劉 洋，陳勤操，劉德春，楊 莉，胡 威，匡柳青，劉 勇，滕 杰

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，江西 南昌 330045）

多酚氧化酶（polyphenol oxidase, PPO，EC.1.10.3.1）是一類Cu2+輔基結(jié)合酶，廣泛存在于動物、植物、真菌體內(nèi)和腐爛的植物殘渣中[1]。茶葉PPO是茶樹體內(nèi)重要的酶類之一，不僅對茶樹生理代謝起重要作用，而且在茶葉加工過程中通過不同程度的抑制或利用PPO活性，可將茶葉制作成不同茶類[2]。紅茶加工中PPO催化黃烷醇類氧化形成醌，醌再經(jīng)氧化縮合成更復(fù)雜的發(fā)酵產(chǎn)物如茶黃素、茶紅素等茶色素[3?4]，其中，茶黃素對紅茶的色香味和品質(zhì)起到關(guān)鍵作用，同時對人體具有多種營養(yǎng)功效，如抗氧化[5]、抗腫瘤[6]、抑菌[7]、降脂[8]等。茶黃素在醫(yī)藥及食品行業(yè)具有很大的應(yīng)用前景，然而紅茶中茶黃素含量僅有2～20 g/kg，體外酶促合成茶黃素是其生產(chǎn)的重要途徑之一。因此，快速有效的獲取茶葉PPO具有重要的現(xiàn)實意義。

PPO的純化實質(zhì)是除雜蛋白、純化目標(biāo)蛋白的過程，主要方法有沉淀分離法和層析分離法[9]。沉淀分離法常用于茶葉PPO的初分離，采用硫酸銨分級沉淀，全過程保持低溫。層析分離法則多用于沉淀分離后制備精制茶葉PPO，主要方法有吸附層析、離子交換層析、凝膠過濾層析和親和層析等[10]。層析法能獲得高純度的茶葉PPO，但對儀器設(shè)備要求較高、純化時間長、操作復(fù)雜，難以在實際生產(chǎn)中大規(guī)模應(yīng)用。三相分離法（three phase partitioning, TPP）是通過向粗提取液中加入一定比例的鹽和有機溶劑使混合液產(chǎn)生明顯的分層，使部分蛋白聚集在有機相和水相間的沉淀層，低分子質(zhì)量色素、膜脂等溶解在有機層，糖類、部分蛋白質(zhì)溶解在水層，從而達到提取純化目標(biāo)物質(zhì)的方法[11]。研究表明三相純化分離法適用于番薯過氧化酶[12]、脫脂豆粉脂肪氧合酶[13]、琉璃苣多酚氧化酶[14]等。此外，三相分離法也可用于分離純化油性樹脂[15]、米糠油[16]等天然物質(zhì)，將其應(yīng)用于天然物質(zhì)的分離純化具有廣闊前景。

本研究采用三相分離法純化茶葉多酚氧化酶，并分析其酶學(xué)性質(zhì)，一方面為茶葉多酚氧化酶提取方法的研究提供新的思路；另一方面為體外酶促合成茶黃素的最適反應(yīng)條件提供理論依據(jù)，促進茶葉多酚氧化酶的產(chǎn)業(yè)化利用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

龍井43號茶鮮葉（一芽二葉） 采自江西農(nóng)業(yè)大學(xué)校園茶葉基地，采摘后立馬進行液氮處理并于?80 ℃保存?zhèn)溆茫皇宥〈迹ǚ治黾儯?天津市大茂化學(xué)試劑廠；硫酸銨、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、檸檬酸、鹽酸、乙酸、抗壞血酸、PVPP、Triton-100、鄰苯二酚、愈創(chuàng)木酚、綠原酸、鄰苯三酚、沒食子酸、疊氮化鈉、氯化鈉、草酸、碘化鉀、脯氨酸、尿素等均為分析純、牛血清蛋白（標(biāo)準(zhǔn)品）、改良型BCA法蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司。

5810R型離心機 德國Eppendorf公司；SpectraMax M2型多功能酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 茶葉多酚氧化酶粗酶提取 將20 g茶鮮葉加入0.05 mol/L、pH6.8預(yù)冷的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液（含3% PVPP，30 mmol/L抗壞血酸，1 mmol/L EDTA，2% Triton-100）中，料液比為1:3（v/v），組織勻漿2 min，置于4 ℃冰箱內(nèi)浸提2 h，期間搖動3～5次，最后8000 r/min離心15 min取上清液即為茶葉PPO粗酶液。

1.2.2 三相法分離純化茶葉多酚氧化酶 三相提取法分離純化茶葉多酚氧化酶參考ALICI等[14]方法進行優(yōu)化。向一定體積的茶葉多酚氧化酶粗酶液中添加硫酸銨至15%飽和濃度，調(diào)節(jié)pH至6.5，按照1:1（v/v）體積加入叔丁醇，磁力攪拌器低速混合1 min后靜置1 h，逐漸形成三相體系。將體系以4000 r/min離心10 min，使中間相濃縮成片狀蛋白沉淀。除去上層有機相層和下層水相，收集中間沉淀相，用適量體積的0.05 mol/L、pH6.8的磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖溶液溶解并定容至20 mL，重復(fù)上述操作，再次富集分離后定容至20 mL，酶蛋白分離純化過程中均測定其酶活（U）和蛋白質(zhì)濃度，并計算每次純化后的回收率。

1.2.3 茶葉多酚氧化酶酶活測定 PPO酶活測定參照TENG等[17]的方法進行優(yōu)化。取酶液0.5 mL，加反應(yīng)混合液1.5 mL（反應(yīng)混合液按0.1 mol/L的pH5.6檸檬酸-磷酸緩沖液:0.1%脯氨酸:1.0%鄰苯二酚=10:2:3（v/v/v）進行配制）于離心管中，空白對照反應(yīng)混合液中的鄰苯二酚用緩沖液代替，其他條件相同，37 ℃孵育保溫30 min后，立即加入1.5 mL的6 mol/L尿素終止反應(yīng)，4000 r/min離心10 min，取200 μL上清液用多功能酶標(biāo)儀在420 nm下測OD值，酶活性以每克樣每分鐘E420值增加0.001為1個酶活力單位（U）。

式中：E420表示在420 nm下測得的OD值；m表示茶葉樣本取樣量，g；t表示反應(yīng)時間，min。

1.2.4 蛋白含量測定 采用改良型BCA法蛋白質(zhì)濃度試劑盒進行蛋白含量的測定，以牛血清蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，在562 nm波長處的吸光度為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算出樣品中蛋白質(zhì)含量。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)質(zhì)量對吸光度進行線性回歸得回歸方程為：y=0.0002x+0.0921，R2=0.9903。

1.2.5 茶葉多酚氧化酶酶動力學(xué)測定 酶動力學(xué)測定參照HAN等[18]的方法進行。將愈創(chuàng)木酚、鄰苯二酚、綠原酸、鄰苯三酚、沒食子酸分別配制成最終摩爾濃度為10、20、30、40、50 mmol/L的溶液，在最適反應(yīng)體系中測定最大吸收波長處的OD值。采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法求出相應(yīng)的米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速度Vmax，公式如下。

式中：v表示反應(yīng)速度，OD/min；Km表示米氏常數(shù)（測定底物的親和性），mol/L；[S]表示反應(yīng)底物的濃度，mmol/L；Vmax表示酶促反應(yīng)所達到的最大速度，OD/min。

1.2.6 茶葉多酚氧化酶最適溫度及耐熱性測定 以0.1 mol/L的pH5.6的檸檬酸—磷酸氫二鈉緩沖液配制1.0%的鄰苯二酚溶液，分別在25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80 ℃的溫度下檢測PPO酶活性。以最適溫度下酶活性為100%，計算其它溫度下的相對酶活。

以0.1 mol/L的pH5.6的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液配制1.0%的鄰苯二酚溶液，分別在25、35、45、55、65、75 ℃的溫度條件下處理0、10、20、30、40、50和60 min后檢測PPO酶活性，計算其相對酶活。

1.2.7 茶葉多酚氧化酶最適pH及酸堿穩(wěn)定測定配制0.05 mol/L的醋酸鈉緩沖溶液（pH3.0、3.5、4.0、4.5、5.0和5.5），0.05 mol/L的磷酸緩沖溶液（pH6.0、6.5、7.0和7.5），0.05 mol/L Tris-HCl緩沖溶液（pH8.0、8.5和9.0）。用pH依次為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的0.1 mol/L緩沖液分別配制成含1.0%的鄰苯二酚溶液，在最適溫度下分別檢測PPO酶活性。以最適pH條件下酶活性為100%，計算其它pH下的相對酶活。

將PPO酶液孵育在pH3.0～9.0不同酸堿度的緩沖液中（4 ℃，12 h），檢測PPO殘留活性。以磷酸緩沖液（0.05 mol/L pH6.8）中蛋白質(zhì)的活性為原始活性，計算不同pH緩沖液處理后的PPO殘留活性。

1.2.8 化合物對茶葉多酚氧化酶活性的影響 分別配制含有濃度為0.2、1.0、5.0、10.0 mmol/L的抗壞血酸、檸檬酸、疊氮化鈉、氯化鈉、EDTA、草酸、碘化鉀溶液。酶反應(yīng)體系中加入不同濃度化合物的緩沖液，以最高活性條件下的濃度為100%計算相對酶活，并計算出半抑制濃度IC50（mmol/L）分析不同化合物對茶葉PPO的抑制或激活作用。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均設(shè)置三次重復(fù)，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，顯著性分析用SPSS.21中的Turkey檢驗方法進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 純化效果分析

茶葉PPO的純化方法較多，如Triton X-100萃取法、透析法、硫酸銨沉淀法、瓊脂糖凝膠色譜分離法和Sephadex G-200凝膠色譜層析法等[19]，各方法在純化效果上存在差異。三相法提取茶葉PPO的純化效果如表1所示，經(jīng)過第一次三相純化后，總蛋白質(zhì)含量較粗酶降低了95.49%，但酶比活力升高了269.29%，純化倍數(shù)為3.69倍。經(jīng)過相同處理重復(fù)純化后，酶比活力升至210.46 U/mg，純化倍數(shù)為15.76倍，回收率為8.04%。與通過親和色譜法純化茶葉PPO獲得純化倍數(shù)為19.77倍，其回收率為2.67%的試驗結(jié)果[19]比較，純化倍數(shù)降低4.01倍，但回收率是其3.01倍；與離子交換色譜純化法純化后獲得的5.11%回收率和3.32倍純化倍數(shù)相比，三相純化法在純化倍數(shù)和回收率上的效果均優(yōu)于離子交換色譜純化法[20]。綜合說明通過三相分離法純化茶葉PPO可以得到較高純度的茶葉PPO，且提高了茶葉PPO的酶比活力。

表1 三相法提取茶葉多酚氧化酶的純化效果Table 1 Purification effect of tea PPO by TPP

2.2 底物特異性及酶動力學(xué)分析

米氏常數(shù)（Km）值表示酶對底物的親和力，值越小說明酶對底物的親和力越大[21]。以不同濃度的愈創(chuàng)木酚、鄰苯二酚、綠原酸、鄰苯三酚和沒食子酸為反應(yīng)底物，檢測三相純化后茶葉PPO的酶活性（表2），當(dāng)鄰苯三酚為底物時，米氏常數(shù)值最?。↘m=6.82 mmol/L），同時反應(yīng)速度最大（Vmax=5.36×10?2OD/min），說明PPO與鄰苯三酚的親和力最高，其次是鄰苯二酚，該結(jié)果與勐庫大葉茶種PPO粗酶液的動力學(xué)結(jié)果相似[22]。茶葉PPO對綠原酸和沒食子酸也具有不同程度的催化能力，但對于愈創(chuàng)木酚則表現(xiàn)出不親和的現(xiàn)象。表明茶葉PPO對不同底物的親和力具有明顯差異，主要原因是不同的底物具有單元酚、二元酚、多元酚等類型的區(qū)別，同時甲基-CH3的數(shù)量和位置對底物特異性具有重要影響，通常酶與底物間親和力的強弱取決于自身同工酶的組成和底物結(jié)構(gòu)[23]。上述結(jié)果表明，三相分離法純化茶葉PPO能較好的保留其底物特異性。

表2 三相法提取茶葉PPO的底物特異性及酶動力學(xué)Table 2 Substrate specificity and enzyme kinetics of tea PPO by TPP

2.3 最適溫度及耐熱性分析

溫度是影響酶促反應(yīng)最重要的因素之一，以鄰苯二酚作為底物分別在25～80 ℃系列溫度下反應(yīng)10 min，結(jié)果如圖1所示，溫度在35～55 ℃之間時，通過三相分離法純化的茶葉PPO相對酶活性較高，其中，45 ℃時相對酶活達到最高值，超過65 ℃時酶活性基本喪失。滕杰[24]在研究茶葉PPO同工酶過程中，發(fā)現(xiàn)PPO1與PPO2的最適反應(yīng)溫度分別為30與40 ℃；陳盛虎[25]在對分離出的3個PPO同工酶的最適反應(yīng)溫度進行分析時發(fā)現(xiàn)其最適溫度均不一致，最適溫度范圍為20～50 ℃。上述研究的提取方式均為色譜層析法，最適反應(yīng)溫度與提取條件關(guān)系較大[26]，因而在最適反應(yīng)條件上存在差異。

圖1 溫度對茶葉多酚氧化酶活性的影響Fig.1 Effect of temperature on the activity of PPO from tea

將制備的茶葉PPO分別置于25～75 ℃梯度溫度下，每間隔10 min檢測其相對酶活，結(jié)果如圖2所示，茶葉PPO在25 ℃處理1 h后能保持50%以上的酶活，在25～45 ℃間處理1 h后均保留酶活力，說明在45 ℃以下時，三相法提取的茶葉PPO能表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性。而隨著溫度的增加活性呈現(xiàn)顯著下降（P<0.05），特別是75 ℃處理30 min后酶活性幾乎喪失。研究發(fā)現(xiàn)：龍井43號茶樹多酚氧化酶粗酶的熱穩(wěn)定性在40 ℃時最高，其同工酶在30 ℃時熱穩(wěn)定性最高[27]，其結(jié)果與本研究結(jié)果相似，因此，運用三相分離法提取茶葉多酚氧化酶能較好的保留其熱穩(wěn)定性。酶活力的喪失與酶蛋白空間構(gòu)型的改變有直接關(guān)系，熱處理是改變酶蛋白活動中心結(jié)構(gòu)的常見方法[28]。高溫能改變H鍵或疏水鍵，使酶空間構(gòu)型發(fā)生變化，活性喪失。茶葉PPO在25～45 ℃范圍內(nèi)仍保留酶活力，說明在此范圍內(nèi)僅有部分PPO構(gòu)型發(fā)生改變，酶活性保留較高。

圖2 溫度對茶葉多酚氧化酶熱穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of temperature on stability of PPO from tea

2.4 最適pH及酸堿穩(wěn)定性分析

不同pH對純化后茶葉PPO酶活性影響如圖3所示，茶葉PPO出現(xiàn)了2個酶活性峰值，分別是pH5.5和pH7.0，其中，pH為5.5時相對酶活性高于pH7.0。虞昕磊[29]在分離純化云南大葉種PPO時獲得兩個PPO同工酶，最適pH分別為5.2和5.6。TENG等[17]純化分離政和大白茶PPO時也獲得兩個PPO同工酶，最適pH分別是5.5和6.0。因此，推測通過三相純化法獲得茶葉PPO具有兩個最適pH是有同工酶的存在。白毫早鮮葉PPO的最適pH為6.0[30]；福云6號茶PPO最適pH則相對偏堿，在pH8.6時具有一個酶活峰值[31]，這表明不同品種來源的茶葉PPO最適pH存在差異。當(dāng)pH<3.5和pH>7.5時，茶葉PPO酶活幾乎失活。

圖3 pH對茶葉多酚氧化酶活性的影響Fig.3 Effect of pH on the activity of PPO from tea

三相純化后的茶葉PPO分別置于pH3.0～9.0的緩沖液12 h后，殘余酶活性如圖4所示，pH<4.0時，茶葉PPO的相對酶活不足20%，隨著pH的升高相對酶活顯著升高（P<0.05），當(dāng)pH為5.5時表現(xiàn)出峰值，隨著pH的增加pH7.0又出現(xiàn)一個峰值，當(dāng)pH>7.5時，相對酶活顯著降低直至完全失活（P<0.05）。PPO為活性中心中含有Cu2+的氧化酶，當(dāng)體系中pH較低時Cu2+能夠被解離出來，喪失Cu2+的酶蛋白將失去催化活性，當(dāng)pH較高時Cu2+容易被氧化形成銅化物而降低酶活。因此，選擇合適的pH對PPO酶活性的保持具有重要意義[32?33]。

圖4 pH對茶葉多酚氧化酶穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of pH on stability of PPO from tea

2.5 化合物對茶葉多酚氧化酶活性的影響

化合物對PPO酶活性影響作用有兩個途徑，一是作用于活性中心的銅離子，二是作用于底物與酶結(jié)合的位點使其不能與酶蛋白結(jié)合，從而降低酶催化活力[34]。不同化合物對純化后茶葉PPO酶活性影響通過半抑制濃度（IC50（mmol/L））來表現(xiàn)，半抑制濃度越小則表明此化合物對其活性抑制越大。如表3所示，還原劑和螯合劑對茶葉PPO有不同程度的抑制作用，而鹵化物則沒有抑制作用。其中，抗壞血酸對茶葉PPO的抑制作用最顯著（IC50=2.42±0.18 mmol/L，P<0.05），其次是草酸和EDTA，檸檬酸抑制效果最弱。研究表明抗壞血酸對鳳慶茶葉PPO[29]（IC50=0.3 mmol/L）、土耳其茶葉PPO[19]（IC50=0.069 mmol/L）的抑制作用也很明顯，抗壞血酸能將鄰醌還原為鄰酚，從而阻斷氧化反應(yīng)的進一步進行，同時抗壞血酸還能與Cu2+螯合降低酶活性[35]。EDTA是一種常見的金屬螯合劑，能與大部分金屬離子發(fā)生反應(yīng)。從實驗結(jié)果分析，純化后茶葉PPO對EDTA不敏感，并且抑制相關(guān)性較低（R2=0.80），類似現(xiàn)象同樣存在于櫻桃PPO[36]、萵苣PPO[37]，可能原因是EDTA雖然是一種金屬螯合劑，但螯合銅離子的活性較低[38]。草酸和檸檬酸中的羧基也能與Cu2+絡(luò)合，同時還能降低反應(yīng)體系pH從而抑制酶活，本實驗草酸對茶PPO的抑制作用顯著高于檸檬酸（P<0.05），說明三相分離純化后的茶葉PPO對草酸更為敏感。

表3 不同化合物對茶葉多酚氧化酶活性的影響Table 3 Effect of different compound on tea PPO activity

3 結(jié)論

多酚氧化酶對茶樹生理代謝和產(chǎn)品加工品質(zhì)具有重要作用，科學(xué)地利用或抑制PPO酶活性對茶葉品質(zhì)的形成具有積極影響。本實驗研究表明，采用三相分離純化法獲得PPO酶液，純化效果較好，酶學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。純化后茶葉PPO比活力為210.46 U/mg，純化倍數(shù)達到15.67倍。茶葉PPO對鄰苯三酚親和力最高，以鄰苯二酚為底物時，PPO的最適溫度和最佳pH分別為45 ℃和5.5，同時在25 ℃和pH4.5～7.0范圍內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。在所檢測的抑制劑中，抗壞血酸對茶葉PPO的抑制效果最好。綜合認為在紅茶生產(chǎn)中的鮮葉萎凋、發(fā)酵或體外酶促轉(zhuǎn)化制備茶黃素時，均需控制好反應(yīng)條件以保持PPO的最佳酶活性，促進酶促氧化過程的高效進行。此外，三相分離純化法可用于茶葉PPO大規(guī)模的生產(chǎn)制備，為茶葉多酚氧化酶的分離純化和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供技術(shù)支撐。