張新星，李睿琦，伊章華，徐一碩，高志嶺

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 / 河北省農(nóng)田生態(tài)環(huán)境重點實驗室，河北 保定 071000）

氮素是作物生長發(fā)育所需的重要營養(yǎng)元素，合理施用氮肥是作物高產(chǎn)的關(guān)鍵措施［1-2］。然而，目前我國農(nóng)田氮肥利用率普遍較低，施入農(nóng)田的氮肥約有40%～50%通過各種途徑流失［3］。在氮素循環(huán)轉(zhuǎn)化過程中，氨揮發(fā)、硝酸鹽的淋洗、硝化和反硝化過程是土壤氮素損失的主要途徑。土壤反硝化在不同的土壤環(huán)境中可導(dǎo)致25%～90%的氮肥損失［4-5］。反硝化作用不僅會降低氮肥的利用效率，同時產(chǎn)生的氮氧化物對環(huán)境也有嚴重的負面影響。

目前關(guān)于土壤氮素循環(huán)抑制劑的研究也主要集中在硝化和礦化這兩個過程［6-9］。常見的土壤氮素循環(huán)抑制劑主要為化學(xué)合成抑制劑［8-11］，化學(xué)合成抑制劑可有效的抑制土壤氮素的轉(zhuǎn)化，有些化學(xué)抑制劑還能提高作物的氮素利用率及產(chǎn)量。但是化學(xué)合成抑制劑因其成本高，生物穩(wěn)定性有限等原因，在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用并不廣泛［12］。

近年來，隨著對植物—微生物—土壤氮循環(huán)互作研究的深入，發(fā)現(xiàn)植物次生代謝產(chǎn)物中存在抑制土壤硝化及反硝化過程的物質(zhì)，并將其命名為生物硝化抑制劑（BNI）及生物反硝化抑制劑（BDI［13-14］。與化學(xué)抑制劑相比，生物抑制劑是植物自身產(chǎn)生的，具有易獲得、成本低、作用時間長且對生態(tài)環(huán)境友好等特點。植物次生代謝產(chǎn)物通過根系分泌及組織凋落腐解等方式進入土壤，除了可以為根際土壤微生物提供氮源、碳源外，還具有介導(dǎo)植物對礦質(zhì)元素吸收利用以及幫助植物適應(yīng)外界環(huán)境變化的作用［15-17］。目前已明確臂形草根系分泌的Brachialactone［18］、高粱根系分泌的高粱醌和對羥基苯丙酸甲酯［19］、水稻根系分泌的1,9-葵二醇及卡蘭賈樹根系分泌的水黃皮素可以通過抑制氨單加氧酶(AMO)、羥胺還原酶(HAO)途徑或單獨抑制AMO途徑來抑制土壤硝化作用；Bardon 等［14,20-21］從Fallopia spp.根系提取物中發(fā)現(xiàn)B 型原花青素（PC）可以通過誘導(dǎo)酶的構(gòu)象變化，特異性的抑制與膜結(jié)合的硝酸還原酶活性，并在之后的研究中發(fā)現(xiàn)［22-23］，PC 可以特異性的抑制土壤反硝化細菌活性，而不影響土壤細菌的總豐度。

生物硝化/反硝化抑制劑的形成及釋放受植物種類、環(huán)境等多因素的影響，目前關(guān)于植物分泌硝化/反硝化抑制劑是否具有普遍性還未知，本研究選擇我國大宗蔬菜—黃瓜為研究對象，通過室內(nèi)培養(yǎng)試驗，旨在明確黃瓜根系代謝產(chǎn)物中是否具有潛在的生物反硝化作用抑制物。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試黃瓜品種：‘津優(yōu)35 號’，氮素利用高效型品種，購于天津科潤農(nóng)業(yè)科技股份有限公司。

供試反硝化模式菌株：缺乏N2O 還原酶的銅綠假單胞菌（ATCC13985，Pseudomonas aureofaciens購自美國農(nóng)業(yè)部菌種保存中心）

1.2 溶液的配置

黃瓜山崎營養(yǎng)液：四水合硝酸鈣0.95 g/L，硝酸鉀0.81 g/L，七水合硫酸鎂0.5 g/L，磷酸二氫銨0.155 g/L，硼酸0.003 g/L，七水合硫酸鋅0.002 g/L，五水合硫酸鈣5×10-5g/L，pH=6.5

LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L。

反硝化DM 培養(yǎng)基［24］：硝酸鉀0.72 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L，七水硫酸鎂0.2 g/L，六水丁二酸二鈉2.8 g/L，pH 7.0。

1.3 黃瓜種子的催芽及種植

挑選籽粒飽滿的黃瓜種子，于溫水中浸泡3 ～5 h后將種子置于鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，放入人工氣候箱，恒溫(25±1) ℃黑暗培養(yǎng)，發(fā)芽后轉(zhuǎn)移到滅菌石英砂中定植，培養(yǎng)條件為白天22 ℃(14 h)，晚上18 ℃(10 h)，每隔4 d 澆1 次營養(yǎng)液。

1.4 根系代謝物質(zhì)的提取

1.4.1 根系分泌物的提取 取定植后生長30 d 的黃瓜幼苗，滅菌的去離子水洗凈根系后置于錫紙包裹的盛有無菌水的三角瓶中，光照條件下連續(xù)收集根系分泌物8 h。收集的水溶液過0.22 μm 濾膜真空抽濾后置于超低溫冰箱(-86 ℃)冷凍12 h，冷凍干燥機凍干。

稱取50 mg 根系分泌物凍干粉溶解于50 mL 色譜純的甲醇中，超聲提取30 min 后4℃環(huán)境下12 000 r/s離心10 min，收集上清液；上清液42℃旋蒸至干后，50 mL 的無菌水復(fù)溶，超聲提取30 min 后再次離心，將上清液與水不溶組分分開。未溶解組分冷凍干燥后用5 mL 甲醇復(fù)溶，得到非水溶性組分。上清液用3 倍體積的二氯甲烷進行超聲波提取，分離出二氯甲烷層，30 ℃旋蒸至干，不溶物復(fù)溶于5 mL 液相色譜純甲醇中，得到根系分泌物的中性組分；用1 mol/L 的HCl 將上清液pH 值調(diào)為2，相同方法進行提取，得到根系分泌物的酸性性組分。試驗前，取5 mL 樣品，旋轉(zhuǎn)蒸至干后，5 mL 二氯甲烷復(fù)溶，備用。

1.4.2 根系提取物的提取 取定植后生長30 d 的黃瓜幼苗，使用前用滅菌的去離子水將根系洗凈，錫紙包裹置于液氮中速凍，后進行冷凍干燥。稱取5 g凍干后的根在珠磨機中粉碎，溶解于50 mL 水∶甲醇(50∶50，v/v)中進行30 min 的超聲提取，之后對提取液進行真空抽濾，50 mL 純甲醇對殘渣重復(fù)進行兩次提取，將所有提取液收集到一起并干燥濃縮。使用前，將干燥后的樣品重新懸浮于水∶甲醇(50∶50，v/v)中，0.22μm 濾器過濾，得到10 mg/mL 提取物。

1.5 試驗方案

1.5.1 細菌培養(yǎng) 將甘油瓶中的銅綠假單胞菌接種于滅菌的LB 肉湯培養(yǎng)基中，28 ℃下培養(yǎng)過夜，將處于指數(shù)生長期的細菌進行離心收集菌體處理后，置于0.9%的NaCl 水溶液中重復(fù)洗滌3 次，之后復(fù)溶于50 mL 0.9%的NaCl 水溶液饑餓培養(yǎng)2 h。培養(yǎng)結(jié)束后離心，用反硝化DM 培養(yǎng)基復(fù)溶菌體并調(diào)整OD600為0.05，備用。

1.5.2 根系分泌物對銅綠假單胞菌代謝活性的影響由于根系分泌物的數(shù)量有限，該試驗在含有氧化還原染料氯化四唑的Biology MT2 96 孔板中進行，通過氧化還原染料變色程度判斷細菌厭氧呼吸代謝活性強度。取97 μL 菌液加入96 孔板中，并以2.5%的添加量將不同濃度的根系分泌物添加到96 孔板中，各處理根系分泌物的最終濃度分別為0.015、0.075、0.15、0.3 mg/mL，為創(chuàng)造反硝化過程發(fā)生的厭氧環(huán)境，最后在每孔中加入60 μL 礦物油覆蓋。將MT2 平板置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)12 h 后每隔3 h 用酶標儀(590 nm)測定1 次代謝活性。

1.5.3 根系提取物對細菌反硝化過程的影響 設(shè)置根系提取物的濃度分別為0、0.005、0.02、0.1、0.25、0.5 mg/mL，將菌液及根系提取物溶液加入250 mL 帶有橡膠塞密閉的滅菌血清中，瓶中空氣用氮氣代替，瓶內(nèi)最終細菌OD600值為0.05，總體積為10 mL。培養(yǎng)開始前18 h，每間隔6 h 測定1 次氧化亞氮濃度，之后每隔12 h 測定1 次，連續(xù)測定66 h。最后一次氣體采樣后測定菌液中NO-N、NO-N 含量及OD600數(shù)值。N2O 采用氣象色譜儀(Agilent6820)進行測定，檢測器為ECD，檢測溫度為330 ℃；NO-N 和NO-N 使用化學(xué)分析儀（SmartChem200）進行測定；細菌OD600值采用酶標儀進行測定。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Microsoft Excel 2016、SPSS 22.0 及origin 2018 進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 根系分泌物對反硝化細菌厭氧代謝活性的影響

前期研究表明，細菌接種后會有一個遲滯期，10 ～12 h 后銅綠假單胞菌進入對數(shù)生長期，因此本研究選取在培養(yǎng)的12 h 開始進行厭氧代謝活性的測定（圖1）。

圖1 不同組分根系分泌物對銅綠假單胞菌厭氧代謝活性的影響Fig. 1 Effects of different components of root exudates on anaerobic metabolic activity of Pseudomonas aeruginosa

由圖1 可知，隨著培養(yǎng)的進行，銅綠假單胞菌代謝活性增強，與未添加根系分泌物的空白處理相比，各處理在12 h 測定開始時均表現(xiàn)出不同程度的抑制效果。酸性組分添加量為0.075 及0.15 mg/L 的處理在培養(yǎng)12 h 時與空白對照相比，顯著抑制了銅綠假單胞菌的代謝，抑制率分別為21.4%、21.1%；15 h 時0.075 mg/L 處理的抑制效果達到最大22.1%，其余處理與空白對照相比未表現(xiàn)出顯著差異 （圖1d）。中性組分中0.075 mg/L 的處理在培養(yǎng)的12 ～21 h內(nèi)表現(xiàn)出持續(xù)的顯著抑制效果，抑制效率分別為24.51%、27.59%、22.21%及19.46%；培養(yǎng)至24 h 時，0.015 mg/L 處理表現(xiàn)出顯著的抑制效果（圖1e）。非水溶組分中，0.3 mg/L 處理在整個培養(yǎng)期間均表現(xiàn)出顯著的抑制效果，且隨著培養(yǎng)時間的增加，抑制效果逐漸降低，各時期的抑制效率分別為25.75%、26.65%、21.31%、14.47%及9.1%；0.075 mg/L 處理在24 h 表現(xiàn)出顯著的抑制效果（圖1f）。

2.2 根系提取物對銅綠假單胞菌反硝化過程的影響

2.2.1 對細菌OD 值的影響 細菌OD600的高低直接反映了細菌量的多少，由圖2 可知，在適宜的培養(yǎng)條件下，與空白對照相比，根系提取物的添加量分別為0.005、0.02、0.1 及0.25 mg/L 的處理在培養(yǎng)結(jié)束時細菌的OD600值無顯著變化，當(dāng)根系分泌物的添加量為0.5 mg/L 時，顯著促進了銅綠假單胞菌的生長。

圖2 根系提取物對細菌生長的影響Fig. 2 Effect of root extract on bacterial growth

2.2.2 對氧化亞氮排放的影響 圖3 為根系提取物的添加對N2O 排放量的影響。與細菌的生長曲線一致，在0 ～12 h 內(nèi)氣體的累積排放量增長緩慢，12 ～42 h 進入細菌對數(shù)生長期，此時細菌生長旺盛，氣體排放量大幅增加，42 h 氣體累積排放量趨于穩(wěn)定。與之相對的排放速率，在0 ～12 h 內(nèi)快速增加，12 ～30 h 漲幅降低，30 ～66 h 之后逐漸降低趨近于0。隨著培養(yǎng)時間的增加，各處理間氣體累積排放量的差異逐漸擴大，18 h 之后，添加根系提取物的處理N2O 的累積排放量均顯著高于空白對照處理，培養(yǎng)結(jié)束時，各處理N2O 累積排放量分別為對照處理的1.27、1.30、2.74 及2.77 倍，說明根系提取物的添加促進了N2O 的生成。

圖3 根系提取物對N2O-N 排放的影響Fig. 3 Effect of root extract on N2O cumulative emission

圖4 根系提取物對硝態(tài)氮及亞硝態(tài)氮含量的影響Fig. 4 Effects of root extracts on nitrate and nitrite contents

2.2.4 相關(guān)性分析 對添加提取物的量及測定的各指標進行相關(guān)性分析，結(jié)果如表1 所示。根系分泌物的添加量與N2O 累積排放量及細菌OD600值分別達到了顯著和極顯著正向強相關(guān)；與NO-N及NO-N 的含量均達到了極顯著負向強相關(guān)。除OD600與N2O 累積排放量之間無顯著相關(guān)性外，其余各指標間均呈顯著或極顯著的相關(guān)關(guān)系。

表1 指標間相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis between indicators

3 討論

大量研究表明，植物次級代謝產(chǎn)物中含有豐富的糖類、氨基酸、維生素等可作為微生物生長所需的碳源及氮源，刺激其生長及代謝活性的增強［25-27］，除此之外植物次級代謝產(chǎn)物中某些特殊物質(zhì)對土壤微生物或土壤養(yǎng)分循環(huán)具有特定的功能，例如單寧類物質(zhì)可通過絡(luò)合有機氮及土壤胞外酶的作用從而延緩有機氮的礦化，原花青素通過誘導(dǎo)酶的構(gòu)象變化，特異性的抑制與膜結(jié)合的硝酸還原酶活性，從而延緩反硝化過程的發(fā)生等。植物次生代謝產(chǎn)物中包含物質(zhì)種類繁多［15］，提取及純化方法的不同會影響最終提取物中物質(zhì)含量及組成［28-29］，并且根系分泌物及提取物為混合物，發(fā)生作用的不是單一組分效應(yīng)，而是各個組分間相互作用的綜合［24］，這與本研究中在相同培養(yǎng)條件下，添加不同組分及不同量的黃瓜次級代謝產(chǎn)物均對銅綠假單胞菌的反硝化能力影響具有差異的結(jié)果相一致。本研究結(jié)果表明黃瓜根系分泌物的酸性、中性及非水溶性組分對銅綠假單胞菌的厭氧代謝活性均表現(xiàn)出不同程度的抑制，說明在提取的混合組分中可能具有潛在生物反硝化抑制物質(zhì)的存在。合格的生物硝化/反硝化抑制劑可以特異性的抑制參與硝化及反硝化過程的酶的活性，而不影響微生物的組成及數(shù)量，由于本研究中只測定了反硝化細菌的厭氧代謝強度，并不能確定該抑制作用是通過抑制了細菌生長還是厭氧代謝酶活發(fā)生的，因此需要進一步的試驗進行確定。本研究中，根系提取物添加量與培養(yǎng)結(jié)束時N2O 累積排放量、NO-N 含量、NO-N 含量及表征細菌數(shù)量的OD600間均達到了顯著或極顯著強相關(guān)，而OD600與N2O 累積排放量之間無顯著的相關(guān)關(guān)系，說明根系提取物的添加量在0.005 ～0.25 mg/L 時顯著促進了反硝化細菌的厭氧呼吸及反硝化過程的發(fā)生，并沒促進微生物的生長，當(dāng)根系提取物添加量為0.5 mg/L 時，顯著促進了細菌的生長。在本研究中所采取的根系提取物處理方法下，未觀察到反硝化抑制現(xiàn)象的發(fā)生。

4 結(jié)論

本研究以‘津優(yōu)35 號’黃瓜根系分泌物及提取物為研究對象進行室內(nèi)細菌純培養(yǎng)試驗，結(jié)果如下：

（1）根系分泌物的不同組分均表現(xiàn)出了不同程度的反硝化抑制能力，中性及非水溶性組分抑制效果較強，且持續(xù)時間久，最高抑制效率均出現(xiàn)在培養(yǎng)的第15 h，分別為27.59 %及26.65 %，黃瓜根系分泌物中可能存在潛在的生物反硝化抑制劑；

（2）低濃度根系提取物在不影響細菌生長的前提下顯著促進了反硝化過程的進行，高濃度根系提取物既刺激了細菌的生長同時促進了反硝化過程的進行；在本研究所采取的提取方法下，未觀察到根系提取物中潛在生物反硝化抑制劑存在的證據(jù)。