仁青東主，馮學(xué)梅，洛桑東智，華青措，英 措，劉軍莉，桑杰卓瑪，格日多杰，索南才旦多杰，三智加

（1.青海大學(xué)藏醫(yī)學(xué)院 西寧 810001；2.青海省藏醫(yī)院 西寧 8100071；3.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院 西寧 810001）

六味木香丸藏醫(yī)稱“日達(dá)州巴”，最早收載于《四部醫(yī)典》，由木香、豆蔻、余甘子、蓽茇、巴夏嘎、石榴子等六味藏藥材組成，主治“培根木布”病為主[1]。文獻(xiàn)研究表明[2]，木香為菊科植物木香的根，主治胃腸鼓脹、息肉等功效。豆蔻為姜科植物白豆蔻的果實(shí)，主治脾胃不和、脘腹脹滿等癥。余甘子為大戟科植物余甘子的果實(shí)，主治消化不良、腹脹等癥。蓽茇為胡椒科植物蓽茇果穗，主治脘腹冷痛、嘔吐等癥。塞北紫堇稱“巴夏嘎”，主治赤巴熱、刺痛、血熱病等。石榴子為石榴科植物石榴的種子，主治食欲不振，胃寒痛，消化不良等癥?，F(xiàn)代研究表明，續(xù)艷麗等[3]通過(guò)六味木香丸的有效成分分析，發(fā)現(xiàn)該方劑對(duì)胃潰瘍的炎癥具有抑制作用。魯建美等[4]發(fā)現(xiàn)，六味木香丸對(duì)胃部炎癥起到抗炎、鎮(zhèn)痛的作用。李海峰等[5]通過(guò)72 名腫瘤化療患者的臨床觀察，發(fā)現(xiàn)該方劑對(duì)化療藥物的不良反應(yīng)如惡心、嘔吐等具有緩解作用。徐僮等[6]對(duì)藏藥六味木香丸的有效成分進(jìn)行分析，其君藥木香所含木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯為主要成分，具有抗炎、腫瘤作用?？傊?，藏醫(yī)六味木香丸的總體功效圍繞胃病及寒熱混合證為主，其成分也表明對(duì)治療胃癌具有潛在的挖掘價(jià)值。

胃癌是我國(guó)發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤之一。其發(fā)生發(fā)展過(guò)程一般經(jīng)歷慢性淺表性胃炎，慢性萎縮性胃炎，腸上皮化生，異型增生等幾個(gè)階段后，最終演化成胃癌[7-8]，各個(gè)階段涉及不同的信號(hào)通路或者相同的信號(hào)通路。由于胃癌發(fā)生早起患者并不能發(fā)行明顯或者特殊癥狀，這種發(fā)病的潛伏性導(dǎo)致很多患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)處于胃癌中晚期，因此，必須通過(guò)手術(shù)、化療和急性靶向藥物來(lái)達(dá)到抑制的目的，但復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率仍然很高，且手術(shù)創(chuàng)傷性極大，化療和藥物引起的副作用也很大。已有研究表明，民族醫(yī)藥因獨(dú)特的復(fù)雜配方在預(yù)防和治療胃癌方面顯示出了獨(dú)特的療效，可以有效的避免上述幾種治療方式的缺點(diǎn)。

為了發(fā)現(xiàn)防止胃癌的藏藥良方，課題組利用中醫(yī)傳承輔助平臺(tái)軟件（V2.0）數(shù)據(jù)分析平臺(tái)，對(duì)慢性萎縮性胃炎及癌前病變的115 名患者所使用的690 首方劑進(jìn)行分析，得出六味木香丸治療萎縮性胃炎、胃潰瘍、胃癌前病變的療效顯著，其胃鏡、病理活檢、癥狀的有效率分別達(dá)86%、86.6%、97.1%[9-12]。通過(guò)用藥物頻次、關(guān)聯(lián)規(guī)則、核心組合、新方分析，得出六味木香丸是治療該類疾病的核心組方[14]?；谇捌诎悬c(diǎn)預(yù)測(cè)研究，發(fā)現(xiàn)該方劑主要通過(guò)ABL1、F2、ESR1、CYP2C9 等關(guān)鍵靶蛋白，調(diào)控androgenand estrogen metabolism、cytochrome P450、ErbB 等通路，參與細(xì)胞增殖、氧化反應(yīng)、內(nèi)分泌代謝、DNA 轉(zhuǎn)錄等過(guò)程，從多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同作用，可能遏制慢性萎縮性胃炎的進(jìn)一步惡化[13]。但六味木香丸如何有效防止胃癌的作用機(jī)制至今還不完全清楚?；谏鲜霰尘?，本研究聯(lián)合利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的方法，探索六味木香丸作用于胃癌的信號(hào)通路、代謝通路及潛在的疾病標(biāo)志物等作用機(jī)制，預(yù)測(cè)六味木香丸抗胃癌的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藏藥化學(xué)成分及作用靶點(diǎn)信息獲取及收集

六味木香丸組成藥物中的木香、余甘子、豆蔻、蓽茇、石榴子等五種藥材的化學(xué)成分及作用靶點(diǎn)信息獲取及收集從中藥系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺(tái)（TCMSP，http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php），篩選條件設(shè)置為口服生物利用度（OB）＞30%且類藥性（DL）＞0.18。巴夏嘎（塞北紫堇）的化學(xué)成分在TCMSP 平臺(tái)未能檢索到，所以從文獻(xiàn)查閱整理[14-18]，然后將成分在TCMSP 平臺(tái)進(jìn)行檢索，滿足OB 和DL 篩選條件的作為有效成分。此外，在TCMSP 平臺(tái)上檢索不到，但是文獻(xiàn)報(bào)道和腫瘤相關(guān)的成分也作為有效成分進(jìn)行后續(xù)分析。所有藥物的化學(xué)成分的靶點(diǎn)從首先從TCMSP 中查找，然后查閱文獻(xiàn)進(jìn)一步補(bǔ)全。

1.2 疾病胃癌靶點(diǎn)選取

運(yùn) 用 DrugBank、 GeneCards、 OMIM、 TTD、PharmGkb五大疾病數(shù)據(jù)庫(kù)，輸入與“胃癌”關(guān)鍵詞獲取胃癌疾病靶點(diǎn)，后經(jīng)合并去除重復(fù)項(xiàng)獲取得到胃癌疾病最終靶點(diǎn)。

1.3 胃癌疾病靶點(diǎn)與藥物靶點(diǎn)映射

使用R 語(yǔ)言中的“Venn”包構(gòu)建藥物活性成分相關(guān)的靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)的維恩圖（venn）獲得六味木香丸活性成分的潛在抗胃癌作用靶點(diǎn)。

1.4 藥物-共活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過(guò)上述整理獲得“藥物-成分”、“成分-疾病靶點(diǎn)”文件后，采用Cytoscape 軟件（Version 3.8.0）構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

1.5 關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白相關(guān)作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

首先預(yù)測(cè)上述獲得的關(guān)鍵蛋白之間的關(guān)系，在STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)（https://string-db.org/Version10.5）上完成預(yù)測(cè)。并將預(yù)測(cè)的結(jié)果以TSV 格式導(dǎo)出。采用Cytoscape軟件（Version3.8.0）構(gòu)建“蛋白-蛋白”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。并用插件CytoNCA獲得核心蛋白網(wǎng)絡(luò)。

1.6 通路注釋與富集分析

使用R 語(yǔ)言中的“colorspace”“stringi”“ggplot2”和Bioconductor 包“DOSE”“clusterProfiler”“enrichplot”“pathview”完成GO和KEGG富集分析。

1.7 關(guān)鍵化合物和核心蛋白分子對(duì)接

將潛在靶點(diǎn)蛋白名稱輸入PDB（http://www.rcsb.org/pdb/）數(shù)據(jù)庫(kù)中，找到相應(yīng)蛋白的PDBID，保存為pdb 格式，從TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)查找靶蛋白對(duì)應(yīng)的化合物成分，下載保存為mol2 格式，在PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取核心活性化合物2D 結(jié)構(gòu)的sdf 格式文件。使用Pymol 軟件對(duì)原PDB文件進(jìn)行去除水和原配體處理，Autodock Tolls 軟件為靶蛋白受體分子加極性氫，通過(guò)Autodock Vina 和Python腳本實(shí)現(xiàn)分子對(duì)接。分子對(duì)接過(guò)程中其結(jié)合能越低代表受體與配體的親和力越好，本研究選取結(jié)合能≤-5.0 kJ·mol-1的作為化合物與靶點(diǎn)有效結(jié)合的篩選依據(jù)。

1.8 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.8.1 準(zhǔn)備供試藥物

六味木香丸購(gòu)自青海省藏院,制劑批次號(hào)：20210904。200 g 六味木香丸在1 L 85%的乙醇中超聲提取3 次，將提取液進(jìn)行濃縮，得到約50 mL 濃縮液，按照藥物和培養(yǎng)液1:1 的比例配置六味木香丸提取供給母液，然后按照每100μL 培養(yǎng)液里面添加1.8、3.6、5.4、7.2 μL 六 味 木 香 丸 母 液，分 別 命 名 為L(zhǎng)WMXW1、LWMXW2、LWMXW3、LWMXW4，不添加藥物的為CK對(duì)照組。

1.8.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)過(guò)程

人胃細(xì)胞系SGC-7901（產(chǎn)品編號(hào)C6795）購(gòu)自碧云天。細(xì)胞在RPMI1640（批號(hào)C11875500BT，Gibco公司）基礎(chǔ)培養(yǎng)液并含10%胎牛血清（批號(hào)42F7180K，Gibco 公司）中貼壁培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為95% 空氣+5%CO2，溫度為37°C。當(dāng)細(xì)胞密度生長(zhǎng)到約85%左右時(shí)用重組胰酶細(xì)胞消化液（產(chǎn)品編號(hào)C0209）進(jìn)行消化，鋪96 孔板（8×103個(gè)/孔）的細(xì)胞用于檢測(cè)細(xì)胞增殖和活性氧積累，鋪100 mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿（8×105個(gè)/皿）的細(xì)胞用于分析蛋白表達(dá)。細(xì)胞處理分對(duì)照組（RPMI1640）和不同濃度六味木香丸組（）。細(xì)胞經(jīng)藥物處理24 h 和48 h 后，將96 孔板中的處理液洗掉，用PBS 清洗兩次后，每孔添加配置好的CCK-8 試劑（C0037）100 μL，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)30 min 后，用酶標(biāo)儀（SuPerMax 3000AL）測(cè)定各孔的450 nm 的吸光值，以空白對(duì)照組為參照，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)活力。100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中的細(xì)胞處理完后，先用PBS 清洗兩次后，用胰酶進(jìn)行消化，隨后按照RIPA 裂解液(強(qiáng))試劑盒（產(chǎn)品編號(hào)：P0013B）說(shuō)明書提取蛋白，用BCA 蛋白測(cè)定試劑盒（產(chǎn)品編號(hào)：P0012S）測(cè)定蛋白濃度，用15%的 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis（SDS-PAGE）凝膠分離20 μg/孔的蛋白，隨后轉(zhuǎn)到polyvinylidene fluoride（PVDF）膜上，用5%脫脂奶粉室溫下在脫色搖床上封閉1 h。然后加入兔抗STAT3 多克隆抗體（1:500，Order NO.:D320083），4℃下孵育過(guò)夜，用Tris Buffered saline Tween（TBST）在室溫下脫色搖床上洗5 次，每次5 min，隨后添加山羊抗小鼠IgG（1:5000）二抗，在室溫下孵育1 h，并用TBST 在室溫下脫色搖床上洗5 次，每次5 min。將極超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑（產(chǎn)品編號(hào)：P0018FS）滴加至PVDF膜上，在暗處進(jìn)行曝光、顯影和定影。

2 結(jié)果

2.1 活性化合物的收集

通過(guò)查閱文獻(xiàn)和TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)共獲得六味木香丸有效活性成分42 個(gè)，其中槲皮素（quercetin）和木犀草素（luteolin）在余甘子、石榴子和豆蔻中都含有，此外，(+)-兒茶素（(+)-Catechin）、β - 谷 甾 醇（β -sitosterol）、鞣 花 酸（ellagic acid）、山奈酚（kaempferol）在石榴子和余甘子中都存在。而且我們發(fā)現(xiàn)不同的化合物可以作用于同一個(gè)靶點(diǎn)，PTGS1 是化合物tetrahydrocoptisine、quercetin、Pisatin、Pinocembrin、luteolin、 kaempferol、 Jaranol、 Cavidine、 Benzo[a]carbazole、7-O-Methyleriodictyol、5- [(2R, 3R) -7-methoxy-3-methyl-5- [(E) -prop-1-enyl] -2, 3-dihydrobenzofuran-2-yl]-1,3-benzodioxole、1,2,5,6-tetrahydrotanshinone、(2R) -7-hydroxy-5-methoxy-2-phenylchroman-4-one、(+)-catechin、tetrahydrocoptisine

的共同靶點(diǎn)（表1）。

表1 六味木香丸潛在活性成分和對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)信息

續(xù)表

2.2 活性化合物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)

胃癌的8953 個(gè)靶點(diǎn)與六味木香丸的301 個(gè)靶點(diǎn)利用R 語(yǔ)言進(jìn)行匹配映射，并繪制維恩圖（venn）獲得271 個(gè)共同靶點(diǎn)，進(jìn)一步確定了六味木香丸與胃癌的靶向作用關(guān)系（圖1）。

圖1 六味木香丸活性成分靶點(diǎn)和胃癌疾病靶點(diǎn)維恩圖

2.3 藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析

將六味木香丸的42 活性成分與271 個(gè)潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 中，繪制藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖（圖2）。度值表示預(yù)測(cè)出該成分與作用靶點(diǎn)的關(guān)聯(lián)個(gè)數(shù)，成分度值越大說(shuō)明該成分越重要，此外發(fā)現(xiàn)一個(gè)成分存在于多個(gè)藥物中，一種成分可與多個(gè)靶點(diǎn)作用，多種成分又可共同作用于同一個(gè)靶點(diǎn)，體現(xiàn)了藏藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)和協(xié)調(diào)遞增效應(yīng)的綜合治療特色。

圖2 “藥物-化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

在STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)中導(dǎo)入271 個(gè)潛在靶點(diǎn)，得到PPI 網(wǎng)絡(luò)關(guān)系信息，發(fā)現(xiàn)243 個(gè)具有節(jié)點(diǎn)連接，刪除那些沒(méi)有節(jié)點(diǎn)連接的蛋白，保存網(wǎng)絡(luò)，并導(dǎo)入Cytoscape對(duì)蛋白網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化分析，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖（圖3）。其中degree＞24（中位數(shù)）的有MAPK1、MAPK3、JUN、STAT3、AKT1、TP53、RELA、MAPK8、FOS、MAPK14 等22 個(gè)靶點(diǎn)。借助Cytoscape 軟件的cytoNCA 插件對(duì)潛在治療靶點(diǎn)進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治霁@得核心富集模塊主要涉及MAPK3、MAPK1、AKT1、JUN、TP53等。

圖3 六味木香丸對(duì)抗胃癌靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（A：第一次篩選，B：第二次篩選）和關(guān)鍵基因相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（C）

2.5 富集分析

利用R 語(yǔ)言相關(guān)富集分析包對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行GO 富集分析和KEGG 通路分析，結(jié)果見(jiàn)圖4，GO 分析結(jié)果顯示六味木香丸的活性成分左右的相關(guān)蛋白基因主要富集到生物學(xué)過(guò)程中的氧化脅迫應(yīng)激、藥物反應(yīng)應(yīng)激和營(yíng)養(yǎng)水平應(yīng)激，分子功能DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活和絲氨酸/蘇氨酸激酶活性以及細(xì)胞組分中膜相關(guān)功能。KEGG生物學(xué)過(guò)程主要涉及：PI3K-Akt，MAPK，IL-17，TNF，HIF-1等信號(hào)通路（圖4）。

圖4 六味木香丸治療胃癌的KEGG功能柱狀圖

2.6 活性化合物與核心靶點(diǎn)蛋白受體的分子對(duì)接結(jié)果

首先查找獲得PPI網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建過(guò)程中篩選得到的4 個(gè)核心靶蛋白（MAPK3、MAPK1、JUN、STAT3）后，利用AutoDock Vina 軟件和Python 腳本進(jìn)行核心靶蛋白和對(duì)應(yīng)化合物的分子對(duì)接，根據(jù)活性化合物與靶點(diǎn)蛋白受體間的結(jié)合活性度越高，則兩者結(jié)合能月底的原則，本研究發(fā)現(xiàn)5 個(gè)活性化合物與4 個(gè)核心蛋白受體對(duì)接結(jié)果均低于-5.0 kJ·mol-1，其中Beta-sitosterol 與JUN 的結(jié)合能是-26.42 kJ·mol-1，是結(jié)合能最大的，其它結(jié)合能均低于30 kJ·mol-1，其中Quercetin 與JUN 的結(jié)合能32.58 kJ·mol-1，Luteolin 與MAPK1 結(jié)合能32.37 kJ·mol-1，(- ) -epigallocatechin-3-gallate 與MAPK3、MAPK1、JUN、STAT3 的結(jié)合能分別為35.80 kJ·mol-1、33.75 kJ·mol-1、32.94 kJ·mol-1、37.52 kJ·mol-1（表2）。這些結(jié)果說(shuō)明六味木香丸活性化合物和胃癌核心靶點(diǎn)之間具有很好的結(jié)合能力。具體的對(duì)接結(jié)果見(jiàn)圖5-圖6，從對(duì)接圖我們發(fā)現(xiàn)，Quercetin、Luteolin 和(-)-epigallocatechin-3-gallate 與MAPK1 靶蛋白的結(jié)合位點(diǎn)完全相同，其坐標(biāo)是center_x =-7.922，center_y = -13.532，center_z = 20.697。 Quercetin、Luteolin、Kaempferol、Beta-sitosterol 和(-)-epigallocatechin-3-gallate 與JUN 靶蛋白的結(jié)合位點(diǎn)完全相同，其坐標(biāo)是center_x =10.201，center_y = 0.493，center_z =19.492。(-)-epigallocatechin-3-gallate 與STAT3 靶 蛋 白的 結(jié) 合位 點(diǎn) 坐 標(biāo)是center_x = -43.83，center_y = -43.908，center_z =8.422。 (- ) -epigallocatechin-3-gallate 與STAT3 靶蛋白的結(jié)合位點(diǎn)坐標(biāo)是center_x = 15.01，center_y=-7.833，center_z=24.602（圖6）。

圖5 活性化合物與核心靶蛋白分子對(duì)接圖

圖6 (-)-epigallocatechin-3-gallate 與MAPK3(A)、MAPK1(B)、JUN(C)和STAT3(D)分子對(duì)接圖

表2 化合物與核心靶點(diǎn)結(jié)合能

2.7 六味木香丸對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和STAT3 蛋白表達(dá)的影響

本實(shí)驗(yàn)利用CCK-8 法檢測(cè)不同濃度的六味木香丸處理SGC-7901 胃癌細(xì)胞48 h 或72 h 后細(xì)胞增殖（圖7）。與空白對(duì)照組相比，六味木香丸能不同程度地抑制人胃癌SGC-7901 細(xì)胞的增殖，并呈時(shí)間和劑量依賴性，其中以1 μg·mL-1處理72 h 抑制最明顯（P＜0.001）。利用蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)一步檢測(cè)六味木香丸對(duì)STAT3 蛋白表達(dá)的影響（圖8），結(jié)果表明與對(duì)照相比，六味木香丸顯著的抑制了STAT3 蛋白的表達(dá)，表明STAT3通路可能參與六味木香丸抑制胃癌過(guò)程。

圖7 CCK-8法檢測(cè)六味木香丸不同濃度和作用時(shí)間對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖能力的影響

圖8 六味木香丸處理SGC-7901細(xì)胞48 h對(duì)STAT3蛋白表達(dá)水平的影響

3 討論

藏藥方劑具有所含成分多、靶點(diǎn)多、作用途徑多的特點(diǎn)，而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)融合了系統(tǒng)生物學(xué)和傳統(tǒng)醫(yī)藥用藥規(guī)律原創(chuàng)思路，從“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”間相互作用的整體性和系統(tǒng)性出發(fā)，可以全面系統(tǒng)地預(yù)測(cè)藏藥在治療疾病中發(fā)揮作用的主要成分和發(fā)揮作用的具體靶點(diǎn)，成為目前研究民族藥物作用機(jī)制的一利器[19]。分子對(duì)接通過(guò)對(duì)靶標(biāo)蛋白和小分子親和能力的計(jì)算，預(yù)測(cè)蛋白與配體親和能力和結(jié)合模式的強(qiáng)有力的工具[20]，可為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制提供理論依據(jù)。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的方法，篩選了藏藥六味木香丸治療胃癌的潛在活性成分和靶點(diǎn)，對(duì)六味木香丸的主要化學(xué)成分及其治療胃癌的作用機(jī)制進(jìn)行較全面系統(tǒng)地分析，為深入驗(yàn)證其作用機(jī)制提供依據(jù)，進(jìn)一步為新藥研發(fā)提供新的途徑和策略。

根據(jù)藏醫(yī)學(xué)“癥-證-病”診斷模式[21]，胃癌可分型為熱型和寒型兩種，是由“三胃火”功能嚴(yán)重失調(diào)導(dǎo)致，并且具有胃部形成堅(jiān)硬塊狀病變的表征。六味木香丸在臨床上作為治療胃癌的典型藥物之一，其組方中涼、熱性藥物兼并（如木香、巴夏嘎、余甘子為涼性藥物，石榴子、豆蔻、蓽茇為熱性藥物），故對(duì)各類胃癌的早期防止具有潛在作用價(jià)值。課題組的前期研究也發(fā)現(xiàn)，六味木香丸是治療胃病的核心組方，通過(guò)ABL1、F2、ESR1、CYP2C9 等 關(guān) 鍵 靶 蛋 白，調(diào) 控androgen and estrogen metabolism、cytochrome P450、ErbB 等通路，參與細(xì)胞增殖、氧化反應(yīng)等過(guò)程，從多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同作用，具有遏制慢性萎縮性胃炎發(fā)展為癌變的作用[13]。另外，現(xiàn)代研究表明，木香丸作為君藥，含有萜類、生物堿、蒽醌和黃酮等，其中萜類為其主要有效成分，具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)作用[6]；白豆蔻中萜醇類和倍半萜烯類成分含量最高，發(fā)現(xiàn)豆蔻的提取物可以有效的抑制胃癌的增殖[22]；余甘子以酚類化合物為主，所含的沒(méi)食子酸、槲皮素、鞣花酸的抗氧化性較強(qiáng)，對(duì)體液免疫的調(diào)節(jié)有積極影響。另外，余甘子還富含維生素C 和多酚類物質(zhì)，臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)它們有助于預(yù)防亞硝酸鹽攝入引發(fā)的癌[23]。蓽茇主要含胡椒堿、四氫胡椒堿等生物堿，還有天門冬氨酸、絲氨酸等多種氨基酸，具有抗胃潰瘍活性。巴夏嘎也稱鴨嘴花，含有鴨嘴花堿，在體外對(duì)人肺癌細(xì)胞等幾種癌細(xì)胞具有明顯的抑制作用，故通過(guò)細(xì)胞增殖通路發(fā)揮抗癌作用；石榴子含有甾類、鞣質(zhì)、磷脂、三酰甘油等化學(xué)成分，其中的石榴酸等可以抑制結(jié)腸癌等癌癥的發(fā)生[24]，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果為六味木香丸治療胃癌提供了重要的科學(xué)依據(jù)。

本研究最終預(yù)測(cè)得到六味木香丸對(duì)治療胃癌的42 個(gè)活性化合物中，槲皮素（quercetin）和木犀草素（luteolin）在余甘子、石榴子和豆蔻中都含有，(+)-兒茶素（(+)-Catechin）、β-谷甾醇（β-sitosterol）、鞣花酸（ellagic acid）、山奈酚（kaempferol）在石榴子和余甘子中都有。通過(guò)HPLC 法能夠檢測(cè)到六味木香丸中鞣花酸、胡椒堿、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯四種成分。胡椒堿僅僅存在于蓽撥中，而鞣花酸存在于石榴子和余甘子中。木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯是木香的代表性成分。通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)我們發(fā)現(xiàn)鞣花酸和胡椒堿的OB值分別為43.06%和42.52%，DL值分別為0.43和0.23；但木香烴內(nèi)酯的OB 和DL 值分別為29.07%和0.11，不滿足活性成分的篩選條件。去氫木香內(nèi)酯在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中未檢索到。已經(jīng)有多個(gè)研究報(bào)道木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯能夠通過(guò)不同的靶點(diǎn)抑制多種癌細(xì)胞的增值，這些結(jié)果說(shuō)明雖然有些活性成分不能滿足口服度等理論篩選指標(biāo)，但其能表現(xiàn)出很強(qiáng)的特定藥理活性，進(jìn)一步指示我們今后在收集活性成分中應(yīng)該從理論篩選和實(shí)際實(shí)驗(yàn)報(bào)道綜合考慮。此外，我們也發(fā)現(xiàn)同一個(gè)靶點(diǎn)可以被多個(gè)化合物作用，比如，PTGS1 是化合物tetrahydrocoptisine 、quercetin、Pisatin、Pinocembrin、luteolin、kaempferol、Jaranol、Cavidine、Benzo[a]carbazole、7-O-Methyleriodictyol等化合物的共同靶點(diǎn)。這充分體現(xiàn)了藏醫(yī)在復(fù)方配伍中的獨(dú)特之處。靶點(diǎn)MAPK、JUN、STAT3 在網(wǎng)絡(luò)中處于核心位置，是六味木香丸對(duì)治療胃癌的重要潛在靶點(diǎn)。其中MAPK 是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)傳遞者，可通過(guò)磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子、相關(guān)酶類等參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、炎癥反應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)及免疫防御等多種生物過(guò)程；與正?；颊呦啾?，腫瘤患者M(jìn)APK 家族蛋白表達(dá)明顯發(fā)生改變，表明MAPK 確實(shí)參與了腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。作為第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的致癌轉(zhuǎn)錄因子，JUN 蛋白是由原癌基因（c-JUN）編碼產(chǎn)生的蛋白，與病毒癌蛋白v-jun 同源。c-JUN 對(duì)紫外線誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有保護(hù)作用，并與NF-κB 協(xié)同作用抑制了TNF-α 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）是STAT 家族中的其中一個(gè)成員，也是JAK-STAT信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄因子。研究表明，當(dāng)外界因子作用于STAT3時(shí)，STAT3 會(huì)被磷酸化，磷酸化的STAT3 是STAT3 的活化形式，會(huì)進(jìn)入到細(xì)胞核中，進(jìn)一步調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。上它的靶蛋白包括基質(zhì)金屬蛋白酶類2 等。STAT3 在胃癌組織中的表達(dá)比正常組織明顯升高，有研究證明STAT3 在胃癌的發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程中起著顯著的正性調(diào)節(jié)作用。通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，六味木香丸顯著的抑制了胃癌細(xì)胞的增殖和STAT3 蛋白的表達(dá)，這些結(jié)果進(jìn)一步支持了STAT3 在胃癌中的正調(diào)節(jié)作用，同時(shí)也暗示STAT3 途徑可能是六味木香丸抑制胃癌細(xì)胞增殖過(guò)程中的重要靶標(biāo)蛋白之一，這也體現(xiàn)了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)到結(jié)果的可靠性。綜上所述，六味木香丸可能通過(guò)胃癌中這些關(guān)鍵蛋白進(jìn)一步影響胃癌的發(fā)生和發(fā)展。

綜上所述，胃癌的形成與發(fā)展是一個(gè)由多基因調(diào)控、多因素參與、多信號(hào)通路交叉作用的復(fù)雜過(guò)程，其治療至今仍然是一個(gè)世界性難題。藏藥復(fù)方以其“多成分、多靶點(diǎn)、多途徑”的特點(diǎn)在胃癌防治方面展現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，分析六味木香丸治療胃癌的有效活性成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)，為下一步從藥理學(xué)角度闡明六味木香丸抗胃癌的具體作用機(jī)制提供了目標(biāo)和思路。