賈秀雯，李曉雪，王盼盼，史 怡，劉文菊，曹云者

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院/河北省農(nóng)田生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實驗室，河北 保定 071000；2.中國環(huán)境科學(xué)研究院，環(huán)境基準(zhǔn)與風(fēng)險評估國家重點(diǎn)實驗室，北京 100012）

六六六，作為有機(jī)氯廣譜殺蟲劑，曾在全球范圍內(nèi)廣泛使用。其具有殘留持久性，易在土壤中蓄積造成環(huán)境污染，尤其是在工業(yè)污染場地［1］。目前，國內(nèi)外針對六六六污染土壤，采用較多的修復(fù)技術(shù)主要包括土壤淋洗、化學(xué)氧化還原、熱脫附、土壤氣相抽提以及微生物修復(fù)等，其中熱脫附具有污染物去除效率高，修復(fù)周期短的特點(diǎn)，可快速修復(fù)六六六污染土壤。但熱脫附技術(shù)在修復(fù)六六六污染土壤時操作溫度通常需要達(dá)到500 ～750℃［2］，才可完全去除污染物，如此的高溫操作勢必會破壞土壤的理化和生物學(xué)特性，影響修復(fù)后土壤的安全利用［3-6］。

有研究表明，不同污染的土壤，如石油烴、有機(jī)氯農(nóng)藥和多環(huán)芳烴污染的土壤經(jīng)熱脫附修復(fù)后，易造成土壤pH 上升，有機(jī)質(zhì)、速效鉀含量降低，同時也會降低土壤中粉粒和黏粒的含量，使土壤沙化程度增加，從而導(dǎo)致土壤結(jié)構(gòu)改變，質(zhì)量嚴(yán)重退化［7-11］。此外，熱脫附后土壤理化性質(zhì)的改變也會直接影響其生物學(xué)指標(biāo)，有機(jī)氯農(nóng)藥污染土壤熱脫附后，土壤酶活性和微生物群落短時間內(nèi)難以恢復(fù)［10］，并且植物也不能在修復(fù)土壤中正常生長［3］，而多環(huán)芳烴污染土壤熱脫附后經(jīng)過長達(dá)2.5 年時間恢復(fù)，并在修復(fù)土中種植作物后，發(fā)現(xiàn)修復(fù)土壤中微生物和動物的豐度和多樣性明顯恢復(fù)，且高于對照［11］。因此當(dāng)污染土壤進(jìn)行熱脫附處理后，有必要對修復(fù)后的土壤質(zhì)量進(jìn)行評價。而土壤生物學(xué)特性被認(rèn)為是與土壤質(zhì)量有關(guān)的敏感參數(shù)，主要包括植物生長狀況、土壤微生物種群組成與結(jié)構(gòu)、以及典型土壤酶的活性等［12-13］，在一定程度上可表征為生物學(xué)指標(biāo)對周圍環(huán)境的響應(yīng)，可作為評價修復(fù)后土壤的安全利用、土壤質(zhì)量提升和土壤生態(tài)系統(tǒng)可持續(xù)性的重要指標(biāo)［14-16］。而目前關(guān)于單一六六六污染土壤經(jīng)過熱脫附后其生物學(xué)響應(yīng)鮮有報道?；诖吮驹囼炨槍Φ湫土廴荆?jīng)熱脫附高溫處理后土壤，選擇種植抗瘠薄能力強(qiáng)的植物—高羊茅（Festuca elataKeng ex E. Alexeev），從植物生長、土壤酶活性和土壤微生物群落多樣性探究典型六六六污染土壤熱脫附修復(fù)后的生物響應(yīng)效應(yīng)，為熱脫附修復(fù)后土壤的安全再利用問題提供數(shù)據(jù)和方法支撐。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)為北方某有機(jī)氯農(nóng)藥廠，是一家有60 多年生產(chǎn)歷史的農(nóng)藥廠，2013 年已停產(chǎn)，2019 年10月對廠區(qū)土壤進(jìn)行熱脫附修復(fù)。

1.2 供試材料

正常土壤（CK）：為該農(nóng)藥廠周邊無污染土壤（采樣點(diǎn)位于污染場地南側(cè)，相距3 km）；修復(fù)后土壤（AR）：有機(jī)氯農(nóng)藥廠污染土壤采用異位熱脫附技術(shù)進(jìn)行修復(fù)（熱脫附工作溫度為500 ～ 750℃，修復(fù)后的土壤回填至原有基坑，放置時間為1 個月）。供試植物：高羊茅（Festuca elata）品種為‘愛瑞3 號’（Arid 3），其適應(yīng)性和抗逆性強(qiáng)，尤其是抗瘠薄能力很強(qiáng)。

供試土壤采用多點(diǎn)采樣法采集0 ～20 cm 土樣，運(yùn)回實驗室后陰涼處風(fēng)干，將土壤磨碎后過5 mm篩后保存?zhèn)溆?。種植高羊茅之前測定了供試土壤的基本理化性質(zhì)（表1）和生物學(xué)特性（表2）。

表1 供試土壤的基本理化性質(zhì)Table 1 Basic physical and chemical properties of tested soils

表2 供試土壤的生物學(xué)指標(biāo)Table 2 Biological characteristics of tested soils

1.3 試驗設(shè)計

該盆栽試驗于2020 年10 月21 日至12 月21 日在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)日光溫室進(jìn)行。本試驗采用正常土壤（CK）和農(nóng)藥廠經(jīng)熱脫附修復(fù)后土壤（AR），均種植高羊茅，每個處理設(shè)6 次重復(fù)，共12 盆。每盆（直徑約為15 cm，高10 cm）裝1 kg 土壤，底肥施用量為 N：200 mg/kg、P2O5：150 mg/kg、K2O：200 mg/kg，分別以 (NH2)2CO、Ca(H2PO4)2·H2O、KCl 的形式施入，將底肥與土壤充分混勻后，灌水500 mL 使土壤持水量保持在70%～80%，土壤平衡5 d 后播種，期間為保持土壤水分每2 d 澆1 次水，每次澆水量為200 mL/盆。高羊茅種子經(jīng)2%NaClO 消毒后，分散放在鋪有濕潤紗布的培養(yǎng)皿（?9 mm）中，并在25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)至露白播種，將其均勻播種在培養(yǎng)缽中，20 粒/盆，播深1 cm，澆水100 mL。待所有高羊茅完全出苗后進(jìn)行間苗，每盆保留15 株長勢均勻的幼苗。高羊茅種植60 d后收獲。

1.4 測定指標(biāo)與方法

土壤基本理化性值測定［17］：土壤pH 值在土水比1∶2.5 下用復(fù)合電極酸度計法測定；有機(jī)質(zhì)（SOM）用重鉻酸鉀—稀釋加熱法測定；有效磷用NaHCO3浸提—鉬銻抗比色法測定；速效鉀用NH4OAc—火焰光度法測定；陽離子交換量用乙酸銨交換法；全氮使用碳氮分析儀測定；機(jī)械組成使用激光粒度儀測定。

植株生長指標(biāo)：植株株高、莖粗和地上部、地下部干鮮重。

微生物區(qū)系（有效活菌數(shù)量）測定采用稀釋平板計數(shù)法［18］：細(xì)菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；真菌用馬丁孟加拉紅培養(yǎng)基；放線菌用改良高氏1 號培養(yǎng)基。

土壤酶活性測定［19］：脲酶活性用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法測定；磷酸酶（酸性和堿性）活性用磷酸苯二鈉比色法測定；蔗糖酶活性用3，5-二硝基水楊酸比色法測定；脫氫酶比色法測定；β-葡萄糖苷酶用硝基酚比色法測定。

土壤細(xì)菌群落多樣性測定：采用16S 高通量測序的方法，將16S rRNA 基因的V3 ～V4 區(qū)擴(kuò)增，擴(kuò)增引物為338F(5-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3')和806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')。PCR 擴(kuò)增條件為：95 ℃變性30 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，27 個循環(huán)，最終72 ℃延伸10 min。PCR 反 應(yīng) 體 系 為：5×FastPfu Buあer 4 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，正向和反向引物（5 mmol/L）各0.8 μL，F(xiàn)astPfu DNA 聚 合 酶0.4 μL，DNA 模 板（10 ng/μl）1 μL，最終用ddH2O 補(bǔ)足至20 μL。每個DNA 樣品做3 次重復(fù)，將同一樣品的PCR 產(chǎn)物混合后用2%的瓊脂糖凝膠回收并用DNA 膠回收試劑盒（Axygen Biosciences, USA）進(jìn)行純化，Tris-HCl洗脫，2% 瓊脂糖電泳檢測。利用QuantiFluor?-ST (Promega, USA)測定濃度。高通量測序在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司（Majorbio Bio-Pharm Technology Co., Ltd., Shanghai, China）測序平臺進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用美吉云平臺(www.i-sanger.com)進(jìn)行細(xì)菌注釋及多樣性指數(shù)計算，Excel 2016 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，SPSS23 軟件進(jìn)行方差分析，數(shù)據(jù)分析用獨(dú)立樣本T檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 正常土壤和修復(fù)土壤中高羊茅生長狀況分析

高羊茅在正常土壤和修復(fù)土壤中生長60 d 后，分析了植物的株高、莖粗、地上部和地下部干鮮重等生長指標(biāo)（表3）。結(jié)果表明，高羊茅都能在2種土壤中發(fā)芽并生長，但是修復(fù)后的土壤種植的高羊茅其株高、莖粗和地上部鮮重、干重均顯著低于正常無污染土壤；2 種土壤地下部根鮮重和干重?zé)o顯著差異。因此，在60 d 的生長周期，修復(fù)土壤的狀況抑制了高羊茅的正常生長?？赡苁且驗榱廴镜耐寥澜?jīng)過熱脫附修復(fù)后，其土壤pH 值顯著增加可高達(dá)9.0 以上，此外有機(jī)質(zhì)、陽離子交換量和機(jī)械組成，尤其是土壤黏粒遭到高溫的破壞而銳減（表2），從而顯著影響了高羊茅的正常生長。

表3 正常土壤和修復(fù)土壤中高羊茅植株的生長狀況Table 3 The growth conditions of tall fescue in normal soil and remediated soil

2.2 修復(fù)土壤中微生物數(shù)量和酶活性的響應(yīng)效應(yīng)

種植高羊茅60 d 后2 種土壤中微生物數(shù)量和6種土壤酶活性如下表所示（表4、表5）。熱脫附修復(fù)后的土壤微生物區(qū)系有效活菌的數(shù)量顯著低于正常土壤（P<0.05）。正常土壤中細(xì)菌、真菌和放線菌的數(shù)量分別是修復(fù)后土壤的28、55 和1 600 倍，兩種土壤中放線菌數(shù)量的差異最大，這說明種植高羊茅60 d 后的修復(fù)土壤中細(xì)菌的恢復(fù)較快，其次是真菌，放線菌的恢復(fù)能力最弱。此外，研究發(fā)現(xiàn)與正常土壤相比，修復(fù)土壤中蔗糖酶、脲酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、脫氫酶和β-葡萄糖苷酶的活性分別較正常土壤低92.54%、79.68%、91.33%、90.65%、97.86%、88.93%（P<0.05），其中2 種土壤的脫氫酶活性降幅最大，且在修復(fù)土壤中脫氫酶的活性最低，而土壤脲酶活性的降幅最小，其他4種酶活性的降幅為88.93%～92.54%，這說明脫氫酶是敏感性的生物指示物，受外界環(huán)境的影響較大。綜上所述，土壤微生物區(qū)系中放線菌屬于敏感性菌群，土壤脫氫酶屬于敏感性酶類，土壤脲酶則屬于脅迫耐受型。

表4 正常土壤和修復(fù)土壤中微生物的數(shù)量的變化Table4 Variations of the microbial numbers in normal soil and remediated soil

表5 正常土壤和修復(fù)土壤土壤酶活性的變化Table 5 Ariations of the soil enzyme activities in normal soil and remediated soil

2.3 修復(fù)土壤中細(xì)菌群落的響應(yīng)效應(yīng)

2.3.1 土壤細(xì)菌Alpha (α)多樣性分析 種植高羊茅60 d 后，熱脫附修復(fù)后的土壤細(xì)菌群落多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)顯著低于正常土壤（P<0.05）。與正常土壤相比修復(fù)后土壤中Shannon 指數(shù)、Sobs 指數(shù)、Ace 指數(shù)和Chao 指數(shù)分別降低39.84%，89.58%，90.61%和89.93%。而Simpson 指數(shù)較正常土壤增加635.85%（P<0.05），這說明修復(fù)土壤的細(xì)菌多樣性明顯降低。2 種土壤中Ace 指數(shù)差異最大，其次是Chao 指數(shù)、Sobs 指數(shù)和Shannon 指數(shù)的差異相對較小，這說明種植高羊茅60 d 熱脫附后的土壤中細(xì)菌豐富度恢復(fù)程度較差，而細(xì)菌群落多樣性的恢復(fù)程度較好，這可能是因為六六六污染土壤經(jīng)過熱脫附修復(fù)后，土壤中的微生物數(shù)量減少，尤其是真菌和放線菌數(shù)量均降為0（表2），而短時間內(nèi)土壤微生物數(shù)量難以恢復(fù)，導(dǎo)致2 種土壤中細(xì)菌豐富度指數(shù)差異較大。2 種土壤Shannon 指數(shù)差異較小可能是因為熱脫附后土壤細(xì)菌數(shù)量有所恢復(fù)（表2），這也間接說明修復(fù)土壤Simpson 指數(shù)較高，因為修復(fù)土壤中只有細(xì)菌恢復(fù)，物種組成較為單一所致。

表6 正常土壤和修復(fù)土壤中細(xì)菌多樣性與豐富度的變化Table 6 Variations of the bacterial diversity index and richness index in normal soil and remediated soil

2.3.2 土壤細(xì)菌Beta (β)多樣性分析 種植高羊茅60 d 后2 種土壤中細(xì)菌OTUs 基于PCA 的β-多樣性分析如圖1A 所示。兩軸的總貢獻(xiàn)率為97.09%，主成分一軸貢獻(xiàn)率為90.20%，主成分二軸貢獻(xiàn)率為6.89%。修復(fù)土壤與正常土壤處理沿PC1 軸分離，處理間細(xì)菌群落物種組成相似，這表明修復(fù)土壤與正常土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著的差異。這個結(jié)果與正常土壤和修復(fù)土壤樣品的聚類分析結(jié)果（圖1B）類似。

圖1 土壤細(xì)菌群落PCA（A）和聚類分析（B）Fig.1 PCA (A) and cluster analysis (B) of soil bacterial community

2.3.3 土壤細(xì)菌群落在門和屬水平的組成特征分析 土壤細(xì)菌群落組成圖見圖2，正常土壤細(xì)菌群落主要的優(yōu)勢菌門（相對豐度>1%）為變形菌門（Proteobacteria）（25.42%）、酸桿菌門（Acidobacteriota）（26.11%）， 放 線 菌 門（Actinobacteriota）（15.10%），綠彎菌門（Chloroflexi）（11.11%）和芽孢桿菌門（Bacteroidota）（7.99%），相對豐度占整個細(xì)菌群落的85.73%，其次分別是芽單胞菌門（Gemmatimonadota）（4.29%）、粘菌門（Myxococcota）（1.45%）、髕骨菌門（Patescibacteria）（1.40%）、浮霉菌門（Planctomycetota）（1.31%）和Latescibacteria（1.10%）。修復(fù)土壤中優(yōu)勢菌門為變形菌門（81.08%）、放線菌門（10.05%）和厚壁菌門（Firmicutes）（6.50%），相對豐度占整個細(xì)菌群落的97.63%。

圖2 正常土壤和修復(fù)土壤中細(xì)菌群落組成（門水平）Fig.2 Composition of bacterial community at phylum level in normal soil and remediated soil

修復(fù)土壤中變形菌門和厚壁菌門的豐度分別比正常土壤顯著增加2.19 倍和11.04 倍（P<0.05），說明修復(fù)后土壤中2 個菌門的細(xì)菌對理化性質(zhì)較差的土壤具有一定耐受能力；而修復(fù)土壤中放線菌門、酸桿菌門、綠彎菌門和芽孢桿菌門相對豐度顯著降低了33.44%、99.93%、99.82%和78.55%（P<0.05），說明修復(fù)土壤環(huán)境可以抑制這4個菌門細(xì)菌的活性，也說明這4 個菌門的細(xì)菌對理化性質(zhì)較差的土壤敏感性較強(qiáng)。

由圖3 可知，正常土壤中細(xì)菌群落主要的優(yōu)勢菌屬（相對豐度>2%）為norank_f__Vicinamibacteraceae菌屬（8.41%）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）（6.97%）、RB41菌 屬（5.58%） 和norank_f__norank_o__Vicinamibacterales菌屬（4.39%），總相對豐富占整個細(xì)菌群落的25.35%。而修復(fù)土壤中優(yōu)勢菌屬為溶桿菌屬（Lysobacter）（18.61%）、副球菌屬（Paracoccus）（8.45%）、氫噬菌屬（Hydrogenophaga）（8.17%）和Ellin6055菌屬（6.28%），總相對豐富占整個細(xì)菌群落的41.51%。

圖3 正常土壤和修復(fù)土壤中細(xì)菌群落組成（屬水平）Fig.3 Composition of bacterial community at genus level in normal soil and remediated soil

修復(fù)土壤中變形菌門的副球菌屬、氫噬菌屬、溶桿菌屬、和Ellin6055菌屬的豐度分別是正常土壤的654 倍、70 倍、12 倍、和8 倍（P<0.05），說明修復(fù)后土壤環(huán)境可以促進(jìn)這些菌屬微生物的活性，也說明其屬于耐受型細(xì)菌；而修復(fù)土壤中norank_f__Vicinamibacteraceae菌 屬、norank_f__norank_o__Vicinamibacterales菌屬和鞘氨醇單胞菌屬相對豐度顯著降低了99.92%、99.94%、97.76%，RB41菌屬相對豐度降為0（P<0.05），說明修復(fù)土壤環(huán)境可以抑制這4 個菌屬微生物的活性，也說明其為敏感性型細(xì)菌。

2.3.4 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子分析 采用冗余分析（RDA）研究種植高羊茅后正常和修復(fù)土壤微生物群落與土壤環(huán)境因子之間的關(guān)系（圖4）。在細(xì)菌群落中，所選取的土壤環(huán)境因子解釋了土壤整個細(xì)菌群落變化的99.43%，分別為97.11%（RDA1）和2.32%（RDA2）（圖4A，4B）。此外，除土壤AP 外，所選取的土壤環(huán)境因子均影響了土壤細(xì)菌群落，其中有機(jī)質(zhì)和脫氫酶顯著影響了不同土壤中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，影響系數(shù)分別為0.992 5 和0.998 1（表7）。

表7 土壤環(huán)境因子對土壤細(xì)菌整個群落的影響系數(shù)Table7 The influence coefficient of soil environmental factors on the whole bacterial communities

圖4 土壤細(xì)菌群落與土壤環(huán)境因子之間關(guān)系的RDA 分析Fig.4 RDA analysis of soil bacterial communities and selected environmental variables

3 討論與結(jié)論

3.1 熱脫附修復(fù)后土壤對高羊茅生長情況的影響

土壤經(jīng)過高溫后顯著改變其基本理化性質(zhì)，研究表明當(dāng)土壤溫度高于500 ℃時，土壤有機(jī)酸的破壞導(dǎo)致pH 值增加，土壤有機(jī)質(zhì)完全燃燒，黏粒和粉粒的比例下降［9］，進(jìn)而降低陽離子交換量［8］。本研究中選擇熱脫附修后的土壤，其工作溫度在500 ～700 ℃，修復(fù)后土壤pH 值增加到9.0 以上，有機(jī)質(zhì)、陽離子交換量和土壤黏粒占比顯著低于正常土壤，說明修復(fù)后土壤理化性狀遭到嚴(yán)重破壞，不利于植物的健康生長。因此經(jīng)過60 d 的生長周期，修復(fù)土壤中高羊茅株高、莖粗、生物量顯著低于正常土壤。這與Vidonish 等［8］研究熱脫附修復(fù)后土壤嚴(yán)重制約植株正常生長的結(jié)論一致，熱脫附后土壤結(jié)構(gòu)改變，質(zhì)量嚴(yán)重退化，土壤保肥保水性能以及養(yǎng)分循環(huán)轉(zhuǎn)化能力較差，勢必會影響植物的正常生長。

3.2 熱脫附修復(fù)后土壤種植高羊茅對土壤微生物量和酶活性的影響

本試驗中修復(fù)土壤經(jīng)過種植高羊茅60 d 后，土壤中微生物量和酶活性顯著低于正常土壤。這說明修復(fù)后土壤理化性質(zhì)的改變，影響了土壤中微生物的數(shù)量和酶活性，進(jìn)而導(dǎo)致土壤速效養(yǎng)分循環(huán)較差［20］，這可能也是造成修復(fù)土壤中植株生長較差的主要原因。這與前人研究結(jié)果一致，土壤經(jīng)過高溫后，土壤中微生物量和酶活性短時間內(nèi)難以恢復(fù)，顯著低于對照［21］。

3.3 熱脫附修復(fù)后土壤種植高羊茅后對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

本研究通過對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，修復(fù)土壤優(yōu)勢菌門主要為變形菌門、放線菌門和厚壁菌門；在屬水平溶桿菌屬、副球菌屬、氫噬菌屬和Ellin6055是優(yōu)勢菌屬，且均屬于變形菌門。已有研究表明變形菌門、放線菌門和副球菌屬對自然界中污染物具有活性降解作用［20-24］，這表明修復(fù)土壤經(jīng)過種植高羊茅后的優(yōu)勢物種中存在能夠降解污染物的細(xì)菌，這與Ceb 等［25］研究結(jié)果相一致，即對多環(huán)芳烴污染的土壤熱脫附修復(fù)后，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過長達(dá)2 年的時間，微生物群落群落組成是以降解多環(huán)芳烴的降解菌為主的。此外，溶桿菌屬是一種新型生防菌，具有很強(qiáng)的溶菌抑菌效果，對多種植物病原真菌、細(xì)菌及線蟲等都具有較好的拮抗活性［26-27］。而本研究中修復(fù)土壤溶桿菌屬相對豐度較高，從微觀角度上說明了修復(fù)土壤通過種植高羊茅后，土壤的微生態(tài)環(huán)境在向好的趨勢發(fā)展。

綜上所述，熱脫附技術(shù)修復(fù)的六六六污染的典型土壤，對土壤理化性質(zhì)和生物學(xué)特性均產(chǎn)生較大負(fù)面影響，并抑制了修復(fù)土壤中高羊茅的生長。雖然修復(fù)土壤中主要土壤酶和細(xì)菌多樣性顯著下降，但是16S 高通量測序技術(shù)則發(fā)現(xiàn)在修復(fù)土壤中存在一些耐受型有益微生物，其生存能力很強(qiáng)且能較快恢復(fù)其活性，有益于改善修復(fù)土壤的生物學(xué)特性，加快其安全利用的進(jìn)程。