翟曉娜，汪 濤，梁 亮，師建芳，謝奇珍，孫 昊，裴海生

（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)劃設(shè)計(jì)研究院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)后處理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100121）

油菜籽是繼大豆和棕櫚之后的世界第三大植物油原料，餅粕作為其主要加工副產(chǎn)物，占比高達(dá)60%～65%，產(chǎn)量巨大。長期以來，菜籽粕絕大部分被用作飼料，附加值較低，但其蛋白質(zhì)含量可高達(dá)30%～45%，且氨基酸組成合理，含有豐富的含硫氨基酸及一定量的賴氨酸，是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白資源，利用前景廣闊[1]。自2010年以來，已有Burcon及DSM等公司生產(chǎn)的菜籽蛋白先后被FDA（U.S. Food and Drug Administration）、EFSA（European Food Safety Authority）批準(zhǔn)公認(rèn)安全的（generally regarded as safe, GRAS）及食品新資源原料，菜籽蛋白正逐步從動(dòng)物轉(zhuǎn)向人類營養(yǎng)市場(chǎng)。我國作為油菜籽的生產(chǎn)大國，高附加值利用菜籽粕蛋白對(duì)提高油菜籽產(chǎn)業(yè)價(jià)值鏈意義重大。

油菜籽中的蛋白質(zhì)主要包括菜籽球蛋白（cruciferin）、菜籽白蛋白（napin）及少量的油質(zhì)蛋白，其中，菜籽球蛋白的平均分子量約為300～360 kDa、菜籽白蛋白的平均分子量約為14 kDa，分別具有良好的凝膠特性、成膜特性及一定的生物活性，應(yīng)用前景良好[2?3]。目前，菜籽粕蛋白的制備方法包括：pH分段控制法[4?5]、鹽溶法[6]、酶解法[7]及靜電分離法[8]等，其中，pH分段控制法中的堿溶酸沉法是工業(yè)化生產(chǎn)最常用的方法，但仍存在目標(biāo)蛋白選擇性差且多關(guān)注酸沉淀蛋白的問題。同時(shí)，在菜籽餅粕蛋白的提取過程中，提高其得率的同時(shí)盡可能降低其抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)（如硫苷等）的含量是非常有必要的。因此，本實(shí)驗(yàn)以浙江壓榨菜籽餅粕為原料，以蛋白質(zhì)和硫苷溶出率、蛋白質(zhì)沉淀率為主要考察指標(biāo)，通過單因素與響應(yīng)面分析對(duì)菜籽餅粕蛋白的堿溶酸沉工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)菜籽粕酸沉淀蛋白及酸溶解蛋白提取物進(jìn)行分析研究，旨在為拓寬菜籽粕蛋白提取物的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

壓榨菜籽餅粕 購置于浙江嘉興；BSA、PBCl2Sigma；黑芥子硫苷酸鉀一水 上海源葉生物科技有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250、ABTS自由基試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、預(yù)染蛋白Marker（14.4～97.4 kDa） 北京索萊寶科技有限公司；羧甲基纖維素鈉、HCl、NaOH、乙醇等 均為分析純，阿拉丁試劑（上海）有限公司；金黃色葡萄球菌（S.aureus）、大腸桿菌（E.coli）、黃青霉（P.chrysogenum）中國科學(xué)院。

UV-1780型紫外可見分光光度計(jì) 島津儀器（蘇州）有限公司；HWS-26型電熱恒溫水浴鍋 蘇州江東精密儀器有限公司；AR223CN型電子天平 奧豪斯（常州）儀器有限公司；TGL-24M高速冷凍離心機(jī) 湖南平凡科技有限公司；KN680全自動(dòng)凱氏定氮儀 山東海能科學(xué)儀器有限公司；YC-1800實(shí)驗(yàn)型噴霧干燥機(jī) 上海雅程儀器設(shè)備有限公司；DYZC-MINI4型電泳儀、WD-9143B凝膠成像系統(tǒng) 北京六一生物科技有限公司；BCN-1360型生物潔凈工作臺(tái) 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；XSP-SM4型雙目生物顯微鏡 上海譜騫光學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菜籽餅粕蛋白堿溶酸沉工藝

1.2.2 脫脂榨菜籽餅粕的制備 將菜籽餅粕粉碎過60目篩，以篩下餅粕粉為原料，石油醚為溶劑，按料液比1:10 g:mL在60～90 ℃下回流提取4 h后，自然干燥得脫脂菜籽餅粕，備用[9]。

1.2.3 菜籽餅粕蛋白堿溶工藝優(yōu)化 實(shí)驗(yàn)過程中，脫脂菜籽餅粕與已調(diào)節(jié)好pH的堿溶液按一定比例混合均勻，恒溫反應(yīng)一定時(shí)間后，4 ℃條件下以5000 r/min離心15 min，然后取堿溶液測(cè)定其中蛋白質(zhì)和硫苷含量。

1.2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn) 以堿溶過程中菜籽餅粕中蛋白質(zhì)和硫苷溶出量為測(cè)量指標(biāo)，依次考察堿溶pH、堿溶時(shí)間、提取溫度及料液比各因素的影響，單因素基礎(chǔ)條件為：堿溶pH13.0，堿溶時(shí)間60 min，提取溫度45 ℃，料液比1:40 g/mL。各因素的水平梯度為，堿溶pH:12.0、12.5、13.0、13.5、14.0；堿溶時(shí)間：40、60、80、100、120 min；提取溫度：35、45、55、65、75 ℃；料液比：1:20、1:30、1:40、1:50、1:60 g/mL。

1.2.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定料液比為1:40 g/mL，利用響應(yīng)面分析法對(duì)pH、時(shí)間、溫度3個(gè)因素進(jìn)一步優(yōu)化。根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取pH（X1）、時(shí)間（X2）及溫度（X3）為自變量，以蛋白質(zhì)溶出率為響應(yīng)值1（Y1），硫苷溶出率為響應(yīng)值2（Y2）進(jìn)行三因素三水平二指標(biāo)的響應(yīng)面分析，優(yōu)化菜籽餅粕蛋白堿溶工藝條件，試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.2.3.3 蛋白質(zhì)溶出率測(cè)定 采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定不同堿溶條件下菜籽餅粕蛋白的溶出含量，具體參照羅群[10]的實(shí)驗(yàn)方法，并做適當(dāng)修改，得到蛋白質(zhì)濃度的標(biāo)曲為：Y=0.0069x+0.0598，R2=0.9988（X表示BSA當(dāng)量（mg）、Y表示溶液吸光度）。

1.2.3.4 硫苷溶出率測(cè)定 參照王寧惠[11]和趙冬吉[12]的方法，利用氯化鈀法對(duì)菜籽餅粕及其堿溶液中硫苷含量進(jìn)行測(cè)定。精確稱取黑芥子硫苷酸鉀一水標(biāo)準(zhǔn)品0.02 g，用去離子水溶解后定容于10 mL容量瓶中配成 4.8139 μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)液，稀釋至所需濃度，取2 mL不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液與3.0 mL 0.1% CMC 混合，再加入4.0 mmol/L PbCl2溶液2 mL，于室溫反應(yīng)1 h后測(cè)定其520 nm的吸光值，以PbCl2、羧甲基纖維素鈉空白溶液作參比溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到黑芥子硫苷酸鉀一水的標(biāo)曲為：Y=0.555718x?0.00357，R2=0.999（X表示黑芥子硫苷酸鉀一水濃度（μmol/mL）、Y表示溶液吸光度）。

準(zhǔn)確稱取粉碎菜籽餅粕0.1 g于10 mL試管中，沸水浴鍋干蒸10 min后加入8 mL的90 ℃熱水混勻，再在沸水浴中反應(yīng)40 min，冷卻靜置后添加去離子水至10 mL搖勻并過濾，取2 mL過濾液按上述操作測(cè)定菜籽餅粕中硫苷含量；取菜籽餅粕堿溶液2 mL按上述操作測(cè)定其硫苷含量。以堿溶液中硫苷含量與菜籽餅粕中硫苷含量的比例為硫苷溶出率。

1.2.4 菜籽餅粕蛋白酸沉條件優(yōu)化 在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，冷凍離心收集上清液后，優(yōu)化菜籽蛋白沉淀pH（1.0、2.0、3.0、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0），4 ℃條件下以6000 r/min離心10 min后離心收集沉淀，真空冷凍干燥得菜籽餅粕酸沉蛋白，并計(jì)算其得率[9]；同時(shí)上清液經(jīng)噴霧干燥得到酸溶蛋白提取物。采用凱氏定氮法測(cè)定菜籽餅粕堿溶液、酸沉蛋白、酸溶蛋白提取物的粗蛋白含量，其中，蛋白質(zhì)換算系數(shù)為6.25[13]。

1.2.5 菜籽餅粕蛋白提取物特征分析

1.2.5.1 SDS-PAGE凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分布 采用電泳儀進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，按照WANG等[14]的方法，并作適當(dāng)修改，具體方法如下：將菜籽餅粕堿溶液、酸沉淀蛋白、酸溶蛋白提取物分別（粗蛋白含量5 mg/mL，溶劑pH約為12.0的水溶液）與緩沖液（0.125 mol/L Tris-HCl（pH6.8）含1%SDS、2%β-巰基乙醇、5%甘油及0.025%溴酚藍(lán)）按1:1體積比混合后煮沸約5 min，上樣10 μL，80 V電泳1 h后，轉(zhuǎn)為120 V繼續(xù)電泳約2 h，電泳選用12%的分離膠和5%的濃縮膠，電泳結(jié)束后將凝膠置于40%甲醇與考馬斯亮藍(lán)-G250進(jìn)行染色處理30 min后，于45%甲醇和10%乙酸溶液中脫色，待膠片背景藍(lán)色呈透明狀后進(jìn)行凝膠電泳成像。

1.2.5.2 菜籽粕蛋白提取物清除ABTS自由基的能力 采用ABTS自由基清除能力檢測(cè)試劑盒對(duì)菜籽粕酸沉蛋白及酸溶蛋白提取物的抗氧化能力進(jìn)行測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)在405 nm下測(cè)定樣品的吸光值，其中，樣品的吸光值記為A樣品，以蒸餾水為空白吸光值記為A空白，試劑本底的照吸光值記為A對(duì)照。

1.2.5.3 菜籽粕蛋白質(zhì)提取物抑菌特性探究 采用牛津杯抑菌圈法研究菜籽粕酸沉蛋白及酸溶蛋白提取物對(duì)金黃色葡萄球菌（S.aureus）、大腸桿菌（E.coli）、黃青霉菌（P.chrysogenum）的抗菌特性[15]。

首先將S.aureus、E.coli于LB瓊脂培養(yǎng)基中活化24 h，挑取單菌落接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基，于37 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h后，將菌體濃度調(diào)整至約為1.0×107CFU/mL的菌懸液備用。P.chrysogenum接種到PDA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)48 h后，用含有0.1%吐溫80的無菌水制備其孢子懸浮液，并將孢子懸浮液濃度調(diào)整為1.0×107孢子/mL。

分別吸取上述制備的S.aureus、E.coli菌懸液、P.chrysogenum孢子懸浮液0.02 mL接種到LB瓊脂培養(yǎng)基及PDA培養(yǎng)基上并涂布均勻后，分布在牛津杯中加入0.05 mL酸沉淀蛋白溶液與酸溶蛋白提取物溶液，并以無菌PBS為對(duì)照，S.aureus、E.coli培養(yǎng)24 h，P.chrysogenum培養(yǎng)48 h后，觀察其抑菌效果。

1.3 數(shù)據(jù)分析

研究中實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD），采用Design Expert 8.0.6、Origin 2017和SPSS 20對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菜籽餅粕蛋白堿溶條件單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 堿溶pH對(duì)堿溶液中蛋白質(zhì)和硫苷溶出效果的影響 菜籽餅粕蛋白質(zhì)的提取受到環(huán)境pH的影響顯著（P<0.05），且一般高強(qiáng)度堿溶浸提工藝更有利于氮物質(zhì)的溶出[9]。如圖1所示，堿溶液中蛋白質(zhì)的溶出率隨pH的增加而增大，并在pH為13.0條件下發(fā)生顯著增高（P<0.05），且在pH13.5時(shí)達(dá)到最大（約為8.78%）而后降低，這可能與餅粕中蛋白質(zhì)與植酸類物質(zhì)的結(jié)合穩(wěn)定性受pH影響有關(guān)，即植酸可與菜籽蛋白中的賴氨酸（pKa=10.53）、精氨酸（pKa=12.48）分別通過-NH2、-CN3H4發(fā)生相互作用，隨著堿溶階段pH的增大，蛋白-植酸復(fù)合物的穩(wěn)定性會(huì)逐漸下降，進(jìn)而提高蛋白質(zhì)的溶出效果[16]。FETZER等[17]的研究也表明弱堿性浸提環(huán)境對(duì)菜籽粕蛋白的提取效果無顯著影響，只有當(dāng)pH增加至11.0后，蛋白質(zhì)提取率才會(huì)明顯提升約9%～12%。從圖1可看出，堿溶液中硫苷的含量隨pH的增大表現(xiàn)出先降低后增高的趨勢(shì)，并在pH13.0時(shí)達(dá)到最低，為（1.15%±0.01%），與ZHANG等[9]研究發(fā)現(xiàn)的硫苷在中高強(qiáng)度堿環(huán)境浸提過程中會(huì)隨pH的增加出現(xiàn)降低的結(jié)果相吻合，這主要與硫苷在較強(qiáng)堿性條件下會(huì)轉(zhuǎn)化為3-丁烯腈及硫葡糖等小分子有關(guān)[18]。另外，實(shí)驗(yàn)中可發(fā)現(xiàn)在相對(duì)較弱的堿性浸提環(huán)境中，蛋白質(zhì)和硫苷的溶出比例成反比，以蛋白質(zhì)溶出最大化同時(shí)盡可能降低硫苷的溶出率，本實(shí)驗(yàn)優(yōu)選pH13.0進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。此外，本研究pH與以往文獻(xiàn)優(yōu)化pH相比較高，主要是因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)以物料混合前水溶液pH為優(yōu)化值[9,17,19]。

圖1 堿溶pH對(duì)蛋白及硫苷溶出的影響Fig.1 Effects of alkali pH on the protein and glucosinolates content

2.1.2 堿溶時(shí)間對(duì)堿溶液中蛋白質(zhì)和硫苷溶出率的影響 由圖2可以看出，菜籽餅粕堿溶液中的蛋白質(zhì)溶出率與硫苷溶出率變化規(guī)律一致，均隨著浸提時(shí)間的延長表現(xiàn)出先增加后持平或緩慢下降的趨勢(shì)，并在浸提時(shí)間為80 min時(shí)達(dá)到最大，此時(shí)堿溶液中蛋白質(zhì)和硫苷的溶出率分別為（7.86%±0.09%）和（1.16%±0.01%）。對(duì)比以往研究也可發(fā)現(xiàn)，當(dāng)堿溶浸提至一定時(shí)間后，浸提時(shí)間的延長對(duì)有效物質(zhì)的溶出已無明顯作用，多次短時(shí)浸提可能在實(shí)際操作過程中更有利于提高生產(chǎn)效率[17]。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)選80 min進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖2 提取時(shí)間對(duì)蛋白及硫苷溶出的影響Fig.2 Effects of extraction time on the protein and glucosinolates content

2.1.3 堿溶溫度對(duì)堿溶液中蛋白質(zhì)和硫苷溶出率的影響 圖3顯示，堿溶浸提溫度的提高有利于餅粕中蛋白質(zhì)和硫苷的溶出，且對(duì)硫苷溶出的影響較大。其中，當(dāng)浸提溫度升高至65、75 ℃時(shí)蛋白質(zhì)溶出率分別為（9.77%±0.01%）、（9.80%±0.01%），雖略有提高但已無顯著性差異（P>0.05），而硫苷的溶出率則顯著增加（P<0.05）。浸提溫度有利于蛋白質(zhì)溶出的這一現(xiàn)象與羅群等[20]的研究一致，但與FETZER等[17]研究發(fā)現(xiàn)的常溫更有利于蛋白質(zhì)溶出的現(xiàn)象有出入，這可能與實(shí)驗(yàn)中菜籽餅粕的制備方式有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)基于最大化提高蛋白質(zhì)提取效率的同時(shí)降低硫苷溶出的原則，優(yōu)選55 ℃進(jìn)行料液比單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)選。

圖3 提取溫度對(duì)蛋白及硫苷溶出的影響Fig.3 Effects of extraction temperature on the protein and glucosinolates content

2.1.4 料液比對(duì)堿溶液中蛋白質(zhì)和硫苷溶出率的影響 增大物料與溶劑的接觸面積一定程度上有利于目標(biāo)物質(zhì)提取效率的提高。以往研究通常選用1:5～1:20的料液比（g/mL）進(jìn)行研究，并發(fā)現(xiàn)料液比并不會(huì)顯著提高蛋白質(zhì)的提取效率[21,17]，基于此，本研究以1:20為料液比起始值，料液比對(duì)菜籽餅粕堿溶條件下蛋白質(zhì)和硫苷溶出率的影響如圖4所示：當(dāng)料液比在1:20～1:40 g/mL范圍內(nèi)時(shí)，隨著料液比的增加，堿溶液中蛋白質(zhì)的溶出率逐步增大并在1:40 g/mL達(dá)到最大（9.77%±0.01%），相比較而言，硫苷的溶出率受料液比的影響較小，整體趨勢(shì)相對(duì)平緩；當(dāng)料液比>1:40 g/mL后，料液比的增加對(duì)蛋白質(zhì)和硫苷的溶出均無明顯影響。綜合實(shí)際生產(chǎn)節(jié)水，優(yōu)選1:40 g/mL的料液比。

圖4 料液比對(duì)蛋白及硫苷溶出的影響Fig.4 Effects of the ratio of material to solvent on the protein and glucosinolates content

2.2 菜籽餅粕蛋白堿溶條件響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上確定料液比為1:40 g/mL，以pH（X1）、浸提時(shí)間（X2）和浸提溫度（X3）3因素為自變量，以蛋白質(zhì)溶出率為響應(yīng)值（Y1）、硫苷溶出率為響應(yīng)值（Y2），采用響應(yīng)面法進(jìn)行三因素三水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共包括17組試驗(yàn)方案。試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiment

2.2.2 模型建立與方差分析 利用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析（見表3，表4），對(duì)擬合回歸方程進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，將數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到蛋白質(zhì)溶出率（Y1）與pH（X1）、浸提時(shí)間（X2）和浸提溫度（X3）的二次響應(yīng)面回歸方程為：

表3 蛋白質(zhì)溶出率回歸方程的方差分析Table 3 Analysis of variance for protein yield’s regression equation

表4 硫苷溶出率回歸方程的方差分析Table 4 Analysis of variance for glucosinolate content’s regression equation

硫苷溶出率（Y2）與pH（X1）、浸提時(shí)間（X2）和浸提溫度（X3）的二次響應(yīng)面回歸方程為：

由表3、表4可知，兩模型的P值均<0.0001，表明模型擬合效果顯著，能很好地反映變量與響應(yīng)變量之間的關(guān)系；兩回歸模型的失擬項(xiàng)分別為0.0504、0.0882，即失擬不顯著, 并且多元決定系數(shù)分別為R2=0.9976、R2=0.9928，擬合效果較好。另外，回歸方程一次項(xiàng)系數(shù)絕對(duì)值的大小，決定了各因素對(duì)響應(yīng)值影響的主次順序，可看出，浸提pH是影響菜籽餅粕堿溶蛋白質(zhì)溶出的關(guān)鍵因素（P<0.0001），其次浸提時(shí)間（P=0.0024）與溫度（P<0.0001）；就硫苷溶出率而言，各因素的影響大小為浸提溫度（P<0.0001）>浸提pH（P=0.0087）>浸提時(shí)間（P=0.0158）。

2.2.3 響應(yīng)面分析 在模型分析的基礎(chǔ)上，圖5展示了交互因素對(duì)菜籽粕蛋白質(zhì)堿溶浸提工藝的影響效果，結(jié)合擬合方程，堿性條件下的蛋白質(zhì)與硫苷溶出率均受浸提pH與浸提溫度的交互影響較大，其中，浸提pH與浸提溫度的交互作用可顯著影響蛋白質(zhì)的溶出效果（P＝0.0016）。以蛋白質(zhì)溶出率最大且硫苷溶出率最低，分析優(yōu)化得到脫脂菜籽餅粕蛋白質(zhì)堿溶優(yōu)化的提取條件為pH13.16，浸提時(shí)間82.07 min，浸提溫度45.71 ℃，該條件下理論蛋白質(zhì)溶出率為8.42%、硫苷溶出率為1.60%。經(jīng)修正確定最終工藝參數(shù)為pH13.1，浸提時(shí)間82 min，浸提溫度46 ℃，液料比1:40 g/mL，此條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，得到蛋白質(zhì)溶出率平均值為8.78%、硫苷溶出率平均值為1.65%，與理論值相比，實(shí)驗(yàn)值和預(yù)測(cè)值具有良好的相關(guān)性，說明該響應(yīng)面模型和最優(yōu)化條件是有效的。

圖5 交互因素對(duì)蛋白和硫苷溶出率的影響Fig.5 Effects of the interaction of various factors on the protein yield and glucosinolates content

2.3 菜籽餅粕蛋白酸沉最優(yōu)條件

菜籽蛋白等電點(diǎn)寬泛，約為3～9[22]，堿溶酸沉工藝中酸沉條件的選擇會(huì)直接影響蛋白的回收率及其物化性質(zhì)[2,23]，前期有研究發(fā)現(xiàn)菜籽蛋白在pH4.5～5.5間回收率最高[23]，AKBARI等[24]則表明pH4.0酸沉條件下獲得的蛋白質(zhì)與pH4.5酸沉條件下的蛋白質(zhì)純度更高。本實(shí)驗(yàn)在堿溶工藝條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，以酸沉蛋白得率最高為指標(biāo)，對(duì)菜籽粕蛋白的最佳酸沉條件（pH條件設(shè)置1、2、3、4、4.2、4.4、4.6、4.8、5）進(jìn)行篩選，結(jié)果如圖6所示，堿溶液中的蛋白質(zhì)的沉淀率在pH1～5的范圍內(nèi)隨著pH的增大呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，并在pH4時(shí)酸沉條件下沉淀率最大，約為10.48%，該變化趨勢(shì)與ZHANG等的[9]研究結(jié)果相一致，這主要與菜籽蛋白的各組成成分不同的等電點(diǎn)值相關(guān)。

圖6 酸沉pH對(duì)蛋白制備的影響Fig.6 Effects of acid precipitation pH on rapeseed protein

2.4 菜籽餅粕蛋白提取物SDS-PAGE分析

圖7為菜籽餅粕堿溶液、菜籽餅粕酸沉蛋白和菜籽餅粕酸溶蛋白提取物的SDS-PAGE圖。前期研究表明，菜籽蛋白主要包含有11/12S球蛋白，該蛋白可降解為6個(gè)亞基，每個(gè)亞基由α-（約30～40 kDa）和β-（約20 kDa）兩條多肽鏈以二硫鍵鏈接組成；以及N1.7/2S白蛋白，其由兩條不同分子量（10～12 kDa與3～6 kDa）的肽鏈組成[25?26]。從圖7可以看出，堿溶液樣品中的蛋白條帶主要集中分布<41 kDa以下，其中，低分子量蛋白相對(duì)較多，這與其蛋白含量及一定程度的水解有關(guān)[27]。對(duì)比分析酸沉蛋白與酸溶蛋白提取物中的蛋白條帶可發(fā)現(xiàn)，酸沉蛋白的條帶在31 、14～22 及<14.4 kDa間均有分布，即含有一定的球蛋白及白蛋白，表示蛋白種類及水解物相對(duì)較多；相比而言，酸溶蛋白提取物則主要為白蛋白（14.4 kDa）及小分子水解物[28]。進(jìn)一步分析，菜籽餅粕酸沉蛋白與酸溶蛋白提取物中的粗蛋白含量分別為（78.10%±0.53%）、（15.25%±0.17%）。

圖7 菜籽粕蛋白提取物的SDS-PAGE圖譜Fig.7 SDS-PAGE of rapeseed meal protein extracts

2.5 菜籽餅粕蛋白提取物的活性

2.5.1 菜籽餅粕蛋白清除ABTS自由基的活性 菜籽蛋白及其水解物已被報(bào)道具有一定的生物活性，如增強(qiáng)免疫、抗氧化活性及抑菌等[1]。實(shí)驗(yàn)選取ABTS陽離子自由基為對(duì)象，對(duì)菜籽餅粕蛋白提取物的體外抗氧化活性進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明同等粗蛋白含量的菜籽粕酸溶蛋白提取物其自由基清除率與酸沉蛋白相比更高，兩者的EC50值分別為0.438、1.372 mg/mL（如圖8所示），推測(cè)一是主要與兩者的蛋白組成種類有關(guān)，其中，酸溶蛋白中多為分子量較小的白蛋白與其蛋白質(zhì)水解物，在自由基體系中暴露的疏水性基團(tuán)較多，更易與ABTS接觸發(fā)生氫原子轉(zhuǎn)移[4,29]；二是可能與提取物中其他組分如多糖等有關(guān)。

圖8 菜籽粕蛋白提取物的ABTS自由基清除能力Fig.8 ABTS free radical scavenging ability of rapeseed protein extracts

2.5.2 菜籽餅粕蛋白的抑菌能力 進(jìn)一步對(duì)兩種蛋白提取物的抑菌性進(jìn)行了分析，其中，兩者均表現(xiàn)出一定的抑制金黃色葡萄球菌生長的能力（圖9），且酸沉淀蛋白發(fā)揮作用的濃度低于酸溶蛋白提取物，即酸沉蛋白具有較強(qiáng)的抑制金黃色葡萄球菌生長的能力，如圖9a所示，10 mg/mL與5 mg/mL酸沉蛋白的抑菌圈直徑分別約為15.23 mm與11.02 mm，這與DUAN等[30]發(fā)現(xiàn)菜籽球蛋白與菜籽白蛋白相比更易獲得抗菌肽相一致；此外，兩者對(duì)大腸桿菌及黃青霉的生長幾乎無抑制能力。

圖9 菜籽粕蛋白提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用Fig.9 Inhibition of rapeseed protein extracts on S.aureus

3 結(jié)論

菜籽餅粕富含蛋白質(zhì)，本文對(duì)菜籽餅粕蛋白的堿溶酸沉工藝進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化，結(jié)果表明：菜籽餅粕經(jīng)脫脂處理后，在pH13.1的條件下以1:40 g/mL的料液比、46 ℃條件下浸提82 min后，其蛋白質(zhì)溶出率可達(dá)8.78%且硫苷溶出率相對(duì)較低為1.65%；進(jìn)一步，調(diào)節(jié)菜籽餅粕蛋白堿提取液的pH至4.0，冷凍離心后，分別對(duì)其沉淀物及上清液進(jìn)行凍干和噴霧干燥處理，可得到菜籽餅粕酸沉蛋白與酸溶蛋白提取物，SDS-PAGE結(jié)果顯示：酸沉蛋白分子量在31、14～22及<14.4 kDa間均有分布，主要為菜籽球蛋白；菜籽餅粕酸溶蛋白提取物的分子量主要分布在<14.4 kDa左右，主要為菜籽白蛋白；且兩種不同提取物的粗蛋白含量分別為（78.10%±0.53%）與（15.25%±0.17%）。此外，兩者都表現(xiàn)出了一定的體外ABTS自由基清除及抑制金黃色葡萄球菌生長的能力。本實(shí)驗(yàn)為菜籽餅粕蛋白的開發(fā)利用提供了一定的理論支撐，進(jìn)一步可對(duì)菜籽餅粕蛋白提取物的結(jié)構(gòu)及其加工特性進(jìn)行研究。