栗學(xué)清，龐 鑫，高慧芳，張廉蕓，宋英達(dá)，武翠玲,

（1.長治醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，山西 長治 046000；2.長治醫(yī)學(xué)院精神衛(wèi)生系，山西 長治 046000；3.長治醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，山西 長治 046000）

角蛋白（keratin）廣泛存在于生物體的組織結(jié)構(gòu)中，包括軟角蛋白和硬角蛋白兩大類[1?3]。其中，纖維化的硬角蛋白在自然界中有多種存在形式，包括動物的毛發(fā)、羽毛、指甲、蹄、殼、爪、角和鱗片等。由于角蛋白富含二硫鍵并且高度交聯(lián)，使其結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，不易被普通蛋白酶水解[4?7]。近年來，隨著養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，在畜禽產(chǎn)品加工過程中產(chǎn)生大量的毛發(fā)和羽毛等角蛋白廢棄物，如不加以有效利用，既浪費資源又污染環(huán)境[8]。用傳統(tǒng)的物理化學(xué)法降解角蛋白不僅存在工藝繁瑣、條件劇烈、污染嚴(yán)重等問題，且氨基酸破壞嚴(yán)重，產(chǎn)物不均一，利用率低[9?11]。因此，探究高效、環(huán)保的角蛋白降解方法具有重要的應(yīng)用價值。

角蛋白酶是一種特殊的蛋白酶類，能特異性降解角蛋白，在飼料和食品工業(yè)、醫(yī)療業(yè)、美容業(yè)、環(huán)境治理等方面具有廣闊的應(yīng)用前景[12?13]。如角蛋白酶可以降解羽毛等角蛋白，將其轉(zhuǎn)化為動物蛋白質(zhì)飼料；羽毛角蛋白中還含有豐富的谷氨酸、天冬氨酸等鮮味氨基酸，可以用來制作新型食品添加劑應(yīng)用到食品加工業(yè)中；角蛋白酶可用于肉制品嫩化、燕窩脫毛以及蠶絲脫膠；角蛋白酶可改善藥物在皮膚角質(zhì)層中的通透性，提高皮膚外用藥物的療效；另外，角蛋白酶還可以用于頭發(fā)護(hù)理品，脫毛膏的制作等[14?15]。目前市售角蛋白酶主要來源于陸地微生物，如Bacillussp.，Xanthomonas maltophilia和Stenotrophomonassp.[16?18]等。有關(guān)海洋菌來源的角蛋白酶報道較少，且缺乏系統(tǒng)的研究。海洋菌分泌的蛋白酶具有陸地菌無法比擬的優(yōu)越性，如對鹽、去污劑及有機溶劑等的耐受性比較好，在皮革生產(chǎn)、污水處理等鹽離子濃度和有機溶劑濃度較高的工業(yè)環(huán)境中具有更為實際的應(yīng)用價值和廣闊的應(yīng)用前景。此外，海洋菌分泌的蛋白酶在較低的溫度下仍具有較高的酶活性[19?20]，在實際應(yīng)用中可有效節(jié)約成本。因此，探索海洋菌來源的角蛋白酶及其催化機制具有重要的意義。

角蛋白酶KerQH2來源于海洋菌Rheinheimerasp.QH，前期研究發(fā)現(xiàn)KerQH2對羽毛角蛋白具有高效降解能力，且對有機試劑和去污劑具有很強的耐受性，具有潛在的工業(yè)應(yīng)用價值。本文利用生物信息學(xué)軟件對角蛋白酶KerQH2的氨基酸組成特點、結(jié)構(gòu)特征，對不同不可溶角蛋白底物的酶切位點、與底物分子的相互作用及發(fā)揮作用的可能關(guān)鍵氨基酸位點進(jìn)行了預(yù)測，以期為深入探究角蛋白酶KerQH2高效降解角蛋白的催化機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Rheinheimerasp.QH分離自渤海潮間帶，將菌株Rheinheimerasp.QH活化后接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，20 ℃，200 r/min, 培養(yǎng)96 h，8000×g離心10 min，上清即為粗酶液。粗酶液經(jīng)離子交換層析、SDSPAGE純化后得到角蛋白酶KerQH2，對KerQH2進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，結(jié)果顯示KerQH2為S8家族絲氨酸蛋白酶。

1.2 實驗方法

利用相關(guān)生物信息學(xué)分析軟件及在線工具對KerQH2氨基酸序列進(jìn)行分析，表1列出分析項目所應(yīng)用的在線工具及網(wǎng)址。

表1 生物信息學(xué)分析工具Table 1 Bioinformatics analysis tools

2 結(jié)果與分析

2.1 角蛋白酶KerQH2的理化性質(zhì)分析

通過ExPASy: ProtParam（https://web.expasy.org/Protparam/）對角蛋白酶KerQH2的氨基酸組成及理化性質(zhì)進(jìn)行分析（表2），發(fā)現(xiàn)Gly（11.41%）、Ala（11.98%）、Val（7.79%）與Ser（10.27%）含量相對較高，Cys（1.33%）與Trp（1.52%）含量較低，堿性氨基酸（Arg、Lys、His）含量略高于酸性氨基酸（Asp、Glu），等電點7.18，脂肪指數(shù)70.2，蛋白酶不穩(wěn)定系數(shù)小于40，穩(wěn)定性較好。由ProtScale的K-D預(yù)測算法對KerQH2的疏水性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示為親水性蛋白質(zhì)。

表2 角蛋白酶KerQH2的氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of keratinase KerQH2

2.2 角蛋白酶KerQH2的二級結(jié)構(gòu)分析

通過PredictProtein（https://www.predictProtein.org/）網(wǎng)站對角蛋白酶KerQH2的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示KerQH2中α-螺旋和β-折疊總的占比較低（分別為14.1%和23.2%），無規(guī)則卷曲的含量為62.7%。其中溶劑可及性分析顯示α-螺旋與β-折疊多分布于酶分子的內(nèi)部，而無規(guī)則卷曲多處于酶分子表面。有研究表明，β-折疊和α-螺旋等二級結(jié)構(gòu)形式更有利于維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[21?22]，而無規(guī)則卷曲則更易于去折疊而使蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變[23]，推測該結(jié)構(gòu)特征有助于KerQH2對結(jié)構(gòu)復(fù)雜角蛋白的降解。此外，前期酶學(xué)性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)角蛋白酶KerQH2相較于已報道的角蛋白酶在催化性能方面具有的一些優(yōu)越性，如對有機溶劑DMSO、氯仿、乙醇的耐受性極好，SDS對酶具有一定的促進(jìn)作用等，這些特性可能與其結(jié)構(gòu)特征有一定的相關(guān)性。

2.3 角蛋白酶KerQH2的底物裂解位點預(yù)測

從UniProt數(shù)據(jù)庫中選取角蛋白序列P02451（Larus novaehollandiae）、P02450（Gallus gallus）、Q9BYR7（Homo sapiens）、Q24JX8（Bos taurus）、P02445（Ovis aries）和P02447（Capra hircus），利用蛋白酶特異性預(yù)測服務(wù)器Prosper （https://Prosper.erc.monash.edu.au/home.html），對角蛋白酶KerQH2的底物裂解位點進(jìn)行預(yù)測[24]。不同類型蛋白酶具有不同的酶切位點，蛋白酶主要包括天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶和絲氨酸蛋白酶等類型，角蛋白酶KerQH2為S8家族絲氨酸蛋白酶，圖1和表3顯示了角蛋白酶KerQH2對不同來源角蛋白的裂解位點。角蛋白酶KerQH2主要切割疏水性氨基酸Val（V）/ILe（I）和極性氨基酸Cys（C）/Gln（Q）之間形成的肽鍵。KerQH2在底物角蛋白Q9BYR7、P02445和Q24JX8上的酶切位點更豐富，因此推測KerQH2對人、牛和綿羊來源角蛋白的降解效率更高。

表3 角蛋白酶KerQH2對角蛋白的裂解位點Table 3 Keratinase KerQH2 cleavage sites on the keratin

圖1 角蛋白酶KerQH2在底物角蛋白上的裂解位點Fig.1 The cleavage sites of keratinase KerQH2 on the keratin

2.4 多序列比對分析

對KerQH2以及從NCBI下載的15個Rheinheimera屬和Bacillus屬來源的角蛋白酶催化結(jié)構(gòu)域進(jìn)行多序列比對，結(jié)果如圖2所示，不同來源角蛋白酶由Asp（D8）、His（H41）和Ser（S197）構(gòu)成的催化三聯(lián)體高度保守。其中，Asp（D8）位于基序Xaa-Xaa-Asp-Xbb-Gly中（Xaa為非極性氨基酸，Xbb為極性氨基酸），His（H41）位于基序His-Gly-Thr-Xcc-Xaa-Ala-Gly中（Xcc為His/Ala），Ser（S197）位于基序Gly-Thr-Ser-Met-Ala-Xbb-Xaa中。一些極性氨基酸和芳香族氨基酸也高度保守，如：Asp（17、37）、Thr（43、184、196）、Asn（54、135）、Ser（105、166、183）、Pro（144、177）和Tyr（147、190）等。這些氨基酸可能在底物結(jié)合中發(fā)揮著重要作用[25?26]。而大量保守的Gly和Ala，則由于其分子側(cè)鏈較小，因此賦予了角蛋白酶較大的自由度。此外，還存在一些共有序列如：Ser105-Gly109、Ala132-Ala136和Ser142-Ala145等。上述結(jié)構(gòu)特征，可能在KerQH2降解不可溶底物中發(fā)揮著重要作用。

圖2 角蛋白酶的多序列比對分析Fig.2 Multiple sequences alignment analysis of keratinase protein sequences

2.5 角蛋白酶KerQH2的同源建模及表面靜電勢分析

利 用 在 線 軟 件 SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）蛋白質(zhì)建模數(shù)據(jù)庫，以枯草桿菌蛋白酶（PDB：1SCN.1.N，相似度45.98%）為模板進(jìn)行同源建模，獲得角蛋白酶KerQH2催化結(jié)構(gòu)域的模型。利用蛋白質(zhì)分析軟件Discovery Studio 2016分析其結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)KerQH2催化結(jié)構(gòu)域含有5個α-螺旋、8個β-折疊，其中Asp8、His41和Ser197構(gòu)成催化三聯(lián)體。通過PyMol 2.5.0 軟件對KerQH2進(jìn)行表面靜電勢分析，結(jié)果如圖3所示，角蛋白酶KerQH2中催化三聯(lián)體所處空穴多為不帶電荷區(qū)域，這與文獻(xiàn)報道的來自Pyrococcus furiosus（PMDB ID: PM0075943）的絲氨酸蛋白酶有所不同，同時研究中還提到蛋白酶的功能多樣性及環(huán)境適應(yīng)性與其表面靜電勢分布有關(guān)[27]，因此推測角蛋白酶KerQH2催化三聯(lián)體區(qū)域的表面靜電勢分布可能與其對不可溶角蛋白底物的特異性吸附、降解有關(guān)。

圖3 角蛋白酶KerQH2催化結(jié)構(gòu)域的同源模建Fig.3 Modeled catalytic domain of keratinase KerQH2

2.6 角蛋白酶KerQH2與底物Q9BYR7的分子對接

以枯草桿菌蛋白酶為模板進(jìn)行同源建模，獲得角蛋白酶KerQH2催化結(jié)構(gòu)域的模型，以PDB:6u9w.1.A為模板進(jìn)行同源建模，獲得底物Q9BYR7的結(jié)構(gòu)模型。通過Discovery studio分別生成KerQH2及底物Q9BYR7的拉氏圖，以評價模型的合理性。如圖4c中允許區(qū)（藍(lán)色區(qū)域）和最大允許區(qū)（紫色區(qū)域）內(nèi)的氨基酸為合理氨基酸，不允許區(qū)域（空白區(qū)域）的氨基酸為不合理氨基酸。從拉氏圖可以看出，超過90%的氨基酸殘基都落在允許區(qū)域和最大允許區(qū)域內(nèi)，KerQH2與Q9BYR7的三維結(jié)構(gòu)模型是可信的，可以用于進(jìn)一步研究。

圖4 角蛋白酶KerQH2和角蛋白Q9BYR7的建模結(jié)果及拉氏圖Fig.4 The modeling results and Ramachandran plots of keratinase KerQH2 and keratin Q9BYR7

將角蛋白酶KerQH2的催化結(jié)構(gòu)域和底物角蛋白Q9BYR7同時置于一個CELL晶格中，在 DOCK PROTEINS 模塊中進(jìn)行對接，歐拉角度設(shè)置為 6°。蛋白對接結(jié)果顯示（圖5），KerQH2與Q9BYR7的Zdock Score為12.14，E-Rdock為-24.7547，結(jié)合較好。分析對接結(jié)果，KerQH2有32個氨基酸殘基在理論上能夠與Q9BYR7的17個氨基酸殘基發(fā)生相互作用，維持結(jié)合穩(wěn)定性。KerQH2中互作氨基酸分別為：His41、Phe75、Gly79、Trp81、Thr82、Ser105-Ser111、Gly134-Thr139、Ser142、Tyr143、Val156、Asn157、Leu162-Phe165、Gln167、Val179、Asn180、Ile193、Ser194、Gly195和Ser197。Q9BYR7中互作氨基酸分別為：Lys24、Ser25、Arg27、Cys36、His38-Cys48、Asn50和Cys51。KerQH2與Q9BYR7的氨基酸殘基形成三組分子間氫鍵，其中，Ser164:Asn50和Gly109-Ser110:His38兩組氫鍵單獨存在，位于相互作用面的兩側(cè)，使酶催化結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象發(fā)生了輕微改變，“凹”字型的凹陷處向外撐開，暴露出酶的催化三聯(lián)體（Asp8、His41和Ser197）。而Gly134:Leu42、Asn135:（Leu42、Leu43、Pro45）、Ala136:Ser25、 Asn138:Lys24、 Trp81:Glu44和 Gly107:（Leu42、Leu43）這六個氫鍵構(gòu)成一組氫鍵，位于相互作用面中心，使酶-底物復(fù)合物結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。KerQH2與Q9BYR7形成His41:Leu43和Trp81:（Cys36、Val40、Leu43）兩處Pi鍵，維持著酶-底物復(fù)合物的穩(wěn)定性。

圖5 角蛋白酶KerQH2與底物Q9BYR7的分子對接Fig.5 Molecular docking of keratinase KerQH2 with substrate Q9BYR7

此外，結(jié)合KerQH2與底物Q9BYR7的分子對接結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)共有序列Ser105-Gly109、Ala132-Ala136和Ser142-Ala145參與了底物的結(jié)合，同時，共有序列中富含的Gly和Ala不僅增加了結(jié)合位點的疏水性，而且減少了側(cè)鏈空間位阻，更有利于角蛋白酶與底物的結(jié)合，與文獻(xiàn)中的報道一致[28]。

2.7 系統(tǒng)發(fā)育分析

將KerQH2的氨基酸序列以及從NCBI下載的15個Rheinheimera屬和Bacillus屬來源的角蛋白酶氨基酸序列，運用MEGA 6.0軟件中的鄰接法（neighbor-joining，NJ）進(jìn)行分子系統(tǒng)發(fā)育分析，采用默認(rèn)參數(shù)，得到分子進(jìn)化樹（圖6），可以較為精確地確定其進(jìn)化地位[29?30]。角蛋白酶KerQH2和Rheinheimera屬來源的蛋白WP173499773.1分支聚在一起，具有較近的親緣關(guān)系, 且不同種屬來源的角蛋白酶具有一定的保守性。

圖6 角蛋白酶KerQH2的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.6 Phylogenetic analysis of the keratinase KerQH2

3 結(jié)論

對海洋菌Rheinheimerasp.QH分泌的角蛋白酶KerQH2的結(jié)構(gòu)特征、角蛋白底物的作用位點及關(guān)鍵氨基酸位點的預(yù)測結(jié)果表明，角蛋白酶KerQH2的特殊結(jié)構(gòu)有助于其降解結(jié)構(gòu)復(fù)雜的角蛋白分子，這可能是海洋菌對海洋寡營養(yǎng)環(huán)境的一種適應(yīng)性[31?32]。本研究結(jié)果為進(jìn)一步深入研究KerQH2的降解機制提供了一定的理論依據(jù)，為角蛋白酶KerQH2的推廣和應(yīng)用奠定了一定的理論基礎(chǔ)。后期本團(tuán)隊將針對這些位點，構(gòu)建一系列突變體，進(jìn)一步驗證這些氨基酸對角蛋白酶KerQH2活性的影響。