王 鵬, 林一凡, 胡利明, 莫善雁

(北京工業(yè)大學(xué) 環(huán)境與生命學(xué)部 北京市環(huán)境與病毒腫瘤學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100124)

菁染料具有優(yōu)秀的光學(xué)性質(zhì),如摩爾吸收系數(shù)高、吸收和發(fā)射波段較長、熒光量子產(chǎn)率較高等[1-3]。目前,已有大量基于菁染料的響應(yīng)型分子探針被應(yīng)用于腫瘤組織的診療,例如吲哚菁綠(ICG)[4]已被FDA批準(zhǔn)用于臨床,800CW、ZW800-1等正在進(jìn)行臨床III期研究。

菁染料具有較大的共軛烯烴體系,在水溶液中易造成聚集誘導(dǎo)淬滅現(xiàn)象[5-8],導(dǎo)致熒光成像的信號(hào)減弱。然而,該性質(zhì)對于降低染料(尤其是雙菁染料)在普通組織的成像背景有獨(dú)特的效果。由于雙菁染料具有比單菁染料更大的共軛體系,因此熒光淬滅更強(qiáng)。此外,如采用可響應(yīng)腫瘤微環(huán)境斷裂的基團(tuán)連接雙菁染料,則可在腫瘤部位釋放出具有較強(qiáng)熒光信號(hào)的單菁染料,實(shí)現(xiàn)熒光恢復(fù),最終實(shí)現(xiàn)腫瘤組織的高分辨熒光成像。但目前所報(bào)道的雙菁染料熒光淬滅還不夠完全,在正常組織中仍有部分殘留背景。另外,水溶性雙菁染料尚未到達(dá)腫瘤部位熒光恢復(fù)就已被腎臟等組織代謝清除[9-11],體內(nèi)腫瘤組織成像效果較差。

鑒于此,本文設(shè)計(jì)合成了一種兩親性雙菁染料(Scheme 1),該染料由一個(gè)水溶性菁染料與一個(gè)脂溶性菁染料通過雙硫鍵連接組成。在單體狀態(tài)下,雙菁染料熒光部分淬滅,但在水中自組裝成納米粒子后,熒光淬滅高達(dá)92%;該納米粒子與谷胱甘肽(GSH)響應(yīng)后可將雙硫鍵斷裂,分解成具有較強(qiáng)熒光的單菁染料,熒光恢復(fù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

UV-3200型紫外可見分光光度計(jì);LS-45/55型熒光分光光度計(jì);Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀;ASCEndTM 400 MHz型核磁共振儀。

碘甲烷,99.5%,薩恩化學(xué)試劑(上海)有限公司;對巰基苯甲酸,99%,安耐吉;無水N,N-二甲基甲酰胺,99%,席恩思;O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽,99%,麥克林;N,N-二異丙基乙胺,99%,安耐吉;三氟乙酸,98%,源葉生物;Cl-SO3Cy7,實(shí)驗(yàn)室自制;Cl-Cy7.5,實(shí)驗(yàn)室自制;胱胺鹽酸鹽,99%,安耐吉;谷胱甘肽,99%,源葉生物;二碳酸二叔丁酯,99%,席恩思;其余所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1) 化合物1的合成

將Cl-Cy7.5(0.5 g, 0.86 mmol)與對巰基苯甲酸(0.264 mg, 1.62 mmol)溶于12 mL無水DMF中,氬氣保護(hù)下反應(yīng)15 h。反應(yīng)結(jié)束后加入水(20 mL),用二氯甲烷(3×20 mL)萃取,有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥,濃縮,再經(jīng)硅膠柱層析純化得化合物1，綠色固體356 mg,產(chǎn)率59.3%;1H NMR (400 MHz, MSO-d6)δ: 8.67(d,J=14.3 Hz, 2H), 8.22(d,J=8.5 Hz, 2H), 8.06(d,J=12.2 Hz, 8.6 Hz, 4H), 7.90(d,J=8.5 Hz, 2H), 7.75(d,J=12.2 Hz, 2H), 7.65～7.56(m, 2H), 7.52～7.41(m, 4H), 6.37(d,J=14.3 Hz, 2H), 3.77(s, 6H), 2.83(s, 4H), 1.98(s, 2H), 1.79～1.56(m, 12H)。

(2) 化合物2的合成

將胱胺鹽酸鹽(1 g, 4.44 mmol)溶于在50 mL甲醇中,在冰水浴下加入三乙胺(1.86 mL, 13.33 mmol),攪拌30 min。然后逐滴加入二碳酸二叔丁酯(0.506 mL, 4.44 mmol),繼續(xù)攪拌1 h,再溶液在真空濃縮。殘余物用乙醚洗滌(20 mL×3),乙醚層加入1M的NaOH(20 mL),攪拌20 min,分去有機(jī)相，水相再用二氯甲烷(2×20 mL)萃取,將所有有機(jī)相合并,再用無水Na2SO4干燥,得到852 mg的化合物2,產(chǎn)率74%;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 7.03(t,J=5.8 Hz, 1H), 3.20(dd,J=13.4 Hz, 2H), 2.77(t,J=5.8 Hz, 2H), 2.72(dd,J=13.4 Hz, 4H), 1.37(s, 9H)。

(3) 化合物3的合成

將1(200 mg, 0.28 mmol)溶于10 mL DMF中,依次加入HBTU(130 mg, 0.336 mmol)、 DIPEA(86.12 mg, 0.616 mmol),在氬氣保護(hù)下常溫反應(yīng)0.5 h。隨后,加入2(86.85 mg)繼續(xù)反應(yīng)12 h。反應(yīng)結(jié)束后加入水(20 mL),用二氯甲烷(3×20 mL)萃取,有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥,濃縮,再經(jīng)硅膠柱層析純化,得到化合物3，綠色固體130 mg,產(chǎn)率54%;1H NMR(400 MHz ,DMSO-d6,)δ: 8.68(d,J=14.1 Hz, 2H), 8.21(d,J=8.2 Hz, 2H), 8.10～8.00(m, 4H), 7.80(d,J=7.7 Hz, 2H), 7.73(s, 2H), 7.60(d,J=7.7 Hz, 2H), 7.49(t,J=7.2 Hz, 2H), 7.42(d,J=8.2 Hz, 2H), 6.93(s, 1H), 6.36(d,J=14.1 Hz, 2H), 3.76(s, 6H), 3.44(s, 2H), 3.13(d,J=7.2 Hz, 2H), 2.82(s, 4H), 2.69(s, 4H), 1.98(s, 2H), 1.71(s, 12H), 1.30(s,9H), 1.23(s,2H)。

Scheme 1

(4) 化合物4的合成

將Cl-SO3Cy7(200 mg, 0.2 mmol)與對巰基苯甲酸(72 mg, 0.4 mmol)加入到8 mL無水DMF中,在黑暗條件下反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后加入水(20 mL),用二氯甲烷(3×20 mL)萃取,有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥,濃縮,再經(jīng)硅膠柱層析純化得化合物4，綠色固體120 mg,產(chǎn)率56%;1H NMR(400 MHz ,DMSO-d6)δ: 8.61(d,J=13.3 Hz, 2H), 7.80(d,J=8.3Hz, 2H), 7.67(d,J=13.3 Hz, 2H), 7.60(d,J=8.2 Hz, 2H), 7.35(d,J=8.3 Hz, 2H), 7.19(d,J=8.2 Hz, 2H), 6.37(d,J=14.3 Hz, 2H), 4.20(dd,J=14.7 Hz, 4H), 2.84～2.66(m, 4H), 2.03～1.82(m, 4H), 1.64(d,J=14.3 Hz, 2H), 1.40(d,J=14.7 Hz, 8H), 1.23(s, 12H)。

(5) 化合物SO3Cy7-ss-Cy7.5的合成

常溫下,將4(80.14 mg, 0.08 mmol)溶于5 mL DMF中,依次加入HBTU(36.28 mg, 0.096 mmol)、 DIPEA(22.66 mg, 0.176 mmol),反應(yīng)半小時(shí)后,加入3(80 mg, 0.096 mmol),繼續(xù)反應(yīng)過夜。反應(yīng)結(jié)束后加入水(20 mL),用二氯甲烷(3×20 mL)萃取,有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥,濃縮,再經(jīng)硅膠柱層析純化得化合物SO3Cy7-ss-Cy7.5,綠色固體83 mg,產(chǎn)率51%;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6,)δ: 8.73～8.60(m, 4H), 8.48(d,J=13.2 Hz, 2H), 8.20(d,J=8.2 Hz, 2H), 8.06～7.96(m, 4H), 7.86(d,J=8.2 Hz, 2H), 7.72(d,J=8.3 Hz, 4H), 7.67(s, 2H), 7.59(dd,J=13.2 Hz, 7.9 Hz, 4H), 7.49～7.43(m, 2H), 7.40(d,J=8.3 Hz, 2H), 7.34(d,J=8.3 Hz, 2H), 7.28(d,J=8.3Hz, 2H), 6.41～6.30(m, 4H), 4.15(s, 4H), 3.75(s, 6H), 2.79(s, 12H), 1.93(s, 4H), 1.74(s, 8H), 1.70(s, 8H), 1.34(s, 12H), 1.22(s, 12H); MS(MALDI-TOF)m/z: calcd for C88H100N6O14S8Na2{[M+2Na]+}1766.4848, found 1766.4790。

1.3 熒光染料納米粒子(SO3Cy7-ss-Cy7.5)的光譜性質(zhì)測試

(1) 納米粒子的制備

將5 mg上述合成的SO3Cy7-ss-Cy7.5加入到2 mL DMSO中,充分?jǐn)嚢? h。將溶液滴加至5 mL去離子水中,繼續(xù)攪拌1 h。然后將溶液轉(zhuǎn)移到透析袋(MWCO=8000 g·mol-1)中透析48 h,每6 h換一次去離子水[12-13]。

(2) 谷胱甘肽母液的配制

稱取10 mg谷胱甘肽,用1000 μL的移液槍稀釋至3259 μL,制備得到濃度為10 mM的谷胱甘肽(GSH)母液,避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 熒光染料納米粒子(SO3Cy7-ss-Cy7.5)不同濃度GSH響應(yīng)的熒光光譜測試方法

配制若干批納米粒子待測液(5 μM),分別加入稀釋成不同濃度的GSH溶液(1-2500 μM)。靜置60 min后轉(zhuǎn)移至熒光專用比色皿中,記錄在792 nm激發(fā)下的熒光強(qiáng)度值。利用Origin軟件繪制濃度-熒光依賴曲線(橫軸為GSH濃度,縱軸為對應(yīng)的熒光響應(yīng)強(qiáng)度)

1.5 納米粒子抗干擾能力的測試方法

配制若干批探針納米粒子待測液(5 μM),分別加入相同濃度的His, Ser, Cys, GSH, Tyr, Glu, Arg等氨基酸,記錄在792 nm激發(fā)下的熒光強(qiáng)度值。

1.6 納米粒子穩(wěn)定性的測試方法

配制兩批探針納米粒子待測液(5 μM),其中一組不添加GSH,然后分別加入不同pH(2～12)的PBS緩沖液;另一組加入GSH(1.5 mM),加入PBS緩沖溶液,調(diào)節(jié)pH(2～12),記錄在792 nm激發(fā)下的熒光強(qiáng)度值[14-15]。

1.7 納米粒子細(xì)胞毒性的測試方法

將Hela細(xì)胞以每孔5000的密度預(yù)先接種于96孔中,培養(yǎng)4 h。然后用不同濃度納米粒子的孵育24 h。用MTS法檢測評估細(xì)胞存活率。

2 結(jié)果與討論

2.1 表征

圖1為納米粒子的DLS圖。由圖1可知,納米粒子的平均尺寸約為52.6 nm。

Diameter/nm 圖1 納米粒子(20 μM/L)的DLS圖

2.2 納米粒子的識(shí)別機(jī)理

GSH與納米粒子中雙染料二硫鍵發(fā)生反應(yīng),二硫鍵斷裂,生成具有較強(qiáng)熒光的單菁染料,進(jìn)而發(fā)出熒光信號(hào)(Scheme 2)。

Scheme 2

2.3 光譜性質(zhì)

雙染料納米粒子(水溶液),雙染料單體(DMSO溶液)和Cl-SO3Cy7(水溶液)的紫外可見光吸收譜圖(a)和熒光譜圖(b)如圖2所示。紫外光譜(a)顯示,雙染料單體和Cl-SO3Cy7的最大吸收波長均在775 nm附近,而在納米粒子的譜圖中,出現(xiàn)了較為明顯的肩峰(700 nm),表明納米粒子內(nèi)部存在較嚴(yán)重的聚集作用。熒光光譜(b)進(jìn)一步驗(yàn)證了該聚集現(xiàn)象,據(jù)統(tǒng)計(jì),納米粒子的熒光強(qiáng)度僅為Cl-SO3Cy7的8%。以上結(jié)果說明,雙染料納米粒子的高熒光淬滅特性可以降低染料在正常組織的成像背景。

λ/nm

2.4 納米粒子與GSH反應(yīng)之后的熒光譜圖變化

將納米粒子的PBS溶液(5 μM, pH=7.4)與GSH(1.5 mM)處理后,833 nm處的熒光信號(hào)強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。75 min后,達(dá)到最大強(qiáng)度,此時(shí)的強(qiáng)度為加入GSH前的16倍(圖3)。

c/μM圖3 納米粒子(5 μM)與GSH(1.5 mM)反應(yīng)過程的時(shí)間-熒光強(qiáng)度依賴曲線

2.5 納米粒子與不同濃度GSH反應(yīng)后的熒光強(qiáng)度變化

在兩親性雙染料納米粒子(5 μM, PBS, pH=7.4)中加入不同濃度GSH溶液(0～2500 μM/L)時(shí),納米粒子的熒光恢復(fù)率與GSH的濃度密切相關(guān)。如圖4所示,隨著GSH濃度增加,熒光強(qiáng)度變大的幅度也增加,當(dāng)GSH的濃度為2.5 mM時(shí),熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值。

c/μM圖4 納米粒子(5 μM)與GSH(0～2500 μM)反應(yīng)(75 min)后的濃度-熒光強(qiáng)度曲線

2.6 熒光響應(yīng)的抗干擾能力

將半胱氨酸(Cys)、谷胱甘肽(Glu)、酪氨酸(Tyr)、組氨酸(His)、精氨酸(Arg)、絲氨酸(Ser)等不同的氨基酸加入到兩親性雙硫鍵雙染料納米粒子溶液中,如圖5所示,當(dāng)氨基酸含巰基(Cys、GSH)時(shí),納米粒子的熒光恢復(fù)程度較大,而當(dāng)氨基酸中無巰基時(shí),熒光幾乎沒有恢復(fù)。其中,GSH導(dǎo)致的熒光恢復(fù)強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其它氨基酸。這說明雙菁染料的納米粒子GSH響應(yīng)選擇性較高,較適合在生理環(huán)境下用該納米粒子對GSH成像。

Amino acids圖5 納米粒子的抗干擾試驗(yàn)

2.7 pH對熒光響應(yīng)的影響

為了驗(yàn)證兩親性雙硫鍵雙染料納米粒子是否能適用于人體正常的生理環(huán)境,進(jìn)行pH對熒光響應(yīng)穩(wěn)定性的實(shí)驗(yàn),結(jié)果見圖6。由圖6可知,在不添加GSH時(shí),在pH 2～10內(nèi),熒光強(qiáng)度都比較弱,幾乎沒有太大變化,這說明納米粒子有良好的酸堿穩(wěn)定性。在添加GSH之后,熒光強(qiáng)度相對于未添加GSH時(shí)都有所增強(qiáng),其中,在pH 6～9內(nèi),熒光強(qiáng)度增加較多,因此,該納米粒子適合在人體的生理內(nèi)環(huán)境進(jìn)行GSH響應(yīng)的熒光成像。

pH圖6 納米粒子熒光強(qiáng)度隨溶液pH值的變化

2.8 納米粒子的細(xì)胞毒性

通過MTS法評估納米粒子的體外細(xì)胞毒性,用不同濃度的納米粒子處理Hela細(xì)胞,結(jié)果見圖7。由圖7可知,納米粒子濃度的增加僅導(dǎo)致細(xì)胞活力的輕微下降,這表明納米粒子對細(xì)胞幾乎沒毒性,可以進(jìn)一步應(yīng)用于活細(xì)胞成像和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

c/μM圖7 細(xì)胞存活率

成功合成了一種含雙硫鍵雙菁染料,該雙染料由于兩親性的的特性,可自組裝成納米粒子,納米粒子的熒光強(qiáng)度相對于單菁染料淬滅高達(dá)92%,而在與GSH響應(yīng)之后,熒光恢復(fù),熒光強(qiáng)度增大16倍。氨基酸對熒光響應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該響應(yīng)對GSH的選擇性較高。此外,納米粒子能在生理環(huán)境的pH范圍內(nèi)熒光恢復(fù),且納米粒子幾乎沒有細(xì)胞毒性。因此,可以進(jìn)一步應(yīng)用于GSH的活細(xì)胞和動(dòng)物成像。