賈銘鉉，楊雅蛟，孔維軍，賀 超，李先恩，周立東＊＊，李東輝＊＊

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 錦州 121001；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100193）

山藥（Chinese yam）是薯蕷科植物薯蕷的干燥根莖[1]，主要分布于我國東北、華北、華中等地區(qū)[2]。作為我國重要的藥食同源植物，山藥含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，不僅可以作為食物為人們提供能量，而且具有重要的藥用價(jià)值，傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為其可補(bǔ)脾養(yǎng)胃、補(bǔ)腎澀精[3-4]?，F(xiàn)代研究也表明，山藥中富含多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、尿嘧啶、腺苷、尿囊素等物質(zhì)[5-6]，具有降血糖、增強(qiáng)免疫力、抗氧化、抗炎和抗菌等功能[7-15]。

山藥對(duì)生長環(huán)境的要求不高，且適應(yīng)能力較強(qiáng)，一般喜歡生長在溫暖的環(huán)境中，但也可以適應(yīng)寒冷環(huán)境。山藥不耐旱澇，因此不宜生長在排水不暢的區(qū)域[16]。山藥的生長受多種因素的影響，例如氣候、產(chǎn)地、品種、栽培方式和肥料等[17-18]。作為一種高需肥作物，肥料的添加能夠顯著影響山藥的根莖大小和營養(yǎng)成分的含量，因此如何選擇肥料對(duì)山藥的生長及成分含量和質(zhì)量至關(guān)重要[19-20]。通?；实某煞州^單純，養(yǎng)分含量高，見效快，但也存在成分單一、營養(yǎng)不全面、肥效不持久等缺點(diǎn)。有機(jī)肥富含豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，而且可以增加土壤中的有機(jī)膠體，提高土壤保水、保肥和透氣性能，然而有機(jī)肥中養(yǎng)分含量低，不易分解，不能及時(shí)滿足作物高產(chǎn)的要求[21-22]。目前的研究多集中在化肥對(duì)山藥品質(zhì)的影響，例如盧寶安等人研究了不同施肥量和不同施肥時(shí)期次數(shù)對(duì)麻山藥產(chǎn)量的影響，結(jié)果表明合理的氮磷鉀肥配比可以增加山藥產(chǎn)量，而過量施加氮磷鉀肥會(huì)導(dǎo)致山藥產(chǎn)量下降而影響山藥品質(zhì)[23]。張?jiān)旅鹊热搜芯苛说租浄蕦?duì)山藥生長發(fā)育的影響，氮磷鉀肥施用量的提高可顯著促進(jìn)山藥地上部和地下部鮮、干生物量的累積[19]。近年來，化肥的用量呈大幅度增長趨勢，隨之而來的生態(tài)問題逐漸顯現(xiàn)，例如土壤酸性增加，土壤板結(jié)，理化性質(zhì)變差等，這對(duì)山藥的品質(zhì)產(chǎn)生不利影響[24]。有機(jī)肥可以提高土壤保水、保肥和透氣性能，這對(duì)山藥種植具有長期的益處[25]。劉美琳等人對(duì)山藥施加有機(jī)肥后，發(fā)現(xiàn)山藥的長勢和產(chǎn)量均得到提高[26]。呂亞慈研究了微生物菌肥對(duì)麻山藥產(chǎn)量和品質(zhì)的影響，結(jié)果表明微生物菌肥可以提高白嘴山藥的總糖、蛋白質(zhì)、灰分、淀粉的含量，降低其含水量，而且能使山藥增產(chǎn)[27]。化肥和有機(jī)肥均能改善山藥的產(chǎn)量和品質(zhì)，然而對(duì)比兩者對(duì)山藥生長影響的研究較少，為了探究不同肥料對(duì)山藥生長的影響，本研究考察并比較了施加化肥和有機(jī)肥后山藥的主要成分變化，以期為山藥的肥料的選擇提供可靠參考。

1 山藥施肥及樣品收集

分別對(duì)河北安國種植的小白嘴山藥在生長過程中施以化肥（尿素）和有機(jī)肥（史丹利復(fù)合肥），共3次。第1 次在植物地上生長旺盛期（6月下旬至7 月上旬），第2次在植物地上部分生長高峰前期（7月下旬至8 月上旬），第3次在秋季地上部分停止生長期（8月下旬至9月初）。收獲后，選取新鮮山藥塊莖，洗凈，去除每個(gè)山藥品種的龍頭，各取化肥和有機(jī)肥處理過的山藥，測定其塊莖中水分及主要成分的含量。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

UV-2550 型紫外-可見分光光度計(jì)（日本SHIMADZU）；Waters 2695 型高效液相色譜儀、PDA 996 檢測器（美國Waters 公司）；N-1100 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；UDK159 型全自動(dòng)凱氏定氮儀（意大利VELP 公司）；L-8900 型蛋白水解液氨基酸分析系統(tǒng)（日本日立公司）。

2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

D-無水葡萄糖（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；苯酚、甲基紅（阿拉?。溲趸c、檸檬酸鈉（北京化學(xué)工業(yè)集團(tuán)有限公司）；無水乙醇、鹽酸、石油醚、硫酸（北京市通廣精細(xì)化工公司）；硫酸銅（天津市化工三廠有限公司）；硫酸鉀、硼酸（麥克林）；乙腈（Thermo Fisher 公司）；尿嘧啶（純度99.6%）、腺苷（純度99.7%）和尿囊素（純度99.6%）（北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司）。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 山藥水分含量測定

收集不同肥料處理過的山藥樣品，清洗干凈并參照《GB 5009.3-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測定》方法測定收集的山藥樣品中水分的含量。

2.2.2 山藥多糖含量測定

按照實(shí)驗(yàn)室前期研究所建立的方法對(duì)山藥中多糖進(jìn)行含量測定[15]。

2.2.3 山藥樣品中蛋白質(zhì)和氨基酸含量測定

收集不同肥料處理過的山藥樣品，清洗干凈并參照《GB 5009.5-2016 食品中蛋白質(zhì)的測定》第一法，采用凱氏定氮法測定山藥中的蛋白質(zhì)含量。

收集不同肥料處理過的山藥樣品，清洗干凈并參照《GB 5009.124-2016 食品中氨基酸的測定》方法測定山藥中氨基酸的含量。

2.2.4 山藥樣品中小分子有效成分的含量測定

采用高效液相色譜二極管陣列檢測器聯(lián)用儀（high performance liquid chromatography-diode array detector，HPLC-DAD）測定樣品中尿囊素、尿嘧啶和腺苷的含量[15]。

3 結(jié)果與分析

3.1 化肥和有機(jī)肥對(duì)山藥單根重量的影響

如圖1 所示，施加化肥后山藥的平均單根重量約為550 g，而施加有機(jī)肥的山藥平均單根重量要小一些，約為510 g，表明化肥的噴施較有機(jī)肥更加促進(jìn)山藥的生長。

圖1 化肥和有機(jī)肥處理的山藥單根重量（g）（n=3）

3.2 化肥和有機(jī)肥對(duì)山藥中水分含量的影響

在本實(shí)驗(yàn)中，施加不同肥料的山藥中水分含量存在較大差異（圖2）。其中施加化肥的山藥中水分含量較高，為80.22%，而施加有機(jī)肥的山藥中水分含量為77.04%，表明噴施化肥更有利于保持山藥的含水量。

圖2 化肥和有機(jī)肥處理的山藥水分含量（n=3）

3.3 化肥和有機(jī)肥對(duì)山藥中多糖含量的影響

3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別以D-無水葡萄糖的濃度值（c）和吸光度值（A）為橫、縱坐標(biāo)，線性回歸得到A-c關(guān)系曲線（圖3）。結(jié)果表明，D-無水葡萄糖在0.005-0.05 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)與吸光度值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（n=3），線性方程為A=24.7234c+0.2400，R2=0.9998。

圖3 D-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（n=3）

3.3.2 精密度考察

精密稱取D-無水葡萄糖對(duì)照品25 mg，配成濃度為0.1 mg·mL-1的對(duì)照品溶液，然后在具塞試管中移入0.4 mL 對(duì)照品溶液，加入1.6 mL 純凈水。取一支試管并加入2 mL純凈水作為空白對(duì)照，在各個(gè)試管中分別加入5 mL 濃硫酸和1 mL 5%的苯酚溶液，迅速搖勻，靜置10 min 后將各個(gè)試管放置在40℃水浴中加熱15 min，之后用冰水浴冷卻至室溫，最后用UV-2550 型紫外-可見分光光度計(jì)在波長490 mm 處測定6次。測得的吸光度值分別為0.735、0.733、0.737、0.734、0.735、和0.731，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation,RSD）為0.28%（表1），表明儀器精密度良好。

表1 山藥多糖精密度考察

3.3.3 穩(wěn)定性考察

山藥樣品的供試液是按照前期研究基礎(chǔ)制備的[15]。精密量取1 mL 供試品溶液，加入1 mL 純凈水，然后向其中加入5 mL 濃硫酸和1 mL 5%的苯酚溶液，迅速搖勻，連續(xù)測定吸光度值6 次，每次間隔3 h。測得的吸光度值分別為0.643、0.645、0.647、0.639、0.644和0.641，RSD 值為0.44%（表2），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表2 山藥多糖穩(wěn)定性考察

3.3.4 重復(fù)性考察

分別從6 份山藥樣品中制備6 份供試品溶液，從每份供試品溶液中精密量取1 mL，加入1 mL 純凈水，然后向其中加入5 mL 濃硫酸和1 mL 5%的苯酚溶液，迅速搖勻，測定吸光度值。所測得的吸光度值分別為0.716、0.723、0.724、0.717、0.721 和0.726，平均值為0.721，RSD 為0.55%（表3），以上結(jié)果說明山藥樣品制備方法具有很好的重復(fù)性。

表3 山藥多糖重復(fù)性考察

3.3.5 山藥多糖含量測定

通過D-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算不同肥料處理后山藥中多糖的含量。由圖4 可以看出，化肥和有機(jī)肥對(duì)山藥多糖含量存在較大的影響。噴施化肥的山藥中多糖含量為20.46 mg·g-1，而施加有機(jī)肥的山藥中多糖含量為24.33 mg·g-1，表明，相比于化肥，有機(jī)肥的施加更能促進(jìn)山藥中多糖的積累。

圖4 化肥和有機(jī)肥處理的山藥多糖含量（n=3）

3.4 化肥和有機(jī)肥對(duì)山藥中蛋白質(zhì)和氨基酸含量的影響

按照上述方法分別測定化肥和有機(jī)肥處理后山藥中蛋白質(zhì)和氨基酸的含量（圖5）。施加有機(jī)肥的山藥中蛋白質(zhì)含量為12.1 g/100 g，總氨基酸為7.11 g/100 g，絲氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸、天門冬氨酸、蘇氨酸的含量分別為0.72、1.28、0.25、0.33、0.66、0.34、0.048、0.26、0.42、0.082、0.32、0.38、0.16、0.788、0.8、0.28 g/100 g；施加化肥的山藥中蛋白質(zhì)含量為14.2 g/100g，總氨基酸為7.26 g/100 g，絲氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸、天門冬氨酸、蘇氨酸的含量分別為0.74、1.31、0.25、0.34、0.68、0.34、0.048、0.26、0.44、0.086、0.33、0.39、0.16、0.8、0.8、0.29 g/100 g。結(jié)果表明，施加化肥對(duì)山藥中蛋白質(zhì)含量的增加較有機(jī)肥顯著，而在促進(jìn)氨基酸產(chǎn)量方面，兩者差異并不大。

圖5 有機(jī)肥和化肥對(duì)山藥中蛋白質(zhì)和氨基酸含量的影響（n=3）

3.5 化肥和有機(jī)肥對(duì)山藥中小分子成分含量的影響

3.5.1 色譜條件

色譜柱：XBridge?BEH Amide (4.6 mm × 250 mm,5 μm)柱；流動(dòng)相：乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫：0-5 min,90%-90% A; 5-6 min, 90%-95% A; 6-50 min, 95% A;流速：0.5 mL·min-1，檢測波長：212 nm，255 nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：5 μL（對(duì)照品），20 μL（供試品）。

3.5.2 混合對(duì)照品溶液的制備

精密稱取腺苷、尿囊素和尿嘧啶的對(duì)照品分別10 mg、30 mg和2 mg，用90%乙腈溶解并定容至10 mL容量瓶中，搖勻，即得含有0.9970 mg·mL-1腺苷、2.988 mg·mL-1尿囊素和0.1992 mg·mL-1尿嘧啶的混合對(duì)照品溶液。

3.5.3 供試品溶液的制備

取化肥和有機(jī)肥處理過的山藥樣品，分別精密稱取2 g山藥粉末，并加入100 mL石油醚，使用超聲波清洗器超聲處理1 h（450W），過濾。隨后將濾渣和濾紙轉(zhuǎn)移至具塞錐形瓶中，并加入甲醇100 mL，超聲處理1 h，隨后過濾得到濾液，重復(fù)以上操作3 次。將所得到的濾液壓縮至干，隨后將所得到的物質(zhì)轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，用90%乙腈溶解并定容，最后將所得到的的溶液用0.45 μm微孔濾膜過濾，備用。

3.5.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取0.1、0.5、0.8、1.5、2.0、4.0 mL混合對(duì)照品溶液至2 mL 容量瓶中，用色譜90% 乙腈稀釋至刻度，制成6 個(gè)不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。用0.45 μm 微孔濾膜過濾，按上述色譜條件進(jìn)樣分析。以峰面積（y）對(duì)濃度（x）進(jìn)行回歸計(jì)算，得回歸方程。其中尿囊素在149.40-5976.00 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為y=1.94×106x-1.53×105，R2=0.999；尿嘧啶在9.96-398.40 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為y= 8.77×106x- 7.26×104，R2= 0.999；腺苷在49.85-1994.00 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為y= 9.84×106x-2.75×105，R2=0.999。

3.5.5 精密度考察

取“3.5.2”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，向高效液相色譜儀中連續(xù)進(jìn)樣6 次，測得尿嘧啶、腺苷和尿囊素含量的RSD 值（n = 6）分別為0.90%、0.89%和0.97%，保留時(shí)間的RSD（n = 6）分別為0.38%、0.87%、0.83%（表4），表明儀器精密度良好。

表4 3種小分子有效成分的精密度考察

3.5.6 重復(fù)性考察

平行制備6 份供試品溶液（按“3.5.3”項(xiàng)的方法），并注入高效液相色譜儀中進(jìn)行檢測。測得山藥中尿嘧啶、腺苷和尿囊素含量的RSD 值（n = 6）分別為1.05%、0.88%和0.82%（表5），保留時(shí)間的RSD（n=6）分別為0.78%、0.55%和0.49%，表明方法重復(fù)性良好。

表5 3種小分子有效成分的重復(fù)性考察

3.5.7 穩(wěn)定性考察

為了考察供試品溶液的穩(wěn)定性，分別采集室溫下不同放置時(shí)間（0、4、8、12、16 和24 h）的同一供試品溶液，并注入高效液相色譜儀中進(jìn)行檢測，測得山藥中尿嘧啶、腺苷和尿囊素的RSD值（n=6）分別為0.88%、0.68%和0.56%，保留時(shí)間的RSD（n = 6）分別為0.41、0.61%和0.88%（表6），以上結(jié)果表明，在24 h 內(nèi)，所制備的供試品溶液具有良好的穩(wěn)定性。

表6 尿嘧啶、腺苷和尿囊素的穩(wěn)定性考察

3.5.8 加樣回收率考察

取已知3 種小分子成分含量的同一批山藥粉末9份，每份精密稱取2.0 g，每3 份為一組，分別精密加入一定量的各對(duì)照品溶液（按樣品溶液中相應(yīng)成分含量的80%、100%和120%加入），制備供試品溶液（按“3.5.3”項(xiàng)的方法），并注入高效液相色譜儀中進(jìn)行檢測，計(jì)算平均加樣回收率及RSD（表7）。尿嘧啶的平均加樣回收率為99.03%，RSD 為0.7%；腺苷的平均加樣回收率為99.42%，RSD為0.45%；尿囊素的平均加樣回收率為99.99%，RSD為0.13%，以上結(jié)果表明所建立的方法具有良好的準(zhǔn)確度。

表7 尿嘧啶、腺苷和尿囊素的加樣回收率實(shí)驗(yàn)(n = 9)

3.5.9 實(shí)際樣品檢測

將對(duì)照品和供試品溶液，按色譜條件進(jìn)樣，分別在212 nm 和255 nm 波長下對(duì)尿囊素、尿嘧啶和腺苷對(duì)照品和山藥樣品進(jìn)行檢測（圖6）。記錄不同樣品中各待測成分的色譜峰峰面積，代入回歸方程，即可計(jì)算各樣品中尿嘧啶、腺苷和尿囊素等3 個(gè)小分子化合物的含量。

圖6 山藥樣品與對(duì)照品的HPLC圖譜

結(jié)果表明，施加有機(jī)肥的山藥中尿嘧啶、腺苷和尿囊素的平均含量分別為0.0030、0.0062 和0.4902 mg·g-1，施加化肥的山藥中尿嘧啶、腺苷和尿囊素的平均含量分別為0.0122、0.0063 和0.5465 mg·g-1。施加化肥的山藥中尿嘧啶、腺苷和尿囊素含量均高于有機(jī)肥處理的山藥樣品，這可能與化肥中微量元素相比于有機(jī)肥含量較高有關(guān)。

4 討論

山藥作為一種“藥食兩用”食品和中藥，具有很高的營養(yǎng)功能和藥用價(jià)值。我國是山藥的原產(chǎn)地，山藥的栽培歷史悠久，品種眾多，分布廣泛。作為一種重要的食材，山藥每年的消耗量巨大，是重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)作物。多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、尿嘧啶、腺苷、尿囊素等是山藥的主要營養(yǎng)物質(zhì)，其含量高低直接影響了山藥的品質(zhì)。肥料的施加可以顯著影響山藥的品質(zhì)及產(chǎn)量，因此本研究比較了化肥和有機(jī)肥對(duì)山藥成分的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，施加化肥的山藥中水分和蛋白質(zhì)、尿嘧啶、腺苷和尿囊素的含量均都高于施加有機(jī)肥的山藥；而施加有機(jī)肥的山藥中多糖的含量高于施加化肥山藥的多糖含量。以上結(jié)果表明，化肥和有機(jī)肥對(duì)山藥成分會(huì)產(chǎn)生不同的影響，為了提升山藥的品質(zhì)，僅施加一種肥料是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，因此在未來山藥的栽培和種植中探索多種肥料的聯(lián)合施加，將會(huì)成為提升山藥品質(zhì)的一個(gè)重要的解決方案。