樓倩穎，曹 程，王青青，魏翀琦，佘雨巖，孟雪兒，鄭嘉妮，陸韞青，朱梓強，朱 悅

（南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院/江蘇省方劑研究重點實驗室/江蘇省方劑高技術(shù)研究重點實驗室/中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心/江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心 南京 210029）

1 引言

阿爾茨海默癥（Alzheimer disease，AD），是老年人群高發(fā)疾病，又稱老年癡呆癥，臨床早期最顯著的癥狀為以記憶力受損的記憶障礙、掌握運用新知識與社交能力下降等認(rèn)知障礙、并伴隨有抑郁、情感淡漠或焦躁不安、注意力渙散等精神障礙。AD 發(fā)病機制極為復(fù)雜，現(xiàn)今獲FDA 批準(zhǔn)上市的AD 藥物主要為膽堿酯酶抑制劑與NMDA 受體阻斷劑，靶點單一且副作用大。而近20 年來，全球已有146 個AD 藥物在研發(fā)中遭遇失敗，成功率僅僅2.7%，新藥研發(fā)遭遇瓶頸。而中藥以其多成分、多途徑、多靶點的優(yōu)勢，可為AD 藥物研發(fā)提供全新治療思路和研究價值[1-2]。

中醫(yī)與神志有關(guān)的疾病多從“心”論治。AD 病位在腦，也與五臟之首的心密切相關(guān)。老年人日漸年老體衰，心氣渙散，心陰不濟，神無所依，是中醫(yī)認(rèn)為AD的重要病機。“同病異治”與“同病異治”是中醫(yī)辨證論治的精髓與特色?！巴‘愔巍敝讣词故峭徊“Y，也會因人、因時、因地等實際情況采取不同的治療措施。而開心散與生脈散均為中醫(yī)臨床辨證論治AD 的高頻使用方劑[3]。開心散始載于唐代孫思邈《備急千金要方》，由人參、遠志、石菖蒲、茯苓組成，功能補益心氣、祛痰開竅[4]。生脈散源于張元素《醫(yī)學(xué)啟源》，由人參、麥冬、五味子組成，功能滋養(yǎng)心陰、益氣生津。臨床常用來治療心血管疾病，近年來生脈散在防治神經(jīng)精神系統(tǒng)疾病方面的研究也不斷增多[5]。從方劑組成與功效不難發(fā)現(xiàn)，開心散偏補心氣而生脈散偏補心陰，開心散攻補兼施而生脈散偏于滋補濡潤[6]，充分體現(xiàn)了“同病異治”的特點，但是其現(xiàn)代科學(xué)內(nèi)涵尚未得到闡釋。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)將中藥有效成分和靶點進行網(wǎng)絡(luò)化聯(lián)結(jié)與分析，預(yù)測藥物治療疾病潛在靶點及通路從而認(rèn)識藥物作用機制，為闡釋中藥復(fù)方“同病異治”的科學(xué)內(nèi)涵提供了有效途徑。

因此，我們參考《網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)評價方法指南》中網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)評價的主要策略[7]，擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步闡釋兩張方劑“同病異治”的現(xiàn)代科學(xué)內(nèi)涵。同時結(jié)合整體動物與離體細胞實驗對所揭示的生物學(xué)機制進行驗證，為中藥復(fù)方抗AD“同病異治”的作用機制提供更多的現(xiàn)代科學(xué)依據(jù)，為臨床應(yīng)用與相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)提供更多的科學(xué)支持[8]。

2 研究思路與方法

通過構(gòu)建開心散與生脈散復(fù)方成分潛在靶點網(wǎng)絡(luò)圖，尋找其抗AD 共性及優(yōu)勢調(diào)控靶點與通路，分析靶點與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的異同。同時，通過構(gòu)建Aβ 海馬區(qū)注射誘導(dǎo)小鼠癡呆模型和LPS 誘導(dǎo)Bv2小膠質(zhì)細胞炎性激活模型，從整體動物與離體細胞兩個方面驗證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果，闡釋開心散與生脈散調(diào)控中樞神經(jīng)炎癥抗AD“同病異治”的效用機制與內(nèi)涵，如流程圖所示（圖1）。

圖1 研究流程圖

3 研究與分析

3.1 實驗藥材

五加科植物人參（Panax ginsengC.A.Mey.）干燥根和根莖、遠志科植物遠志（PolygalatenuifoliaWild.）干燥根、天南星科植物石菖蒲（Acorus tatarinowiiSchott）干燥根莖、多孔菌科真菌茯苓（Poriacocos（Schw.）Wolf）的 干 燥 菌 核、百 合 科 植 物 麥 冬（Ophiopogon japonicus（L.f）Ker Gael）干燥塊根、木蘭科植物五味子(Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.）干燥成熟果實。上述藥材飲片均購自蘇州天靈中藥飲片公司，經(jīng)我校嚴(yán)輝副教授鑒定。

3.2 實驗細胞及試劑

小鼠小膠質(zhì)BV2 細胞購自ATCC。MEM EAGLE培養(yǎng)基、青霉素/鏈霉素/支原酶抑制劑（P/S/N）等培養(yǎng)試劑購自以色列Biological Industries公司，細胞培養(yǎng)相關(guān)耗材購自美國Corning 公司。Aβ1-42（20JW09891）購自上海諾優(yōu)生物科技有限公司。石杉堿甲（H107336）購自北京伊諾凱科技有限公司。TRIzol RNA（15596-026）購自美國Thermo Fisher 公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（AE311）和SYBR熒光定量qPCR檢測試劑盒（AQ132）購自北京全式金生物科技有限公司。小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA 試劑盒（JEB-12474）、小鼠白介素6（IL-6）ELISA 試劑盒（JEB-12267）、小鼠白介素1β（IL-1β）ELISA 試劑盒（JEB-12787）購自南京金益柏生物科技有限公司。

3.3 實驗動物

ICR 小鼠，雄性，六月齡，體質(zhì)量22-25 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司。小鼠飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF 級屏障設(shè)施中，常規(guī)飼養(yǎng)（12 h光照，溫度22-25℃，濕度40%-70%）。本實驗已獲得NJUCM 動物實驗倫理委員會的批準(zhǔn)，許可證號：CSXK（滬）2017-0005。

3.4 實驗儀器

小鼠腦立體定位儀。Morris 水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)、Y 迷宮測試動物行為分析系統(tǒng)（Any -maze，USA）。實時定量PCR 儀（ABI 7500，USA）。超微量紫外分光光度計（DENOVIX DS-11，USA）。

3.5 實驗方法

3.5.1 化學(xué)成分的收集及篩選

通 過 TCMSP （https://tcmspw.com/） 、TCM database@Taiwan（http://tcm.cmu.edu.tw/）、TCMID（http://5th.tcmspw.com/tcmsp.php）、Chemistry Database（https://www.organchem.csdb.cn）等數(shù)據(jù)庫，結(jié)合文獻收集復(fù)方中單味中藥主要化學(xué)成分及相應(yīng)CAS 號，通過化學(xué)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫Pubchem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載SDF 結(jié)構(gòu)，上傳到SwissADME（http://www.swissadme.ch/）數(shù)據(jù)庫中篩選出滿足以下條件的活性成分：①胃腸道吸收GI 值high，藥物相似性五個指標(biāo)中滿足兩個及以上YES[9]；②在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中“相關(guān)疾病”涉及“AD”。③文獻挖掘與AD 相關(guān)的中藥活性成分[10]。

3.5.2 活性成分潛在靶點預(yù)測

上傳活性成分SDF 結(jié)構(gòu)至小分子靶點預(yù)測數(shù)據(jù)庫SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）[11]，限定物種為人源（Homo sapiens），選擇高可信度的蛋白作為靶點（Probability*＞0.65，不滿足該條件，則選取排名前15 的靶點）。去重后通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）矯正得到靶點標(biāo)準(zhǔn)蛋白名稱和基因名稱，最終得到方劑潛在靶點信息[12]。

3.5.3 復(fù)方-中藥-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

歸納分組預(yù)測所得靶點信息，通過Cytoscape 3.6.0 軟件（http://www.cytoscape.org/），去除游離靶點，并通過Cytoscape3.2.0 進行拓撲學(xué)分析，計算所有節(jié)點Degree 中位值，篩選各類度值高于二倍中位值的節(jié)點，構(gòu)建復(fù)方-中藥-成分-靶點關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)。其中節(jié)點（node）代表復(fù)方、中藥、成分、靶點，邊（edge）表示中藥-成分-疾病-靶點之間的相互聯(lián)系，節(jié)點大小和顏色深淺反映度值大小[13]。

3.5.4 抗阿爾茨海默癥靶點的篩選

通 過TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）、Gencards（http://www.genecards.org/）、Drugbank（https://www.drugbank.ca/）等數(shù)據(jù)庫搜索獲取AD 相關(guān)疾病靶點，與開心散、生脈散復(fù)方篩選得到的靶點進行對比分析，歸納總結(jié)兩個復(fù)方中抗AD 潛在共性及優(yōu)勢調(diào)控靶點，利用VENNY 2.1（https://bioinfogp.cnb.csic.es）在線繪制韋恩圖。

3.5.5 抗阿爾茨海默癥靶點互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建以及拓撲分析

通過STRING（https://string-db.org/）數(shù)據(jù)庫對上述靶點進行蛋白互作（PPI）分析[14]，限定物種為人源，選取交互分?jǐn)?shù)高于0.9 的蛋白質(zhì)互作關(guān)系數(shù)據(jù)，并通過Cytoscape3.2.0 進行拓撲學(xué)分析，計算所有節(jié)點Degree中位值，篩選節(jié)點度高于中位值的靶點，構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)。

3.5.6 KEGG通路富集分析和GO功能富集分析

利用Metascape（https://metascape.org/）對兩個復(fù)方抗AD 潛在共性及優(yōu)勢調(diào)控靶點進行KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路分析和GO（Gene ontology）功能富集分析，限定物種為人源，Pathway 選 擇 KEGG pathway、GO-BP（Biological Processes）進行富集分析[15-16]。

3.5.7 藥物制備

開心散提取物（KXS）的制備：按比例稱取人參、遠志、石菖蒲、茯苓藥材（3:2:2:3）共100 g，先后加8倍、六倍量的純水浸泡1 h，回流提取2 h，過濾，合并兩次濾液，減壓濃縮至約1 mL藥液中含有1 g生藥的浸膏[17]。

生脈散提取物（SMS）的制備：按比例稱取人參、麥冬、五味子藥材（五分：五分：七粒）共100 g，先后加入10 倍、6 倍、四倍量體積的純水，浸泡1 h，回流提取1 h，過濾，最后合并三次過濾液，減壓濃縮同上[18]。

3.5.8 細胞培養(yǎng)

小鼠BV2 小膠質(zhì)細胞用含有1% PSN、1%丙酮酸鈉、10%胎牛血清的MEM EAGLE 培養(yǎng)基，每48 h換液1 次。待細胞密度為70%即可傳代，培養(yǎng)三代穩(wěn)定后的細胞用于后續(xù)細胞實驗。

3.5.9 qPCR檢測炎癥因子表達水平

取BV2 細胞樣品，TransZol Up 提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA樣品，依照SYBR熒光實時定量試劑盒所列步驟，利用實時熒光定量PCR 儀測定各組炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α 基因轉(zhuǎn)錄水平表達，以GAPDH 為內(nèi)參，計算各組相對于空白組的基因表達百分值。實驗中所用引物序列見表1。

表1 引物序列

3.5.10 Aβ海馬注射擬AD小鼠模型建立及給藥

將Aβ1-42溶于滅菌PBS 中，配置成1μg/μL 溶液，37℃恒溫孵育一周。選取健康雄性SPF 級ICR 小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后隨機分組共8 組，每組8 只，分別是空白組、假手術(shù)組、模型組、KXS-L 組、KXS-H 組、SMS-L 組、SMS-H 組、石杉堿甲組。除空白組、假手術(shù)組外，小鼠異氟烷吸入麻醉，進行右側(cè)側(cè)腦室定位注射Aβ1-42（A：-2 mm；L：2 mm；H：-3 mm），以1 μL/1 min速度每只注射5 μL Aβ1-42，留針30s后緩慢撤針。假手術(shù)組以同樣方式注射等量生理鹽水。手術(shù)后小鼠常規(guī)飼養(yǎng)2 周給藥，空白組、假手術(shù)組、模型組小鼠每日灌胃生理鹽水（0.9% NaCl），陽性藥組給予石杉堿甲（0.05 mg/kg/天），KXS-L 組給予開心散提取物（3 g/kg/天），KXS-H組給予開心散提取物（10 g/kg/天），SMS-L組給予生脈散提取物（3 g/kg/天），SMS-H 組給予生脈散提取物（10 g/kg/天）。

3.5.11 行為學(xué)檢測

給藥7 d 后進行Morris 水迷宮實驗（Morris water maze，MWM），以評價小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，水迷宮具體方法參照課題組已發(fā)表的研究文章進行[19]。MWM 結(jié)束后24 h后開始Y 迷宮實驗（Y maze），Y 迷宮由三個相鄰夾角為120°的相同臂（1：新臂，2：起始臂，3：其他臂）組成，各臂靠近中央處可裝置隔板。第一階段，隔開新臂，小鼠從起始臂進入，自由探索起始臂和其他臂，時間設(shè)置為5 min。1 h后測試階段，移走隔板，從同一位置進入自由探索三個臂，時間設(shè)置為3 min。記錄小鼠進入新臂的次數(shù)和停留時間。

3.5.12 ELISA檢測

行為學(xué)測試結(jié)束后，解剖獲得小鼠海馬組織，液氮速凍，用PBS制備勻漿。利用ELISA試劑盒，按照所列步驟，檢測海馬組織中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNFα的水平。

3.5.13 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS19.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用單因素方差分析法（One-way ANOVA）分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，P＜0.05 表示有顯著差異，以P＜0.01 表示有極顯著差異。

3.6 結(jié)果

3.6.1 活性成分及潛在靶點的篩選與分析

通過TCMSP 等數(shù)據(jù)庫收載的藥材成分，并結(jié)合文獻進行成分復(fù)核，篩選獲得化學(xué)成分并獲得下列潛在靶點：開心散活性成分234 個，預(yù)測靶點614 個（去重）；生脈散活性成分215 個，預(yù)測靶點603 個（去重），兩方共有成分有109 個，共有靶點490 個。其中，屬于人參的活性成分有98 個，靶點425 個；非人參共有成分11 個，非人參共有靶點65 個。開心散優(yōu)勢活性成分136 個，優(yōu)勢靶點124 個；生脈散優(yōu)勢活性成分117個，優(yōu)勢靶點113 個（表2），繪制韋恩圖（圖2）。通過Cytoscape 3.6.0 拓撲學(xué)分析,篩選各類節(jié)點度值高于二倍中位值的關(guān)鍵節(jié)點，構(gòu)建出的復(fù)方-中藥-成分-靶點關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)中包含256 個節(jié)點，2399 條相互作用關(guān)系（圖3）[20-21]。

圖2 開心散與生脈散活性成分靶點交集韋恩圖

圖3 復(fù)方-中藥-成分-靶點關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)

3.6.2 抗阿爾茨海默癥靶點的篩選分析

通過TTD、Gencards、Drugbank 等數(shù)據(jù)庫搜索獲取AD 的相關(guān)疾病靶點，與開心散、生脈散復(fù)方篩選得到的靶點進行對比分析獲得，開心散抗AD 潛在靶點467個，生脈散抗AD 潛在靶點465 個。兩方抗AD 潛在共性調(diào)控靶點375 個，開心散抗AD 潛在優(yōu)勢調(diào)控靶點92 個，生脈散抗AD 潛在優(yōu)勢調(diào)控靶點90 個，繪制韋恩圖（圖4）[22]。

圖4 開心散與生脈散抗AD靶點交集韋恩圖

3.6.3 抗阿爾茨海默癥靶點PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

通過STRING 數(shù)據(jù)庫對上述滿足交互分?jǐn)?shù)高于0.9 的靶點進行PPI 分析。按條件篩選關(guān)鍵節(jié)點進行作網(wǎng)絡(luò)圖。得到結(jié)果如下：

開心散與生脈散復(fù)方抗AD 潛在共性調(diào)控靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，包含305 個節(jié)點、1762 條相互作用關(guān)系，度值＞26（中位值）的關(guān)鍵節(jié)點有41 個（圖5、表3）。其中，度值最高的APP 能與64 個靶點發(fā)生相互作用（圖5A）[23]。

圖5 開心散與生脈散抗AD潛在共性及優(yōu)勢調(diào)控靶點的相互作用網(wǎng)絡(luò)

表3 開心散與生脈散抗AD潛在共性調(diào)控靶點（排列前10）

開心散抗AD潛在優(yōu)勢調(diào)控靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖，包含56 個節(jié)點、91 條相互作用關(guān)系，度值＞3（中位值）的關(guān)鍵節(jié)點有19 個（圖5、表4）。其中度值最高的PIK3R1能與15 個靶點發(fā)生相互作用（圖5B）。

表4 開心散抗AD潛在優(yōu)勢調(diào)控靶點（排列前10）

生脈散抗AD潛在優(yōu)勢調(diào)控靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖，包含50 個節(jié)點、62 條相互作用關(guān)系，度值＞2（中位值）的關(guān)鍵節(jié)點有24 個（表5）。其中，度值最高的SRC 能與7個靶點發(fā)生相互作用（圖5C）。

表5 生脈散抗AD潛在優(yōu)勢調(diào)控靶點（排列前10）

3.6.4 復(fù)方抗AD 潛在共性調(diào)控靶點KEGG 通路富集分析與GO功能富集分析

利用Matescape 數(shù)據(jù)庫對兩方抗AD 潛在共性調(diào)控靶點進行KEGG 通路富集分析和GO 功能富集分析，根據(jù)FDR 值，各篩選出排名前20 的信號通路。兩方抗AD 潛在共性調(diào)控靶點的KEGG 通路見圖6A。GO 富集分析顯示，生物進程（BP）涉及條目主要包含突觸信號傳導(dǎo)、神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)控等（圖6B）。

圖6 開心散與生脈散抗AD潛在共性調(diào)控靶點富集分析

3.6.5 復(fù)方抗AD 潛在優(yōu)勢調(diào)控靶點KEGG 通路富集分析和GO功能富集分析

利用Matescape 數(shù)據(jù)庫對開心散與生脈散抗AD潛在優(yōu)勢調(diào)控靶點進行KEGG 富集分析和GO 功能富集分析。開心散抗AD 潛在優(yōu)勢調(diào)控靶點KEGG 通路主要涉及神經(jīng)活性配體-受體相互作用、NF-κB 信號通路等（圖7A）。GO 富集分析顯示，生物進程（BP）涉及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞鈣離子穩(wěn)態(tài)等（圖7B）。

圖7 開心散抗AD潛在優(yōu)勢調(diào)控靶點富集分析

生脈散抗AD 潛在優(yōu)勢調(diào)控靶點KEGG 通路主要涉及鈣信號通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用等（圖8A）。GO富集分析顯示，生物進程（BP）涉及條目主要包含鈣離子調(diào)控穩(wěn)態(tài)、化學(xué)突觸傳遞等（圖8B）。

圖8 生脈散抗AD潛在優(yōu)勢調(diào)控靶點富集分析

3.6.6 開心散與生脈散中樞神經(jīng)炎癥調(diào)控效用驗證

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果顯示，NF-κB 信號通路是開心散抗AD 的重要信號通路，趨化因子（Chemokine）信號通路是生脈散抗AD 的重要信號通路，均提示中樞神經(jīng)免疫調(diào)控是開心散與生脈散抗AD 的重要機制。為驗證該效用，我們采用Aβ 海馬區(qū)注射擬AD 小鼠整體動物模型與小膠質(zhì)細胞BV2 離體細胞模型對該效應(yīng)進行驗證。

在整體動物模型上，模型組小鼠較空白組潛伏期、上臺前路程均有顯著增加（P＜0.01）而站臺穿越次數(shù)顯著減少（P＜0.01）（圖9A），對新臂的探索次數(shù)和探索時間均顯著降低（P＜0.01，P＜0.05）（圖9B），提示海馬區(qū)注射Aβ 誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生學(xué)習(xí)與記憶能力障礙，開心散與生脈散提取物均能提高小鼠學(xué)習(xí)和空間記憶能力。

圖9 開心散與生脈散對Aβ海馬區(qū)注射小鼠學(xué)習(xí)與記憶能力的影響（n=8）

Aβ 沉積會激活小膠質(zhì)細胞誘發(fā)中樞神經(jīng)免疫反應(yīng)，表現(xiàn)為炎性細胞因子的大量表達。采用ELISA 方法檢測小鼠血清中炎性因子的水平。如圖10所示，模型組小鼠海馬組織炎性因子表達水平較空白組顯著上升（P＜0.05），開心散與生脈散提取物均能顯著逆轉(zhuǎn)炎性因子表達上升。

圖10 開心散與生脈散對Aβ海馬區(qū)注射小鼠海馬組織炎性因子水平表達的影響（n=8）

基于小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)免疫炎性反應(yīng)最重要的效應(yīng)細胞之一，構(gòu)建LPS 刺激誘導(dǎo)BV2 細胞炎癥損傷模型，給以復(fù)方提取物，利用qPCR 方法檢測BV2細胞中炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α 的mRNA 表達水平進行驗證分析。結(jié)果如圖11 所示，1 μg·mL-1LPS能夠顯著刺激BV2 細胞表達炎性因子（P＜0.01），開心散與生脈散均可顯著逆轉(zhuǎn)上升趨勢，以開心散提取物高劑量作用趨勢最強。

圖11 開心散與生脈散對LPS誘導(dǎo)損傷下BV2細胞炎性因子表達的影響

4 討論

AD 發(fā)病機制復(fù)雜，涉及Aβ 的級聯(lián)反應(yīng)、tau 異常磷酸化、乙酰膽堿丟失、突觸功能失調(diào)、慢性炎癥、基因突變等。研究發(fā)現(xiàn)，開心散可顯著改善APP/PS1 模型小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力，逆轉(zhuǎn)模型小鼠AchE 活性升高，對抗Aβ 誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷，并具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗炎等作用[24]。臨床研究亦證實開心散是有效的治療AD 的方劑。林丹霞等人觀察口服開心聯(lián)合鹽酸多奈哌齊治療AD 實驗發(fā)現(xiàn)聯(lián)用效果顯著高于單一西藥治療；陳艷懂等人察發(fā)現(xiàn)調(diào)神益智針聯(lián)合開心散療法具有顯著改善認(rèn)知功能的作用[25]。生脈散在防治神經(jīng)精神系統(tǒng)疾病也具有良好療效，邱秉新等人臨床統(tǒng)計限制生脈散治療14 例老年性癡呆和17 例多發(fā)性梗塞性癡呆總有效率達74.2%[26]。實驗研究也證實其具有抗應(yīng)激損傷、降脂、改善腦功能等作用[27-28]。因此，我們采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，將這兩張已經(jīng)臨床與實驗研究有效的抗AD 治療方劑中成分和靶點進行網(wǎng)絡(luò)化的聯(lián)結(jié)與分析，建立開心散與生脈散復(fù)方-有效成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，分析兩個復(fù)方抗AD 潛在共性及優(yōu)勢調(diào)控靶點互作關(guān)系和潛在靶點作用通路，探索開心散與生脈散抗AD 的共性與個性調(diào)控機制，有利于闡明其對AD“同病異治”科學(xué)內(nèi)涵。

分析發(fā)現(xiàn)，開心散與生脈散共有抗AD 靶點中很大部分來自與它們的共有藥味-人參，涉及細胞的信號傳導(dǎo)、存活與凋亡、炎癥反應(yīng)、應(yīng)激適應(yīng)等。其核心靶點APP 異常水解形成的Aβ 沉積是AD 最大的病理特征之一。研究發(fā)現(xiàn)開心散能夠下調(diào)快速老化癡呆SAMP8小鼠腦內(nèi)β-APP表達；生脈散能夠改善三氯化鋁聯(lián)合D-半乳糖制備AD 模型大鼠認(rèn)知障礙，抑制Aβ 毒性保護神經(jīng)元；人參中多種皂苷成分能夠顯著改善AD 患者中樞神經(jīng)癥狀，可以增加α-分泌酶和sAPPα的表達，同時降低β-分泌酶和Aβ的表達，人參皂苷Rg1、Rb1、Rd、Re 等具有提高學(xué)習(xí)記憶能力等作用[29]。除APP 外，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測分析的PIK3CA、AKT1參與的PI3K-AKT信號通路顯著影響細胞增殖、分化、凋亡。開心散能夠上調(diào)三氯化鋁聯(lián)合D-半乳糖制備AD模型小鼠PI3K、p-AKT蛋白表達，改善腦組織病理損傷，促進AD 腦內(nèi)源神經(jīng)再生[30]；生脈散中的五味子素也可轉(zhuǎn)錄STAT3 信號，激活PI3K-AKT 信號通路減輕小膠質(zhì)細胞所致的炎癥損傷。共性調(diào)控靶點富集分析結(jié)果涉及AGE-RAGE 信號通路、AMPK 通路、tau 蛋白結(jié)合、氧化還原酶活性等作用機制。韓麗君等報道開心散含藥血清能夠降低模型小鼠AGEs 含量，抑制AGE 與RAGE 的結(jié)合，具有延緩衰老的作用[31]；石菖蒲所含的揮發(fā)油、茯苓所含的三萜酸等成分能調(diào)節(jié)氧化還原酶活性起到抗氧化的作用，增加SOD的活力等；生脈散能夠激活A(yù)MPK 信號通路改善線粒體脂質(zhì)代謝紊亂和形態(tài)損傷，五味子中的五味子酚等活性成分能提高機體抗氧化能力，增加腦組織內(nèi)SOD活力，抑制CAT 性，對抗機體氧化應(yīng)激損傷[32-33]。上述報道均顯示，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測結(jié)果與實驗報道一致，因此該方法是探討復(fù)方功效物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機制的有效方法。

研究表明，AD 病人腦實質(zhì)中小膠質(zhì)細胞過度活化轉(zhuǎn)變成M1 型，趨化因子CXCL1、CXCL9、CXCL10 等表達上調(diào)，參與促炎反應(yīng)，CX3CL1 則能抑制Tau 蛋白病變，具有神經(jīng)信號傳導(dǎo)和神經(jīng)保護作用。炎性細胞因子和趨化因子的水平升高，共同形成神經(jīng)慢性炎癥反應(yīng)，是AD 的重要病理機制[34,35]。本研究發(fā)現(xiàn)開心散抗AD 潛在核心靶點與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與中樞神經(jīng)炎癥調(diào)控密切相關(guān)，例如RelA 是NF-κB家族的重要成員，TNF、CXCL8、CXCR2 等靶點均與炎癥的調(diào)節(jié)和細胞防御應(yīng)答等密切相關(guān)。KEGG 通路富集分析結(jié)果也顯示NFκB 通路這一中樞神經(jīng)免疫炎性反應(yīng)的核心通路。曲蘇晨等人發(fā)現(xiàn)開心散能夠抑制NF-κB 入核和NF-κB磷酸化等環(huán)節(jié)發(fā)揮抗炎作用，顯著下調(diào)IL-1β、IL-6、TNF-α 等炎癥因子的表達水平，抑制炎癥反應(yīng)[36,37]。生脈散亦可降低IL-6，TNF-α 表達，減輕炎癥反應(yīng)及增強機體免疫力，通過應(yīng)激活化蛋白激酶途徑減少自噬體形成[38]。生脈散的調(diào)控通路中也涉及趨化因子信號通路。本研究中驗證實驗結(jié)果也顯示，開心散與生脈散能夠有效改善Aβ 海馬區(qū)注射小鼠海馬區(qū)和小膠質(zhì)細胞炎性因子表達，支持了中樞神經(jīng)免疫調(diào)控是開心散與生脈散抗AD 共性的調(diào)控通路與生物學(xué)事件的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為研究中藥復(fù)方的物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機制提供了有力的手段，但也存在顯而易見的局限性。例如，僅僅依據(jù)復(fù)方成分展開網(wǎng)絡(luò)化的靶點連結(jié)與機制的深入分析，忽視了活性成分在復(fù)方中含量，無法體現(xiàn)量效關(guān)系。同時，數(shù)據(jù)庫之間的算法差異也會干擾預(yù)測。因此，實驗驗證是保障網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究可靠性的重要手段。本研究中，我們采用整體動物與離體細胞實驗結(jié)合，對網(wǎng)絡(luò)預(yù)測的中樞神經(jīng)炎癥調(diào)控環(huán)節(jié)加以驗證，發(fā)現(xiàn)開心散與生脈散確實具有改善Aβ 注入誘導(dǎo)癡呆模型小鼠的認(rèn)知功能障礙，下調(diào)小鼠體內(nèi)的炎癥因子IL-1β，IL-6，TNF-α 水平，起到抗炎的作用，并在LPS 誘導(dǎo)炎癥細胞模型上也得到了抗炎效果的驗證。并且，從驗證性實驗中炎性因子的調(diào)控程度分析，開心散表現(xiàn)出較生脈散較強的作用趨勢，這也與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析中炎性調(diào)控靶點與通路為開心散優(yōu)勢調(diào)控靶點與通路的分析結(jié)果一致。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，我們發(fā)現(xiàn)，開心散與生脈散因其有共同的組成藥味而有共性的抗AD 調(diào)控靶點與通路，也因配伍藥味的不同而擁有獨特的調(diào)控靶點。同時兩方雖然有各自優(yōu)勢靶點，但也可能歸結(jié)到相同的通路發(fā)揮調(diào)控作用，這可能是開心散與生脈散“同病異治”抗AD 的科學(xué)內(nèi)涵。在今后的研究工作中，我們將繼續(xù)對兩張復(fù)方抗AD 的優(yōu)勢調(diào)控靶點與通路進行驗證與研究，更好闡釋“同病異治”這一中醫(yī)辨證論治方法的科學(xué)內(nèi)涵，同時為開心散與生脈散的基礎(chǔ)研究與產(chǎn)品開發(fā)提供更多的現(xiàn)代科學(xué)證據(jù)。

5 結(jié)論

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)網(wǎng)絡(luò)化聯(lián)結(jié)與分析方法，構(gòu)建了抗AD 常用中藥復(fù)方開心散與生脈散成分-靶點調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)炎癥調(diào)控是開心散與生脈散復(fù)方抗AD 的重要生物學(xué)機制。整體動物與離體細胞實驗也證實，開心散與生脈散復(fù)方能顯著降低小鼠海馬以及炎癥損傷Bv2細胞模型中的炎癥因子表達水平，改善AD 模型小鼠認(rèn)知功能障礙，驗證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的發(fā)現(xiàn)。研究結(jié)果有利于闡釋開心散與生脈散復(fù)方“同病異治”抗AD 的科學(xué)內(nèi)涵和作用機制，也為開心散與生脈散抗AD 產(chǎn)品的開發(fā)提供了科學(xué)證據(jù)與思路拓展。