曾啟城 隋曉露 許云鵬 張艾莎 謝婷妃 袁樹(shù)珍 鄒杰鋒 李麗香 徐子斌 陳繼紅

廣東醫(yī)科大學(xué)深圳寶安臨床醫(yī)學(xué)院 深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院腎內(nèi)科，廣東省深圳市 518000

糖尿病腎病(DN)的發(fā)病機(jī)制包括遺傳因素、糖脂代謝紊亂、血流動(dòng)力學(xué)改變、炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激。足細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能改變是糖尿病腎病蛋白尿和腎小球硬化重要病理基礎(chǔ)，是糖尿病腎病進(jìn)展核心事件。表觀遺傳修飾作為連接高血糖“代謝記憶”與糖尿病腎病的“紐帶”而備受關(guān)注。組蛋白甲基化是表觀遺傳修飾的重要方式，受組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去甲基化酶調(diào)控。組蛋白H3K27me3是一個(gè)抑制基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵介質(zhì)；組蛋白去甲基化酶通過(guò)減少其靶基因啟動(dòng)子區(qū)域H3K27me3水平，解除對(duì)基因的抑制進(jìn)而增強(qiáng)基因表達(dá)[1]。有研究表明，在糖尿病嚙齒動(dòng)物模型的腎臟中，組蛋白H3K27me3表達(dá)下調(diào)與糖尿病腎病的病理基因相關(guān)[2]。H3K27me3具體作用機(jī)制尚不清楚，對(duì)恢復(fù)H3K27me3表達(dá)水平是否與延緩糖尿病腎病進(jìn)展有關(guān)，目前相關(guān)報(bào)道較少。GSK-J4通過(guò)選擇性抑制Jmjd3和UTX，減弱其特異性去掉賴氨酸三甲基化修飾[3]。本研究選用自發(fā)性2型糖尿病db/db小鼠，給予GSK-J4，抑制組蛋白去甲基化酶活性，旨在了解H3K27me3是否通過(guò)調(diào)節(jié)Nephrin和Podocin表達(dá)，減輕足細(xì)胞損傷，延緩糖尿病腎病進(jìn)展。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 選用6周齡自發(fā)性2型糖尿病db/db小鼠40只、db/m小鼠20只，均購(gòu)自美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室。SPF級(jí)動(dòng)物房恒溫環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)2周，實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水過(guò)夜，經(jīng)尾靜脈采血，用血糖儀測(cè)定小鼠的血糖值≥16.7 mmol/L，符合糖尿病小鼠標(biāo)準(zhǔn)后實(shí)驗(yàn)。將db/db小鼠40只隨機(jī)分為GSK-J4干預(yù)組(G組，n=20)、糖尿病腎病組(D組，n=20)，將db/m小鼠作為對(duì)照組(N組，n=20)。

1.2 分組處理及標(biāo)本收集 G組予組蛋白去甲基化酶抑制劑GSK-J4(購(gòu)自MedChemExpress公司) 10mg/kg劑量尾靜脈注射處理，N組、D組給予等體積PBS溶液通過(guò)尾靜脈注射。頻率：每3周注射1次(分別在第1周、第4周、第7周注射)，共干預(yù)10周。其余時(shí)間每天觀察小鼠狀態(tài)。在第10周前1d把小鼠放入代謝籠，禁食不禁水過(guò)夜。收集24h尿液保存于-80℃冰箱待測(cè)尿蛋白含量。取血并進(jìn)行離心取血漿，凍存于-80℃冰箱待測(cè)血糖、血肌酐、尿素氮。分離雙腎置于冰上，取8mm3大小腎組織置于10%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋、切片，其余腎組織置液氮中冷凍后以-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1一般指標(biāo)：采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血糖(Glu)、24h尿蛋白(24hUTP)、血肌酐(CR)、尿素氮(BUN)。

1.3.2 腎組織H3K27me3表達(dá)：石蠟切片經(jīng)脫蠟，抗原修復(fù)，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，山羊血清封閉后。滴加1∶50稀釋的小鼠抗H3K27me3抗體(購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司)，4℃孵育過(guò)夜;次日室溫復(fù)溫1h，PBS沖洗5min×3次。滴加適量辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗工作液，室溫孵育2h;PBS沖洗5min×3次。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑顯色5min，蘇木素襯染，蒸餾水浸洗玻片3遍，經(jīng)梯度酒精和二甲苯脫水透明，晾干覆蓋蓋玻片。

1.3.3 腎組織足細(xì)胞Nephrin和Podocin表達(dá)：新鮮腎組織固定、脫水、OCT包埋，8～10μm切片，烤片，置于4%多聚甲醛固定30min，于PBS(pH 7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3 次，5min/次。經(jīng)抗原修復(fù)，滴加BSA封閉液封閉30min。滴加一抗(1∶25 Nephrin antibody、Podocin antibody，均購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司)，于濕盒內(nèi)4℃孵育過(guò)夜；滴加生物素化通用型二抗工作液避光室溫孵育50min。DAPI染液復(fù)染細(xì)胞核，在圈內(nèi)加入自發(fā)熒光淬滅劑5min，流水沖洗10min。封片后激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察腎組織足細(xì)胞Nephrin和Podocin表達(dá)。

1.3.4 腎臟病理學(xué)檢查：取左腎組織用10%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片，行HE染色，顯微鏡(型號(hào)：Leica EG11504)下觀察。

1.3.5 腎組織足細(xì)胞凋亡程度：取腎組織石蠟包埋，切片，脫蠟，水洗，用組化筆在組織周圍畫圈，滴加蛋白酶K工作液修復(fù)，滴加破膜工作液覆蓋組織，取TUNEL試劑盒(購(gòu)自瑞士Roche公司)內(nèi)試劑加到圈內(nèi)覆蓋組織，山羊血清室溫孵育30min，切片放入3%雙氧水溶液，室溫避光孵育15min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染3min，脫水封片。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS Statistics 19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理所得數(shù)據(jù)，數(shù)值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般指標(biāo) db/m小鼠精神狀態(tài)良好，血糖未見(jiàn)明顯變化，db/db小鼠隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)行逐漸出現(xiàn)多飲、多食、多尿、肥胖等癥狀。與N組相比，D組血糖、24h尿蛋白定量、尿素氮、血肌酐水平增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與D組相比，G組血糖高、24h尿蛋白定量、尿素氮、血肌酐水平減低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組一般指標(biāo)比較

2.2 腎組織H3K27me3表達(dá) 與N組相比，D組腎組織組蛋白H3K27me3表達(dá)減少。與D組相比，G組腎組織組蛋白H3K27me3表達(dá)增多，見(jiàn)圖1。免疫組化熒光圖片平均光密度分析顯示，D組Nephrin蛋白較N組表達(dá)下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；G組Nephrin蛋白表達(dá)量較D組表達(dá)增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

圖1 腎組織足細(xì)胞H3K27me3表達(dá)

圖2 腎組織足細(xì)胞H3K27me3表達(dá)平均光密度分析 與N組比較，#P<0.05；與D組比較，*P<0.05

2.3 腎組織足細(xì)胞Nephrin和Podocin表達(dá) 雙重免疫熒光染色及激光共聚焦結(jié)果顯示，與N組相比，D組腎組織足細(xì)胞Nephrin和Podocin表達(dá)減少。與糖尿病腎病相比，G組腎組織足細(xì)胞Nephrin和Podocin表達(dá)增多，見(jiàn)圖3。

2.4 各組小鼠腎組織病理學(xué)改變 腎組織光鏡表現(xiàn)；HE染色：與N組相比，D組有腎小球體積增大，毛細(xì)血管襻擴(kuò)張，腎小球系膜細(xì)胞增生，系膜區(qū)基質(zhì)增多、增寬，基底膜增厚，腎小管上皮細(xì)胞肥大、空泡變性，管腔變窄等腎臟病理改變。與D組相比，G組腎小球體積較小，毛細(xì)血管襻擴(kuò)張，腎小球系膜細(xì)胞增生，系膜區(qū)基質(zhì)增多、增寬，基底膜增厚，腎小管上皮細(xì)胞肥大、空泡變性，管腔變窄等腎臟病理改變較輕，見(jiàn)圖4。

2.5 足細(xì)胞凋亡程度 與N組相比，D組足細(xì)胞凋亡程度升高。與D組相比，G組足細(xì)胞凋亡程度減輕，見(jiàn)圖5。

3 討論

糖尿病腎病早期就會(huì)出現(xiàn)足細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)的損傷,進(jìn)而引起足細(xì)胞凋亡及脫落。高糖是導(dǎo)致足細(xì)胞損傷的重要因素。在高糖刺激下，細(xì)胞會(huì)生成大量晚期糖基化終末產(chǎn)物，并在細(xì)胞內(nèi)部不斷聚積。 在晚期糖基化終末產(chǎn)物產(chǎn)生過(guò)程中，線粒體還會(huì)釋放大量的活性氧類，過(guò)量的活性氧類打破機(jī)體氧化體系與抗氧化體系的平衡，損傷細(xì)胞。氧化應(yīng)激可直接損傷細(xì)胞，誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致腎小球的硬化和腎功能損傷，是糖尿病腎病進(jìn)展的核心事件。

Nephrin是一種跨膜蛋白，只表達(dá)在腎臟足細(xì)胞上。Podocin特異性表達(dá)于足細(xì)胞的足突膜上，促進(jìn)Nephri的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。Nephrin和Podocin等裂孔隔膜相關(guān)蛋白分子在足突間構(gòu)成拉鏈樣結(jié)構(gòu)，共同維持足細(xì)胞足突的完整性及裂孔膜的正常功能。足細(xì)胞數(shù)量、結(jié)構(gòu)或功能完整性與蛋白尿的產(chǎn)生存在相關(guān)性[4]。

圖3 腎組織足細(xì)胞Nephrin和Podocin表達(dá)

圖4 各組腎臟組織病理學(xué)表現(xiàn)

圖5 腎組織足細(xì)胞凋亡

表觀遺傳修飾是指非基因序列改變所致基因表達(dá)水平的變化，可直接影響靶基因，改變疾病表型，作為對(duì)環(huán)境信號(hào)和病理狀態(tài)的應(yīng)答。表觀遺傳學(xué)修飾調(diào)控靶器官細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程，導(dǎo)致炎性反應(yīng)基因及多個(gè)相關(guān)信號(hào)通路活化。表觀遺傳修飾的失調(diào)，包括染色質(zhì)組蛋白修飾和 DNA甲基化，在參與腎病發(fā)病機(jī)制的基因的表達(dá)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[5]。“代謝記憶模型實(shí)驗(yàn)”表明即使短期暴露于高葡萄糖也會(huì)導(dǎo)致NF-κBp65亞基、炎癥基因和氧化應(yīng)激的表達(dá)持續(xù)增加，即使恢復(fù)到正常的葡萄糖水平后仍然持續(xù)存在[6]。這可能是表觀遺傳學(xué)修飾模式發(fā)生了改變，表觀遺傳修飾調(diào)節(jié)了腎臟基因的表達(dá)。

組蛋白甲基化作為表觀遺傳修飾的重要途徑，參與基因的表達(dá)調(diào)控、基因印記和X染色體失活，調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育、細(xì)胞增生和分化，與細(xì)胞衰老以及腫瘤發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系。組蛋白甲基化與基因激活或抑制相關(guān)，這取決于修飾的氨基酸殘基和甲基化的程度。組蛋白H3K27廣泛分布于小鼠腎臟組織。組蛋白H3K27me3可由Zeste基因增強(qiáng)子同源物2(EZH2)催化產(chǎn)生。EZH2參與組成多梳蛋白抑制復(fù)合物2(PRC2)聚集至啟動(dòng)子區(qū)域，導(dǎo)致靶基因轉(zhuǎn)錄抑制[7]。Jmjd3和UTX為含有Jumonji C結(jié)構(gòu)域的雙加氧酶，和EZH2作用相反，能特異性去除H3K27me3的甲基，解除轉(zhuǎn)錄抑制，啟動(dòng)靶基因表達(dá)[8]。組蛋白H3K27通過(guò)對(duì)甲基化與去甲基化調(diào)整，作為一個(gè)基因轉(zhuǎn)錄關(guān)鍵介質(zhì)，引發(fā)重要生物學(xué)功能。GSK-J4是組蛋白去甲基化酶Jmjd3和UTX高效且特異性強(qiáng)的選擇性抑制劑，通過(guò)選擇性抑制Jmjd3和UTX，減弱其特異性去掉賴氨酸三甲基化修飾，上調(diào)H3K27me3的表達(dá)，對(duì)下游炎癥反應(yīng)、氧化、細(xì)胞凋亡和侵襲等基因表達(dá)產(chǎn)生抑制作用，減輕糖尿病腎病小鼠足細(xì)胞損傷。

本研究中，D組腎組織組蛋白H3K27me3表達(dá)水平減少，腎組織足細(xì)胞Nephrin和Podocin表達(dá)減少，糖尿病腎病病變程度重，病理改變明顯，足細(xì)胞凋亡程度增高。在G組中給予GSK-J4，增加腎組織組蛋白H3K27me3表達(dá)水平，可恢復(fù)腎組織足細(xì)胞Nephrin和Podocin表達(dá)，使糖尿病腎病病變程度、病理改變減輕，足細(xì)胞凋亡程度減輕。

糖尿病腎病過(guò)程中發(fā)現(xiàn)組蛋白H3K27me3表達(dá)水平下降，其加重糖尿病腎病進(jìn)展的可能機(jī)制：(1)糖尿病腎病病程中，血液中的高糖環(huán)境可引起Zeste基因增強(qiáng)子同源物2的消耗，減少了H3K27me3三甲基化，同時(shí)使啟動(dòng)子區(qū)域的多梳蛋白抑制復(fù)合物2水平下降，減弱了對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的抑制作用。使轉(zhuǎn)錄因子Pax6表達(dá)上調(diào)并與TXNIP啟動(dòng)子結(jié)合，增加了氧化應(yīng)激和蛋白尿，誘發(fā)了足細(xì)胞損傷[9]。(2)非編碼RNA可以與組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶和組蛋白賴氨酸脫甲基酶結(jié)合，使組蛋白去甲基化酶靶向與組蛋白H3K27me3結(jié)合，導(dǎo)致組蛋白H3K27me3發(fā)生去甲基化[10]。組蛋白H3K27me3水平下調(diào)，對(duì)下游NF-κB信號(hào)通路抑制作用解除。IKK復(fù)合體被激活，NF-κB被釋放并進(jìn)行核易位，在細(xì)胞核內(nèi)與基因編碼上的κB位點(diǎn)結(jié)合，通過(guò)轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)基因表達(dá)程序。多種細(xì)胞因子、黏附分子和急性期反應(yīng)蛋白的基因表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致足細(xì)胞損傷[11]。(3)糖尿病腎病病程中，基因微環(huán)境發(fā)生改變，組蛋白翻譯后修飾、DNA甲基化和lncRNAs之間發(fā)生相互作用和串?dāng)_，組蛋白翻譯穩(wěn)定狀態(tài)被破壞，可導(dǎo)致組蛋白H3K27me3發(fā)生去甲基化，引起miR-195的表達(dá)上調(diào)。miR-195通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)下調(diào)凋亡抑制基因Bcl-2的表達(dá)，并通過(guò)增加caspase-3表達(dá)，最終導(dǎo)致足細(xì)胞凋亡[12-13]。(4)糖尿病腎病病程中，高糖血癥及基因微環(huán)境改變等多重因素作用下，使H3K27me3水平降低?？梢餘otch配體Jagged-1表達(dá)水平升高。Jagge-1在細(xì)胞表面表達(dá)，然后通過(guò)與Notch1結(jié)合啟動(dòng)旁分泌信號(hào)，導(dǎo)致Notch1在細(xì)胞膜上的裂解。裂解產(chǎn)物NICD(ICN)進(jìn)入細(xì)胞核，通過(guò)RAM域和cdc/ankyrin重復(fù)序結(jié)合CSL蛋白[CBF1、Su(H)、LAG1]并募集核轉(zhuǎn)錄激活蛋白家族MAML(mastermind-like)，形成三元絡(luò)合轉(zhuǎn)錄激活物(NICD-CSL-MAML)。通過(guò)堿性螺旋—環(huán)—螺旋(bHLH)家族轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)上調(diào)促進(jìn)下游基因表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞分化[14]。給予GSK-J4，提高組蛋白H3K27me3表達(dá)水平，可能減輕上述途徑對(duì)腎組織足細(xì)胞損傷，而延緩糖尿病腎病的進(jìn)展。

糖尿病腎病過(guò)程中，GSK-J4可通過(guò)調(diào)節(jié)組蛋白去甲基化酶活性，增加H3K27me3表達(dá)，維護(hù)足細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)的完整，延緩糖尿病腎病進(jìn)展。