/g、提取溫度52 ℃、超聲時(shí)間21 min、超聲功率180 W。在此條件下，平行實(shí)驗(yàn)5次，實(shí)測茶多糖平均得率為（4.84%±0.04%），與模型預(yù)測值相近（<5%），說明該條件具有良好的穩(wěn)定性，可用于茶多糖的提取。此外，根據(jù)茶多糖得率可知凌云白毫茶多糖含量較為豐富，高于國內(nèi)著名綠茶品牌西湖龍井（3.10%）及信陽毛尖（1.84%）[31]。

2.3 茶多糖體外抗氧化效果

2.3.1 茶多糖對·OH的清除效果 如圖6所示，凌云白毫茶多糖對·OH具有良好的清除效果，其清除能力隨茶多糖濃度的升高而增強(qiáng)，并且高濃度條件下有進(jìn)一步增強(qiáng)的趨勢。當(dāng)茶多糖濃度為1.2 mg/mL時(shí)，對·OH的清除率為82%。經(jīng)SPSS17.0軟件分析，凌云白毫茶多糖清除·OH的IC50為0.262 mg/mL，低于VC（IC50=0.027 mg/mL）對·OH的清除能力。

圖6 茶多糖對·OH的清除效果Fig.6 The clearance effect of tea polysaccharides on ·OH

2.3.2 茶多糖對DPPH·的清除效果 如圖7所示，茶多糖對DPPH·具有較強(qiáng)的清除效果，其清除能力隨茶多糖濃度的增加而逐漸增強(qiáng)，但增速減慢并趨近平衡。當(dāng)茶多糖濃度為1.2 mg/mL時(shí)，對DPPH·的清除率為69%。經(jīng)SPSS 17.0軟件分析，凌云白毫茶多糖清除DPPH·的IC50為0.438 mg/mL[32]，明顯低于VC（IC50=0.072）對DPPH·的清除能力。

圖7 茶多糖對DPPH自由基的清除效果Fig.7 The clearance effect of tea polysaccharides on DPPH radical

2.3.3 茶多糖對玉米油的抗氧化效果 玉米油富含不飽和脂肪酸，長期暴露在空氣中易發(fā)生自氧化反應(yīng)，導(dǎo)致油體酸敗變質(zhì)[33]。圖8展示，茶多糖對油脂具有良好的抗氧化效果，添加過茶多糖的油體樣品的POV值較空白樣品均有一定程度的下降，并且下降幅度與茶多糖添加量表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。茶多糖添加量為0.05%時(shí)，其抗氧化效果強(qiáng)于0.02%VC；添加量相同時(shí)，其抗氧化效果低于VC。

圖8 茶多糖對油脂的抗氧化效果Fig.8 The antioxidant activity of tea polysaccharides on grease

3 結(jié)論

本文采用超聲波輔助方式提取凌云白毫茶多糖，并利用Box-Bohnken法優(yōu)化試驗(yàn)方案，獲得該工藝的回歸方程。方差分析表明，回歸方程極顯著，與試驗(yàn)操作擬合程度高。對回歸方程進(jìn)行最優(yōu)化處理獲得茶多糖提取工藝的最佳條件：液料比69:1 mL/g、提取溫度52 ℃、超聲時(shí)間21 min、超聲功率180 W。最佳條件下，實(shí)測茶多糖平均得率為4.84%，與回歸方程預(yù)測值5.06%相當(dāng)（<5%），說明所得工藝條件具有一定的實(shí)用價(jià)值，可用于茶多糖的提取。凌云白毫茶多糖對常見自由基如·OH、DPPH·均具有一定的清除效果，其中，對DPPH·的清除能力（IC50=0.438 mg/mL）強(qiáng)于著名綠茶品牌西湖龍井（IC50=0.489 mg/mL）和信陽毛尖（IC50=0.443 mg/mL）。此外，茶多糖可抑制油脂的自氧化反應(yīng)，延長油脂在常溫常壓環(huán)境中的存儲(chǔ)時(shí)間。抗氧化性試驗(yàn)結(jié)果表明凌云白毫茶多糖具有良好的抗氧化效果，并且抗氧化能力與茶多糖濃度成正向關(guān)系。凌云白毫茶多糖含量豐富，經(jīng)常飲用對于維護(hù)人體正常的生命活動(dòng)具有積極效果。茶多糖也可作為一種天然抗氧化劑，具有一定的開發(fā)價(jià)值。以上結(jié)果可為凌云白毫在國內(nèi)外的深度推廣及產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)參考。