劉佳瑋，馮曉微，焦玉蘭,3，孫 艷，靳天雄，馮鳴鵲，劉 蓓，劉明超,2

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071001；2.河北省獸醫(yī)生物技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 保定 071001；3.瑞普(保定)生物藥業(yè)有限公司，河北 保定 071001）

奶牛子宮內(nèi)膜炎是一種嚴(yán)重危害奶牛健康的疾病，對(duì)奶牛養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益影響較大［1］。直接病因是病原微生物的感染，主要有大腸桿菌（Escherichia coli）、鏈球菌、葡萄球菌、棒狀桿菌等［2-3］。這些致病菌容易在奶牛產(chǎn)后侵入子宮，通過(guò)分泌黏附素與子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞緊密結(jié)合并在此大量繁殖，其釋放的毒素和酶類(lèi)物質(zhì)被子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞受體識(shí)別后，會(huì)引起炎癥反應(yīng)。若致病菌未被及時(shí)清除，炎癥則會(huì)持續(xù)發(fā)展，造成上皮細(xì)胞的損傷，物理屏障被破壞，從而導(dǎo)致更多致病菌侵入機(jī)體［4］，引起子宮甚至全身的疾病。臨床上多采用抗生素治療奶牛子宮內(nèi)膜炎，但耐藥菌株的大量出現(xiàn)使得該方法療效甚微，同時(shí)也提高了治療成本，因此迫切需要找到更為有效的治療手段。

益生菌作為抗生素的潛在替代品，可以通過(guò)搶占致病菌的黏附位點(diǎn)［5］、合成抑菌物質(zhì)阻抑病原菌繁殖、調(diào)節(jié)子宮內(nèi)pH 值等［6］手段預(yù)防及治療子宮疾病。乳酸菌是生物體內(nèi)常見(jiàn)的益生菌，有學(xué)者從牛子宮內(nèi)分離得到乳酸菌并將其作用于體外培養(yǎng)的牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)乳酸菌具有免疫調(diào)節(jié)作用［7］。Ametaj 等［8］發(fā)現(xiàn)通過(guò)陰道灌注乳酸菌，奶牛陰道內(nèi)的膿性分泌物減少，產(chǎn)奶量提高。Genís 等［9］的研究證明從奶牛陰道內(nèi)分離得到的乳酸菌可有效降低由大腸桿菌引起的炎癥反應(yīng)，并降低IL-8 和IL-1β mRNA 的表達(dá)，相關(guān)試驗(yàn)表明乳酸菌對(duì)于子宮炎癥的治療效果十分顯著。鼠李糖乳桿菌GR-1（Lactobacillus rhamnosusGR-1）是一種乳酸菌，其具有天然的益生特性，在抑制炎癥發(fā)展方面可以發(fā)揮顯著的作用［10］。然而與炎癥過(guò)程相關(guān)的分子機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，具體通路機(jī)制還不是十分明確。因此探索乳酸菌防治奶牛子宮內(nèi)膜炎的具體通路機(jī)制對(duì)開(kāi)發(fā)新的奶牛子宮內(nèi)膜炎防控和治療手段具有重大意義。

據(jù)報(bào)道，調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶（Mitogenactivated protein kinases，MAPK）信號(hào)通路是治療炎癥疾病的有效方法。因此本研究利用大腸桿菌刺激原代培養(yǎng)的奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞（Bovine endometrial epithelial cells，BEECs）建立奶牛子宮內(nèi)膜炎體外炎性模型，然后利用MAPK 特異性信號(hào)通路抑制劑來(lái)探究L.rhamnosusGR-1 抗奶牛子宮內(nèi)膜炎性損傷的具體分子機(jī)制，為臨床治療奶牛子宮內(nèi)膜炎提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 生物材料

奶牛子宮取自保定某回民屠宰場(chǎng)（未孕），待牛屠宰后，于冰盒上快速帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)操作。

大腸桿菌（O111：K58（B4），CVCC1450）、鼠李糖乳桿菌GR-1（ATCC55826）均由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院臨床營(yíng)養(yǎng)與免疫實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.2 主要試劑

胎牛血清（FBS）購(gòu)自Gemini 公司；DMEM/F12 培 養(yǎng) 基 購(gòu) 自Gibco 公 司；Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，以及SB203580、SP600125、PD98059 等特異性通路抑制劑均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；LB 肉湯培養(yǎng)基、MRS 肉湯培養(yǎng)基均購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；p-JNK1、p-p38、p-ERK1/2 一 抗 均 購(gòu) 自 美 國(guó)CST 公 司，GAPDH 一抗購(gòu)自Proteintech 公司，堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；FastKing-RT SuperMix 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Superreal PreMix Plus 熒光定量預(yù)混試劑盒由天根生化科技有限公司提供；MTT 試劑盒、RIPA 高效細(xì)胞裂解液、TriQuick 總RNA 提取試劑等其它常規(guī)試劑均購(gòu)自索萊寶科技有限公司。

1.3 奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)

按照王仕宇［11］改進(jìn)的組織塊消化貼壁法，取健康未孕奶牛子宮內(nèi)膜組織，加入5 mL 含2%雙抗、40%胰酶的DMEM/F12 培養(yǎng)基，4 ℃消化12 h，再將組織移至25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5% CO2的條件下貼壁培養(yǎng)，獲得原代奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)細(xì)胞培養(yǎng)瓶底的80%～90%時(shí)，去除培養(yǎng)基，加入2 mL PBS 洗2 次，然后再加入900 μL 胰酶消化3 min，顯微鏡觀察細(xì)胞皺縮變圓，輕輕拍打使細(xì)胞懸浮后，加入2 mL 完全培養(yǎng)基終止消化，吸至離心管，1 000 r/min 離心5 min，棄去上清液，加入2 mL 完全培養(yǎng)基重懸并計(jì)數(shù)，按每瓶200 萬(wàn)轉(zhuǎn)移至新細(xì)胞瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖

調(diào)整細(xì)胞濃度至3×105個(gè)/mL，按照100 μL/孔將細(xì)胞接種于96 孔板中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)12、24、36、48、60 和72 h 后，小心吸去上清，加入90 μL 新鮮培養(yǎng)液，再加入10μL MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；吸掉上清，每孔加入110 μL Formazan 溶解液，置搖床上低速振蕩10 min，在酶標(biāo)儀490 nm 處測(cè)量各孔吸光度。

1.5 實(shí)驗(yàn)處理

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞濃度調(diào)整至5×105個(gè)/mL，按照2 mL/孔將細(xì)胞接種于6 孔板中培養(yǎng)24 h，換成無(wú)血清培養(yǎng)基過(guò)夜。本實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)成功建立BEECs 炎性模型［12］，并確立了提前3 h加入作用濃度為5×106CFU/mL 的L.rhamnosusGR-1，再加入作用濃度為5×105CFU/mLE.coli刺激6 h 的炎性模型方案。試驗(yàn)分為4 個(gè)組：對(duì)照組（CONT）、E.coli攻毒組（ECOL）、提前3 h加入L.rhamnosusGR-1 單獨(dú)處理組（LRGR）、提前3 h 加入L.rhamnosusGR-1 預(yù)處理再加入E.coli組（LRGR+ECOL）。特異性通路抑制劑作用濃度為10 μmol/L，隨L.rhamnosusGR-1 一同加入。

1.6 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)到90%，去除培養(yǎng)液，利用PBS洗滌3 遍；吸取780 μL Annexin V-FITC 結(jié)合液到孔板中，再加入20 μL Annexin V-FITC，混勻；加40 μL 碘化丙啶染色液，混勻。然后用錫紙包蓋減少光源照射，室溫避光孵育20 min；在倒置熒光顯微鏡下觀察，Annexin V-FITC 是綠色熒光，碘化丙啶（PI）是紅色熒光，在1 h 內(nèi)完成檢測(cè)。

1.7 Western blot 檢測(cè)p-JNK1、p-p38、p-ERK1/2蛋白的表達(dá)

加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白，通過(guò)BCA 法將蛋白濃度調(diào)整一致；在濃縮膠上依次加入5 μL Marker和20 μL 待測(cè)蛋白；待蛋白跑至分離膠底部，采用濕式轉(zhuǎn)膜法，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜；浸于5%的脫脂牛奶中封閉1 h；加入p-JNK1、p-p38、p-ERK1/2兔源單克隆抗體（1∶1 000），以GAPDH 鼠源單克隆抗體（1∶1 000）為內(nèi)參，4 ℃孵育過(guò)夜；PBST洗膜4 次，每次5 min；加入與一抗對(duì)應(yīng)的羊抗兔IgG/AP 抗體或羊抗鼠IgG/AP 抗體（1∶1 000），37 ℃、180 r/min，1 h；PBST 洗 膜4 次， 每 次5 min；BCIP/NBT 避光顯色；采用image j 軟件進(jìn)行灰度分析。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

使 用TriQuick 試 劑 提 取 總RNA， 使 用FastKing-RT SuperMix 試劑盒合成cDNA。根據(jù)Superreal PreMix Plus 產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，配置反應(yīng)體系，引物（見(jiàn)表1）由天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。采用兩步法，擴(kuò)增條件如下：95 ℃ 15 min 預(yù)變性；95 ℃ 10 s 變性，60 ℃ 30 s 退火延伸反應(yīng)40 個(gè)循環(huán)。使用羅氏LightCycler 480 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 系統(tǒng)（瑞士羅氏公司）檢測(cè)各基因Ct 值，以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-8 mRNA 的相對(duì)表達(dá)。

表1 目的基因引物序列、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度及序列號(hào)Table 1 Target gene primer sequence, amplified fragment length and sequence number

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（One Way ANOVA），用LSD 法進(jìn)行組間多重比較，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，用GraphPad Prism 8 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖。P<0.05 表示差異性顯著，P<0.01 表示差異性極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞形態(tài)觀察和生長(zhǎng)曲線

組織塊培養(yǎng)至第2 天，組織塊周?chē)猩倭考?xì)胞爬出，形態(tài)呈“放射”狀；第8 天細(xì)胞基本長(zhǎng)滿(mǎn)瓶底，大部分呈“鋪路石”狀；純化分離后的奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞可進(jìn)行傳代，與原代細(xì)胞生物學(xué)特征一致。

從奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線可以看出，12 ～24 h 時(shí)間內(nèi)，細(xì)胞生長(zhǎng)速度較為緩慢；24 ～60 h 時(shí)間段內(nèi)，細(xì)胞生長(zhǎng)速度迅速，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；60 ～72 h 時(shí)間段內(nèi)，細(xì)胞生長(zhǎng)速度比較平緩（見(jiàn)圖1），符合正常細(xì)胞增殖特性。

圖1 BEECs 生長(zhǎng)曲線Fig. 1 Growth curve of BEECs

2.2 L. rhamnosus GR-1 對(duì)E. coli 誘導(dǎo)的BEECs凋亡的影響

與對(duì)照組相比，E.coli攻毒組的綠色單染數(shù)量明顯增多，表明E.coli使BEECs 的細(xì)胞膜普遍受損，處于凋亡早期；紅綠雙染數(shù)量也明顯增多，表明此部分細(xì)胞完全喪失細(xì)胞膜的完整性，處于凋亡中晚期或者已經(jīng)壞死。與E.coli攻毒組相比，L.rhamnosusGR-1 預(yù)處理組的綠色單染數(shù)量和紅綠雙染數(shù)量均有所下降；與對(duì)照組相比，L.rhamnosusGR-1 單獨(dú)處理組綠色單染數(shù)量和紅綠雙染數(shù)量沒(méi)有顯著差異（圖2）。

圖2 細(xì)胞凋亡熒光檢測(cè)Fig. 2 Fluorescence detection of apoptosis

每組隨機(jī)選取3 個(gè)視野，記錄綠色單染數(shù)和紅綠雙染數(shù)，計(jì)算得出的細(xì)胞早期凋亡相對(duì)數(shù)、死亡相對(duì)數(shù)（圖3）。與對(duì)照組相比，E.coli攻毒組的早期細(xì)胞凋亡和細(xì)胞死亡數(shù)極顯著增高（P<0.01），L.rhamnosusGR-1 單獨(dú)處理組與L.rhamnosusGR-1預(yù)處理組的細(xì)胞凋亡數(shù)無(wú)顯著差異（P>0.05）；與E.coli攻毒組相比，L.rhamnosusGR-1 預(yù)處理組細(xì)胞凋亡數(shù)、死亡數(shù)均顯著降低（P<0.05），L.rhamnosusGR-1 單獨(dú)處理組細(xì)胞凋亡數(shù)、死亡數(shù)極顯著降低（P<0.01）。這表明E.coli可以損傷BEECs 的膜結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致了細(xì)胞凋亡，而L.rhamnosusGR-1 能夠保護(hù)BEECs，減少E.coli誘導(dǎo)引起的凋亡。

圖3 L. rhamnosus GR-1 對(duì)E. coli 誘導(dǎo)BEECs 凋亡的影響Fig. 3 The effect of L. rhamnosus GR-1 on the apoptosis of BEECs induced by E. coli

2.3 L. rhamnosus GR-1 對(duì)E. coli 誘 導(dǎo) 的BEECs中MAPK 通路的影響

利用Western blot 檢測(cè)BEECs 中p-p38、p-JNK1和p-ERK1/2 蛋白含量（見(jiàn)圖4）。

圖4 L. rhamnosus GR-1 對(duì)E. coli 誘導(dǎo)的BEECs 中MAPK 通路蛋白表達(dá)的影響Fig. 4 L. rhamnosus GR-1 effects on MAPK protein expression in E. coli-induced BEECs

與對(duì)照組相比，E.coli攻毒組p-p38、p-JNK1蛋白水平極顯著升高（P<0.01），p-ERK1/2 蛋白水平極顯著降低（P<0.01）。與E.coli攻毒組相比，L.rhamnosusGR-1 預(yù)處理組中p-p38、p-JNK1 蛋白水平極顯著降低（P<0.01），p-ERK1/2 蛋白水平無(wú)顯著差異（P>0.05）。與對(duì)照組相比，L.rhamnosusGR-1 單獨(dú)處理組中p-JNK1 和p-ERK1/2 蛋白水平降低（P<0.05 或P<0.01），p-p38 蛋白水平無(wú)顯著變化（P>0.05）。表明E.coli可以誘導(dǎo)BEECs 中p38、JNK 通路活化，而L.rhamnosusGR-1 可以抑制E.coli誘導(dǎo)的p38、JNK 通路活化。

2.4 L. rhamnosus GR-1 與MAPK 通路抑制劑對(duì)E. coli 誘導(dǎo)的BEECs 炎性因子的影響

在L.rhamnosusGR-1 預(yù)處理BEECs 3 h 加入E.coli刺激6 h 的基礎(chǔ)上，添加MAPK 特異性通路抑制劑，檢測(cè)細(xì)胞中mRNA 的表達(dá)（圖5）。與對(duì)照組相比較，E.coli攻毒組細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-8 mRNA 表達(dá)均顯著升高（P<0.05），而L.rhamnosusGR-1 單獨(dú)處理組的TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-8 mRNA 表達(dá)量與空白對(duì)照組無(wú)顯著性差異（P>0.05），表明E.coli可以誘導(dǎo)BEECs 產(chǎn)生炎性因子，L.rhamnosusGR-1 不能刺激BEECs 產(chǎn)生炎性因子；與E.coli攻毒組相比較，L.rhamnosusGR-1 單獨(dú)處理組及預(yù)處理組中的TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-8 mRNA 表 達(dá) 顯 著 降低（P<0.05）, 表明L.rhamnosusGR-1 可以調(diào)節(jié)E.coli誘導(dǎo)的BEECs 中炎性因子的表達(dá)；在添加p38 抑制劑SB203580 和JNK 抑制劑SP600125 后均能引起E.coli攻毒組和L.rhamnosusGR-1 預(yù)處理組TNF-α、IL-1β 和IL-6 mRNA 表達(dá)水平的顯著下降（P<0.05），添加ERK 抑制劑PD98059 后與添加前相比普遍沒(méi)有顯著性差異（P>0.05）。這些結(jié)果表明，抑制p38 與JNK 通路可以調(diào)節(jié)炎性因子的表達(dá)，而結(jié)合前文中L.rhamnosusGR-1 可以顯著抑制E.coli活化JNK、p38 通路的結(jié)論，可以得出由E.coli引起的BEECs 炎性反應(yīng)與MAPK信號(hào)通路的活化密切相關(guān)，L.rhamnosusGR-1 對(duì)炎性因子的調(diào)控作用是來(lái)自于對(duì)JNK 與p38 信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。

圖5 L. rhamnosus GR-1 和MAPK 通路抑制劑（SB203580、SP600125、PD98059）對(duì)E. coli 誘導(dǎo)的BEECs 中炎性因子mRNA 表達(dá)的影響Fig. 5 L. rhamnosus GR-1 and MAPK pathway inhibitors (SB203580, SP600125, PD98059)effects on the expression of inflammatory factors mRNA in E. coli-induced BEECs

3 討論與結(jié)論

本研究選取的益生菌菌株為L(zhǎng).rhamnosusGR-1，由于具有免疫活性調(diào)節(jié)的特點(diǎn)而備受關(guān)注。Yang 等［13］發(fā)現(xiàn)L.rhamnosusGR-1 的上清液可以緩解LPS 引起的炎癥和孕鼠流產(chǎn)。Otero 等［14］從健康奶牛生殖道內(nèi)成功分離到了多株乳酸菌，并且大部分菌株可抑制奶牛子宮內(nèi)膜炎致病菌的生長(zhǎng)，經(jīng)鑒定，這些乳酸菌菌株中就包括鼠李糖乳桿菌。由此可以看出L.rhamnosusGR-1 對(duì)致病菌具有一定的抑制作用，但其具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)乳酸菌L.rhamnosusGG 可以抑制腸上皮細(xì)胞的凋亡［15］，Liu 等［16］應(yīng)用E.coli誘導(dǎo)BEECs 構(gòu)建炎性模型，發(fā)現(xiàn)加入L.rhamnosusGR-1 共培養(yǎng)后可以減輕E.coli對(duì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的損傷，表明L.rhamnosusGR-1 對(duì)上皮細(xì)胞具有保護(hù)作用。本研究中，E.coli誘導(dǎo)BEECs 膜結(jié)構(gòu)的損傷導(dǎo)致了細(xì)胞凋亡的發(fā)生，L.rhamnosusGR-1 能夠抑制E.coli誘導(dǎo)的BEECs 的凋亡，進(jìn)一步證明了L.rhamnosusGR-1 對(duì)BEECs 的保護(hù)作用。

Toll 樣 受 體（Toll like receptor，TLR） 可 特異性識(shí)別病原微生物，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。TLR4 是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的Toll 樣受體。當(dāng)TLR4 信號(hào)通路激活，將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)，隨后與髓樣分化因子88（Myeloid differentiation factor 88，MyD88）結(jié)合，進(jìn)而啟動(dòng)下游核轉(zhuǎn)錄因子κB（Nuclear factor-κB，NF-κB）及MAPK 等信號(hào)通路。其中MAPK 主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的通路，在上皮細(xì)胞的免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是調(diào)控炎癥過(guò)程的關(guān)鍵因子。MAPK 中3 條重要信號(hào)途徑為氨基末端激酶（JNK）、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）和p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）。其中ERK 主要介導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化，JNK 主要介導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)激，p38 主要介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。Cronin 等［17］利用LPS 刺激奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞發(fā)現(xiàn)MAPK 通路快速磷酸化。Qiao 等［18］發(fā)現(xiàn)唾液乳桿菌可以調(diào)節(jié)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌誘導(dǎo)的豬腸道上皮細(xì)胞中MAPK 信號(hào)通路的表達(dá)。本試驗(yàn)結(jié)果表明L.rhamnosusGR-1 可以抑制E.coli誘導(dǎo)JNK、p38 通路的活化。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，在本研究中，E.coli未能激活ERK 通路，與對(duì)照組相比，E.coli攻毒組顯著下降，這表明E.coli可以抑制BEECs 中ERK 通路，而L.rhamnosusGR-1未能調(diào)控E.coli對(duì)ERK 的抑制作用，這一結(jié)論與Qiao［18］在唾液乳桿菌抗ETECK88 誘導(dǎo)的IPEC-J2細(xì)胞炎癥模型中第6 小時(shí)的試驗(yàn)結(jié)果一致。

近年來(lái)，在奶牛子宮疾病的相關(guān)研究中，越來(lái)越多的研究表明，MAPK 信號(hào)通路是調(diào)控炎性反應(yīng)的潛在靶點(diǎn)［19-20］。本研究發(fā)現(xiàn)E.coli會(huì)顯著增加BEECs 內(nèi)炎性因子的表達(dá)，L.rhamnosusGR-1可顯著降低E.coli誘導(dǎo)的BEECs 中炎性因子的表達(dá)水平，這些結(jié)果證實(shí)了L.rhamnosusGR-1 可通過(guò)調(diào)節(jié)炎性因子減少E.coli對(duì)BEECs 的損傷。為進(jìn)一步探索MAPK 通路對(duì)促炎細(xì)胞因子下調(diào)的影響，本研究使用了MAPK 特異性信號(hào)通路抑制劑SB203580、SP600125 和PD98059， 特 異 性 信號(hào)通路抑制劑可以通透細(xì)胞，高選擇性的抑制目的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，常被用于信號(hào)途徑的研究。郭詠梅［21］發(fā)現(xiàn)SB203580、SP600125 可以抑制奶牛乳腺上皮細(xì)胞中MAPK 信號(hào)通路下游因子IL-1 的表達(dá),進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞免受一氧化氮蓄積的損傷。Qiao［18］發(fā)現(xiàn)SB203580 的存在可以降低ETEC K88 誘導(dǎo)的IPEC-J2 細(xì)胞IL-1β、IL-8 和TNF-α 的表達(dá)水平。本研究發(fā)現(xiàn)SB203580、SP600125 可以顯著抑制E.coli誘導(dǎo)的BEECs 中炎性因子的表達(dá)。以上結(jié)果進(jìn)一步證明了抑制p38 和JNK 信號(hào)通路是治療炎癥的有效手段。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，L.rhamnosusGR-1 可通過(guò)抑制MAPK 下游的p38 和JNK 信號(hào)通路抑制E.coli誘導(dǎo)的BEECs 中TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-8 的表達(dá)而發(fā)揮抗炎作用，減少E.coli造成的損傷，為今后治療奶牛子宮內(nèi)膜炎提供了新的路徑。