程夢穎，張海萍，劉友明, ，熊善柏

（1.華中農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070；2.國家大宗淡水魚加工技術研發(fā)中心（武漢），湖北 武漢 430070）

魚糜制品是我國發(fā)展迅速的淡水魚加工產(chǎn)品之一，是一類營養(yǎng)豐富且食用方便的產(chǎn)品[1]。然而，淡水魚糜具有凝膠形成能力差，且在加工過程中易出現(xiàn)凝膠劣化等缺點[2]。目前，提高淡水魚糜凝膠特性的方法主要有物理處理法（超高壓誘導、超聲波輔助和微波加熱等）和外源添加法（蛋白、多糖和鹽類和酶制劑等），其中添加酶制劑因具有反應條件溫和、能耗低和針對性強的特點而受到關注[3]。目前在魚糜制品加工過程中添加的酶制劑主要是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（TG）[4]，它是通過促進蛋白質(zhì)之間發(fā)生交聯(lián)，從而提高魚糜的凝膠形成能力[5]。也有研究表明，在革胡子鯰魚糜中添加脂肪酶能提高其魚糜凝膠品質(zhì)[6]。

葡萄糖氧化酶（GOD）是一種安全的（GRAS）食品添加劑，目前在面制品中的應用較多，它可以催化葡萄糖和氧氣反應生成葡萄糖內(nèi)酯和過氧化氫，而過氧化氫將面筋蛋白中的巰基氧化成二硫鍵，從而形成較好的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)。研究表明，適量濃度的羥基自由基會提高肌原纖維蛋白（MP）的凝膠形成能力[7?8]。在魚糜中，過氧化氫被殘留的Fe2+還原成羥基自由基，從而會對魚糜蛋白進行氧化。有研究發(fā)現(xiàn)，添加適量GOD可以顯著改善海水魚糜的凝膠特性及其蛋白結(jié)構(gòu)[9?10]，但目前關于GOD在淡水魚糜中的應用鮮有報道。

由于海水魚資源匱乏，魚糜制品的加工原料逐漸轉(zhuǎn)為淡水魚，鰱魚是目前淡水魚魚糜的主要加工原料。本研究以冷凍鰱魚糜為原料，以不同GOD添加量模擬氧化環(huán)境，探討GOD對鰱魚糜凝膠特性的影響，并通過低場核磁、動態(tài)流變學分析GOD對鰱魚糜凝膠水分狀態(tài)以及凝膠形成過程的影響，同時結(jié)合掃描電鏡觀察凝膠微觀結(jié)構(gòu)，以期為GOD在淡水魚魚糜加工中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冷凍鰱魚糜（AAA級） 洪湖市井力水產(chǎn)食品股份有限公司；葡萄糖氧化酶（GOD）酶活為10000 U/g

上海源葉生物科技有限公司；NaCl、尿素等 均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

AUY220分析天平 日本島津公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；Mutiquick3食物調(diào)理機 博朗電器（德國）公司；722型分光光度計上海舜宇恒平精密科學儀器有限公司；FJ-200高速分散均質(zhì)機 上海標本模型廠；Ultrascan XE型色度儀 美國Hunter Surrey公司；TA-XTPlus質(zhì)構(gòu)儀英國Stable Micro Systems公司；AVANTI J-26高速冷凍離心機 美國貝克曼公司；NMI20核磁共振成像儀 上海紐邁電子科技有限公司；JSM-6390LV掃描電鏡 日本NTC公司；AR2000ex型動態(tài)流變儀

美國TA儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 魚糜凝膠的制備 將冷凍魚糜于4 ℃解凍后，參考方海硯等[11]的方法制作魚糜凝膠，調(diào)節(jié)魚糜水分含量至78%，在食品調(diào)理機中預斬2 min，加入2% NaCl和不同添加量GOD（0、0.1‰、0.3‰、0.5‰、0.7‰、0.9‰），添加量的選擇是以預實驗結(jié)果為參考，其中，添加量為0的設為對照組。繼續(xù)斬拌4 min，用真空包裝機排氣后灌入腸衣（直徑25 mm）封口，將魚腸40 ℃水浴1 h后再放入90 ℃水浴下30 min，經(jīng)流水冷卻30 min后置于4 ℃冰箱貯藏過夜。

1.2.2 動態(tài)流變學特性測定 參考XUE等[12]的方法稍作修改。采用直徑為40 mm的平板。參數(shù)設定：采用溫度掃描模式，間隙為1000 μm，頻率1 Hz，剪切應力1 Pa，升溫范圍20～90 ℃，升溫速率為2 ℃/min。記錄升溫過程中彈性模量（G′）、損耗模量（G″）的變化。

1.2.3 魚糜凝膠強度測定 魚腸從冰箱中取出后，在室溫下平衡30 min，切成高度20 mm的圓柱體，用TA-XTPlus質(zhì)構(gòu)分析儀進行破斷測試。探頭為P/0.25S，壓縮距離設置為15 mm，測前速度5 mm/s，測試速度l mm/s，測后速度5 mm/s，每個樣品至少做5個平行，穿刺曲線上的第1個峰值即破斷力[11]。凝膠強度為破斷力與凹陷深度之積。

1.2.4 白度測定 參考PARK[13]的方法。將魚糜凝膠切成厚度5 mm左右的圓片，采用色度儀測定樣品的L*、a*和b*值，測定前用標準白板對色差儀校正。白度（W）計算公式見（1）式：

1.2.5 魚糜凝膠pH的測定 參考關宏等[14]的方法并稍作修改，稱取2.00 g魚糜凝膠，加入10倍體積（w/v）的超純水，使用均質(zhì)機6000 r/min均質(zhì)1 min，在4 ℃低溫下4000 r/min離心10 min，取上清液，用pH計測定。

1.2.6 掃描電鏡觀察（SEM） 參考喬翠平等[15]的方法并略作修改，將制備的樣品切成2 mm×2 mm×1 mm的薄塊，用2.5%戊二醛固定2～7 h后，用乙醇進行梯度洗脫15 min，再用醋酸異戊酯洗脫20 min。將處理好的樣品經(jīng)臨界點干燥，噴金處理后，然后用掃描電鏡觀察微觀結(jié)構(gòu)，電子束的加速電壓為3 kV。

采用圖像分析軟件ImageJ 1.42q及其插件FracLac-2.5 Release 1d對掃描電鏡圖片進行處理。對掃描電鏡圖片進行分析前，按照DàVILA等[16]的方法對掃描電鏡圖片進行閾值化和二值化處理。分形維數(shù)和平均孔隙當量直徑參考朱玉安等[17]的方法進行計算。孔隙當量直徑可以直觀地反映魚糜凝膠的孔隙大?。环中尉S數(shù)反映了魚糜凝膠體系的空間復雜程度，分形維數(shù)越大說明體系越復雜，分形維數(shù)越小，說明體系的均勻性越好[18]。

1.2.7 持水性測定 采用離心法測定[19]，將樣品切成厚度約5 mm的薄片，稱質(zhì)量記為M0，在4000 r/min下離心10 min，離心結(jié)束后用濾紙吸去水分，再次稱重，記為M1。持水性按（2）式計算：

1.2.8 LF-NMR弛豫時間T2的測定 將樣品在室溫下恒溫30 min，切成高度20 mm的圓柱并轉(zhuǎn)入核磁管中，采用CPMG脈沖序列進行自旋-自旋弛豫時間T2、T2峰面積比的測定。參數(shù)設定：SFI=22 MHz，P90=14 μs，SW=100 kHz，τ=200 μs，NS=8，重復采樣等待時間為4500 ms。檢測結(jié)束所得CPMG指數(shù)衰減曲線采用Multi Exp InvAnalysis軟件進行反演，得到T2峰位置和T2峰面積比[20]。

1.2.9 SDS-PAGE分析 參考張一鳴等[21]的方法略作修改，取18 mL 95 ℃含有5%十二烷基硫酸（SDS，w/v）溶液添加到2 g切碎的魚糜凝膠中，均質(zhì)后于85 ℃水浴1 h，在8000 r/min下離心10 min，取上清液將蛋白濃度調(diào)整到2 mg/mL，取200 μL樣品加入40 μL含有（不含有）5%β-巰基乙醇蛋白的上樣緩沖液，混合均勻后于沸水浴加熱3 min，進樣體積為10 μL。用5%濃縮膠，10%分離膠。使用0.125%（w/v）考馬斯亮藍R-250進行染色，使用脫色液（50%甲醇+10%醋酸+40%蒸餾水）進行脫色。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗樣品做3次平行。采用Origin 2018進行繪圖，使用SPSS23進行相關性和顯著性分析，顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 GOD添加量對魚糜動態(tài)流變學性質(zhì)的影響

不同GOD添加量對升溫（20～90 ℃）過程中鰱魚糜彈性模量G′和損耗模量G″的影響如圖1所示，從圖中可以看出，整個凝膠過程主要分為3個階段：凝膠化、凝膠劣化和魚糕化。在20～43 ℃范圍內(nèi)，添加GOD組和對照組的G′均有小幅度升高，這可能是因為此時肌球蛋白輕鏈亞基S1發(fā)生解離，蛋白質(zhì)分子間發(fā)生交聯(lián)形成了較弱的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)；在43～50 ℃范圍內(nèi)，添加GOD組和對照組的G′和G″均迅速下降到最小值，可能是因為此階段內(nèi)源蛋白水解酶活性增加，肌原纖維蛋白開始降解，破壞了凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)；在50～90℃范圍內(nèi)，添加GOD組和對照組的G′和G″先上升后趨于平穩(wěn)，這是因為魚糜中肌球蛋白變性聚集，二硫鍵和疏水相互作用逐步形成，使魚糜形成不可逆的凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)[22?23]。溫度在35～43 ℃范圍內(nèi)，GOD添加量為0.1‰～0.7‰時，G′和G″都高于對照組；而在GOD添加量為0.9‰時，G′和G″都低于對照組。對照組在90 ℃的G′和G″分別為5578 Pa和344.6 Pa，而添加0.5‰ GOD的魚糜最終G′和G″達到8151 Pa和492.4 Pa，相比對照組來說，分別提高了46.12%和42.89%。通過G′和G″的變化可以發(fā)現(xiàn)，添加適量的GOD可誘導魚糜蛋白適度氧化，提高魚糜的G′和G″，但是添加過量的GOD則會導致蛋白質(zhì)氧化過度，魚糜的G′和G″降低。

圖1 GOD添加量對升溫過程中魚糜彈性模量G′（a）和損耗模量G″（b）的影響Fig.1 Effect of GOD addition on the elastic modulus G′ (a) and loss modulus G″ (b) of surimi during heating process

2.2 GOD添加量對鰱魚糜凝膠強度的影響

由圖2可以看出，隨著GOD添加量的增加，魚糜凝膠的破斷力、凹陷深度以及凝膠強度均呈先增加后降低的趨勢，當GOD添加量為0.5‰時，魚糜凝膠強度達到最高值771.814 g·cm，且與空白組間差異顯著（P<0.05）。這可能是由于添加GOD催化魚糜中的葡萄糖發(fā)生氧化反應生成過氧化氫，而過氧化氫被Fe2+還原成羥基自由基對魚糜蛋白進行氧化，添加適量的GOD使蛋白質(zhì)發(fā)生適當氧化，促進蛋白質(zhì)的展開，暴露出分子內(nèi)的巰基基團，被氧化形成了更多二硫鍵，從而提高蛋白質(zhì)凝膠強度[24]。但是添加過量的GOD則會產(chǎn)生較多的羥基自由基，導致蛋白質(zhì)過度氧化及嚴重變性，無法有序聚集，使魚糜凝膠形成能力降低，導致凝膠強度下降[25]。付璐璐等[26]在海水魚糜中也有類似的發(fā)現(xiàn)。

圖2 GOD添加量對魚糜凝膠破斷力、凹陷深度和凝膠強度的影響Fig.2 Effect of GOD addition on breaking force, deformation,and gel strength of surimi gel

2.3 GOD添加量對魚糜凝膠色度的影響

不同GOD添加量下魚糜凝膠的亮度（L*）、紅度值（a*）、黃度值（b*）及白度（W）如表1所示。隨著GOD添加量的增加，魚糜凝膠的亮度L*沒有顯著性變化（P>0.05）。在GOD添加量為0.1～0.3‰時，魚糜凝膠的白度W沒有顯著變化（P>0.05），在GOD添加量為0.5‰時，魚糜凝膠白度顯著高于對照組（P<0.05），這可能是因為此時形成凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)更致密，提高了魚糜凝膠的持水性，使魚糜凝膠具有更好的光澤度和透明度[27]。

表1 GOD添加量對魚糜凝膠色度的影響Table 1 Effect of GOD addition on color of surimi gel

2.4 GOD添加量對鰱魚糜凝膠pH的影響

GOD添加量對魚糜凝膠pH的影響如圖3所示，隨著GOD添加量的增加，魚糜凝膠的pH逐漸降低，但是都保持在6.8～7.0左右，與對照組相比，添加了GOD的pH都顯著小于對照組（P<0.05）?？赡苁且驗樘砑覩OD催化魚糜中的葡萄糖發(fā)生氧化反應，在生成過氧化氫的同時也生成了葡萄糖內(nèi)酯，葡萄糖內(nèi)酯易水解，生成葡萄糖酸，從而導致魚糜凝膠pH降低，OMURA等[9]也有類似的結(jié)論。有研究發(fā)現(xiàn)，pH由中性向酸性變化時，肌球蛋白中α-螺旋逐漸減少并轉(zhuǎn)換成其他二級結(jié)構(gòu)，導致其凝膠形成能力增強[28]。

圖3 GOD添加量對魚糜凝膠pH的影響Fig.3 Effect of GOD addition on pH of surimi gel

2.5 GOD添加量對魚糜凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響

圖4顯示了不同GOD添加量下魚糜凝膠微觀網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，由圖4可知，添加適量的GOD下的魚糜凝膠相比空白對照組具有更加緊密的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，尤其是添加0.5‰ GOD的魚糜凝膠最為明顯，而GOD添加量繼續(xù)增加時，魚糜凝膠的微觀結(jié)構(gòu)逐漸變得粗糙。為了定量分析微觀結(jié)構(gòu)的變化，對微觀結(jié)構(gòu)圖形計算其孔隙當量直徑和分形維數(shù)，結(jié)果見表2。由表可知，隨著GOD添加量的增加，孔隙當量直徑呈先下降后增加的趨勢，并在添加0.5‰ GOD時達到最小值，而分形維數(shù)則無顯著性差異（P>0.05），這可能是因為添加適量的GOD誘導氧化魚糜蛋白發(fā)生適當氧化，暴露出更多巰基基團和疏水基團，蛋白分子之間的疏水相互作用增加，氧化巰基形成更多的二硫鍵，促進良好的凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)的形成[29]；而隨著GOD添加量的進一步增加，蛋白質(zhì)過度氧化，蛋白質(zhì)分子內(nèi)部發(fā)生交聯(lián)和聚集，形成不可溶的聚集體[30]。WANF等[10]研究也發(fā)現(xiàn)適當添加量的GOD會使豬肉的肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)更加致密。

表2 不同GOD添加量的魚糜凝膠的孔隙當量直徑和分形維數(shù)Table 2 Pore size and fractal dimension of surimi gel with different GOD addition

圖4 不同GOD添加量的魚糜凝膠微觀結(jié)構(gòu)圖（×10 k）Fig.4 Scaning electron microscopy of silver crap surimi gel with different GOD addition （×10 k）

2.6 GOD添加量對魚糜持水性的影響

如圖5所示，GOD添加量對魚糜凝膠持水性有顯著影響（P<0.05），持水性隨著GOD添加量的增加呈先增加后降低的趨勢，與對照組相比，添加0.1‰～0.5‰的GOD下魚糜凝膠的持水性顯著提高（P<0.05），在GOD添加量為0.5‰時達到最大值81.35%，過量的GOD（0.9‰）會導致持水性顯著降低（P<0.05），這可能是因為添加適量的GOD會使魚糜蛋白適度氧化，從而形成致密的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，截留更多的自由水，導致魚糜凝膠持水性增加；而添加過量的GOD會使蛋白質(zhì)過度氧化，破壞魚糜凝膠內(nèi)部網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)一些較大的孔隙，自由水流出，從而使持水性下降，魚糜的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性也會降低。李學鵬等[31]也發(fā)現(xiàn)適度氧化能提高草魚肌原纖維蛋白凝膠的持水性。

圖5 GOD添加量對魚糜凝膠持水性的影響Fig.5 Effect of GOD addition on water-holding capacity of surimi gel

2.7 GOD添加量對魚糜凝膠水分狀態(tài)的影響

如圖6所示，在不同弛豫時間出現(xiàn)的峰代表凝膠體系中不同的水分及其含量，鰱魚糜凝膠中水分狀態(tài)分布呈3種狀態(tài)，分別是集中在0～1 ms的T21，表征凝膠體系中的與大分子結(jié)合的水，是結(jié)合水；集中在40～200 ms的T22，是表征魚糜凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)截留在網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)內(nèi)部的水，是不易流動水；集中在400～1200 ms的T23，是表征凝膠結(jié)構(gòu)外部的水，即能夠自由移動的水，是自由水。表3是不同GOD添加量的鰱魚糜凝膠水分子T2弛豫峰面積比例的變化，表示了魚糜凝膠體系中結(jié)合水、不易流動水和自由水的分布情況。由表3可知，隨著GOD添加量的增加（0.1‰～0.5‰），T22弛豫峰面積比例增加，相對應的T23弛豫峰面積比例降低，此時自由水轉(zhuǎn)換成不易流動水；當GOD添加量繼續(xù)增加（0.7‰～0.9‰）時，T22值降低，T23值提高，不易流動水逐漸轉(zhuǎn)換成流動水，這可能是由于添加適量的GOD誘導魚糜蛋白發(fā)生適當氧化，促進魚糜凝膠形成更加致密的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，將部分自由水緊緊鎖在凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)中[32]，提高凝膠持水性；而添加過量的GOD會使魚糜蛋白發(fā)生過度氧化，魚糜凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)遭到破壞，孔隙增大，使部分被截留在網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)中的水分流失，導致魚糜凝膠的持水性降低，與持水性的變化趨勢一致（見圖5）。

圖6 GOD添加量對魚糜凝膠T2弛豫時間的影響Fig.6 Effect of GOD addition on T2 relaxation time of surimi gel

表3 GOD添加量對魚糜凝膠水分子T2弛豫峰面積比例的影響Table 3 Effect of GOD addition on the T2 peak area fraction of water in surimi gel

2.8 GOD添加量對魚糜蛋白交聯(lián)的影響

不同GOD添加量的魚糜凝膠蛋白電泳結(jié)果如圖7所示。從圖7非還原型（A）圖譜可以看出，隨著GOD添加量的增加，肌球蛋白重鏈條帶逐漸加深，并且在分離膠頂端有聚合物的出現(xiàn)，表明GOD處理樣品會誘導魚糜蛋白氧化導致蛋白質(zhì)交聯(lián)和聚集，形成更多的二硫鍵，從而提高魚糜凝膠的凝膠特性，而肌動蛋白以及肌球蛋白輕鏈條帶沒有明顯變化。從圖7（B）可以看出，添加β-巰基乙醇后，肌球蛋白重鏈上方區(qū)域的條帶變淺，在濃縮膠和分離膠頂端仍有少部分聚集體的存在，這說明GOD誘導蛋白氧化形成凝膠的主要方式是二硫鍵，其他共價鍵也有一定的影響，這與LI等[33]的結(jié)果類似。添加GOD誘導魚糜蛋白氧化，會促進分子間二硫鍵和非二硫鍵相互交聯(lián)，這種分子間作用力對蛋白質(zhì)聚集和凝膠化起著重要作用[34]。研究進展[J]. 食品工業(yè)科技，2019，40（15）：349?355. ［MI H B,LI Z H, LI Y, et al. Research progress of the application of exogenous additives in surimi products[J]. Food Industry Science and Technology，2019，40（15）：349?355.］

圖7 不同GOD添加量下魚糜凝膠的SDS-PAGE電泳圖Fig.7 SDS-PAGE patterns of surimi gel formed by different GOD addition

［5］ AN Y Q, XIONG S B, LIU R, et al. The effect of cross-linking degrees on physicochemical properties of surimi gel as affected by MTGase[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture,2021.

3 結(jié)論

在鰱魚糜中添加0.1‰～0.5‰的GOD所制備出的魚糜凝膠比傳統(tǒng)魚糜凝膠具有更好的凝膠強度、白度和持水性，同時也會提高魚糜凝膠中不易流動水的含量，降低自由水的含量。通過觀察魚糜凝膠微觀結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，此時形成的魚糜凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)更加致密，孔隙當量直徑更小。SDS-PAGE圖譜結(jié)果顯示，隨著GOD添加量的增加，肌球蛋白重鏈條帶變強，這表明添加GOD可以促進蛋白質(zhì)交聯(lián)，形成更加穩(wěn)定的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)。綜合來看，在鰱魚糜中添加0.5‰的GOD可明顯改善鰱魚糜凝膠的凝膠特性，這為GOD在淡水魚魚糜中的應用提供理論依據(jù)。