李海峰，劉志剛，任紅松，劉河疆

（1.新疆農(nóng)業(yè)科學院 吐魯番農(nóng)業(yè)科學研究所，新疆 吐魯番 838000；2.新疆農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，新疆 烏魯木齊 830091）

鄰苯二甲酸酯（Phthalic Acid Esters， PAEs），又名酞酸酯，俗稱塑化劑，是一種人工合成的具有環(huán)境毒性的有機化合物，其作為增塑劑在塑料薄膜、兒童玩具、包裝袋等行業(yè)中被廣泛應(yīng)用，在塑料中的含量高達40%~60%［1-3］。PAEs以非共價鍵的形式與塑料結(jié)合，彼此保持相互獨立的化學性質(zhì)；塑料中的PAEs化合物很容易遷移釋放到外界環(huán)境中，造成土壤、水、大氣的污染［4-5］。鄰苯二甲酸酯具有致突變、致癌和致畸性，難以自然降解，能長久地保留于環(huán)境中，不僅能影響植物的生長及生理生化特征，而且在植物中具有一定的生物累積效應(yīng)，能通過食物鏈最終富集在人體中，危及人體的健康安全［6-9］。近年來，國內(nèi)許多學者對我國設(shè)施農(nóng)業(yè)土壤中的PAEs化合物進行了調(diào)查，各地土壤均出現(xiàn)了不同程度的PAEs污染，局部地區(qū)設(shè)施土壤中DBP濃度已超過美國環(huán)保署（EPA）土壤環(huán)境控制標準，在相應(yīng)農(nóng)產(chǎn)品中也有不同程度的檢出，其中DEHP、DBP、DIBP的濃度和檢出率較高，其健康風險不容忽視［10-12］。在設(shè)施葡萄的生產(chǎn)中，地膜和棚膜應(yīng)用廣泛，由于設(shè)施大棚棚內(nèi)溫度高、濕度大，棚膜及地膜中的PAEs化合物很可能在大棚土壤和空氣內(nèi)聚集，從而影響葡萄植株的正常生長及其產(chǎn)品的質(zhì)量安全。因此，研究葡萄植株對土壤中鄰苯二甲酸酯的吸收累積規(guī)律，對設(shè)施葡萄安全生產(chǎn)具有重要意義。植物根系可以從土壤溶液中吸收PAEs，在蒸騰流的驅(qū)動下，沿木質(zhì)部向上轉(zhuǎn)運至莖葉［13-14］。研究發(fā)現(xiàn)：花椰菜和辣椒植株中的鄰苯二甲酸酯污染主要來源于根部對土壤中鄰苯二甲酸酯的吸收；蘿卜莖葉可以吸收污染土壤中揮發(fā)出來的DBP和DEHP，但直根吸收轉(zhuǎn)移是蘿卜莖葉中DBP和DEHP的主要來源［15-16］。不同種類植物對鄰苯二甲酸酯的吸收能力和累積程度不同，植物根系吸收累積PAEs的行為不僅與其理化性質(zhì)有關(guān)，也受植物根系內(nèi)部脂肪、碳水化合物、蛋白質(zhì)等組成物質(zhì)的影響。關(guān)于葡萄植株吸收累積PAEs的相關(guān)研究鮮有報道。筆者采用盆栽覆蓋玻璃罩的方式，研究了葡萄植株各器官及其內(nèi)部主要物質(zhì)對鄰苯二甲酸正二丁酯（DBP）、鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）、鄰苯二甲酸二異丁酯（DIBP）的吸收累積特征，揭示了這3種化合物在葡萄植株的累積規(guī)律，以期為設(shè)施葡萄的安全生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗土壤為棕漠土，是當?shù)刂饕寥李愋?。其理化性狀為?pH值7.72，有機質(zhì)含量11.5 g/kg，堿解氮含量224.5 mg/kg，有效磷含量21.2 mg/kg，速效鉀含量178.0 mg/kg。

供試葡萄苗為3年生無核白葡萄，為吐魯番地區(qū)主栽品種。

供試鄰苯二甲酸酯污染物有鄰苯二甲酸正二丁酯（DBP）、鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）、鄰苯二甲酸二異丁酯（DIBP）。

1.2 試驗設(shè)計

據(jù)報道，當土壤中的DBP及DIBP含量超過20 mg/kg 時，會對辣椒的生長產(chǎn)生顯著的抑制作用；當土壤中DBP和DEHP復合污染物的濃度達到100 mg/kg時，會導致上海青葉片失綠發(fā)黃，甚至整株死亡［17-18］。據(jù)此，本盆栽試驗土壤中PAEs污染物的添加量設(shè)置了空白（0 mg/kg）、低污染水平（10 mg/kg）、高污染水平（50 mg/kg），分別記為CK、T1和T2處理，每個處理重復4次。為了減少大氣中PAEs污染物對試驗的干擾，每盆均加蓋玻璃罩，在玻璃罩兩側(cè)設(shè)置通風口，以保證葡萄的正常生長。

1.3 盆栽試驗

原土壤：采取大田10~30 cm土壤，除去根和石塊，在避光下自然風干，研磨過5 mm的篩，作為試驗原土壤。

污染土壤制備：分別取DBP、DEHP、DIBP各50 μL（PAEs質(zhì)量約為50 mg），用100 mL甲醇溶解混合；然后將PAEs的甲醇溶液添加到500 g過2 mm篩的原土壤中，不斷攪拌，使PAEs在土壤中分布均勻；最后將0.5 kg混勻的污染土與4.5 kg原土壤充分混合，得到目標濃度均為10 mg/kg的污染土壤。濃度為50 mg/kg的污染土壤按照上述方法制備。供試土壤中PAEs的初始含量見表1。

表1 供試土壤中PAEs的初始濃度 mg/kg

盆栽試驗于2019年4月至9月在新疆農(nóng)業(yè)科學院吐魯番農(nóng)業(yè)科學研究所實驗基地進行。試驗花盆材質(zhì)為陶瓷，直徑40 cm，高32 cm。在試驗期間各處理葡萄的水、肥管理一致。在葡萄成熟期，將葡萄植株連根取出，帶回實驗室，將葡萄的根、莖、果實用水沖洗干凈，于55 ℃烘干粉碎，待測。

1.4 分析方法

1.4.1 樣品處理 樣品前處理和凈化方法參照文獻［19］。稱取10.00 g土壤樣品于三角瓶中，加入水10 mL、乙腈40 mL，在搖床上以200 r/min的速率振蕩2 h；再將其倒入100 mL玻璃離心管中，在4 ℃下以3500 r/min離心5 min。離心后用濾紙將上層液體過濾到裝有5~6 g氯化鈉的具塞量筒內(nèi)，用力振蕩后靜置30 min；分層后取上層有機相20 mL，移入150 mL圓底燒瓶內(nèi)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，再加入正己烷3 mL。稱取20 g植物樣品，放入燒杯中，加入40 mL乙腈，高速勻漿2 min。用濾紙過濾到已加入5~6 g氯化鈉的具塞量筒內(nèi)，劇烈振蕩1 min，靜置15 min，然后取10 mL到150 mL圓底燒瓶內(nèi)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，再加入正己烷3 mL。上述樣品使用玻璃弗羅里硅土柱凈化，用丙酮-正己烷（10∶90）混合溶液淋洗液，將收集的洗脫液氮吹蒸發(fā)近干，再用正己烷定容至5 mL，混勻后移入2 mL自動進樣瓶，待測。

根系糖類物質(zhì)中PAEs的提?。悍Q取根系干粉0.1~0.5 g，加水約3 mL，在研缽中磨成勻漿，轉(zhuǎn)入三角燒瓶中，并用約12 mL的蒸餾水沖洗研缽2~3次，將洗出液也轉(zhuǎn)入三角燒瓶中。再向三角燒瓶中加入6 mol/L鹽酸10 mL，攪拌均勻后在沸水浴中水解0.5 h，冷卻后用10%NaOH溶液中和pH值呈中性。然后用蒸餾水定容至100 mL，過濾，得總糖提取溶液。將總糖提取溶液轉(zhuǎn)移到250 mL三角瓶中，水浴蒸干，加入5 mL正己烷，提取PAEs。

根系蛋白質(zhì)中PAEs的提取：根系蛋白質(zhì)使用植物總蛋白提取試劑盒進行提取，將蛋白提取液水浴蒸干后加入5 mL正己烷，提取PAEs。

1.4.2 儀器工作條件

1.4.2 .1 氣相條件 采用HP-5MS色譜柱（30 m× 0.25 mm×0.25 μm）；載氣為氦氣，流量為1.2 mL/min；進樣口溫度為250 ℃。脈沖不分流，傳輸線溫度為300 ℃，進樣量為2 μL。升溫程序：初始溫度為80 ℃，保持2 min；以20 ℃/min的速率升到160 ℃，保持5 min；再以10 ℃/min的速率升到280 ℃，保持4 min。

1.4.2 .2 質(zhì)譜條件 采用電子轟擊離子源，傳輸線溫度為280 ℃，離子源溫度為230 ℃，串聯(lián)四級桿一150 ℃，四級桿二150 ℃；碰撞室氦氣為2.25 mL/min，氮氣為1.50 mL/min。采用多反應(yīng)監(jiān)測方式進行數(shù)據(jù)采集。3種鄰苯二甲酸酯的保留時間、定性和定量離子對、碰撞電壓見表2。

表2 3種鄰苯二甲酸酯的保留時間、定性和定量離子對、碰撞電壓

1.4.3 樣品的回收率及精密度 采用低、中、高3個濃度進行加標回收率的測定，樣品的回收率均在81.5%~117.6%之間。DIBP、DBP、DEHP的檢出限分別為0.106、0.215、0.489 μg/kg；定量限分別為0.353、0.716、0.163 μg/kg；相對標準偏差分別為6.7%、5.6%、8.9%。

1.5 生物富集系數(shù)

生物富集系數(shù)（Bioconcentration Factor， BCF）是用來評價污染物在土壤－植物體系中遷移的難易程度，也是植物吸收累積污染物能力的評價指標之一。本試驗利用生物富集系數(shù)（生物富集系數(shù)＝葡萄各部位PAEs含量/土壤中PAEs含量）衡量鄰苯二甲酸酯從土壤遷移到葡萄植株體的難易程度。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2007和SPSS 19.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析；單因素相關(guān)顯著性檢驗采用LSD（least significant difference）法，置信水平為95%。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄植株不同部位PAEs的含量及分布

表3、表4分別列出了葡萄植株不同部位DBP、DEHP和DIBP的含量及其組成比例。由表3可以看出，隨著土壤中PAEs污染濃度的增高，葡萄植株各部位對DBP、DEHP和DIBP的累積量逐漸增大，在不同污染水平下3種化合物的含量存在顯著差異（P<0.05）。在3種化合物中，DEHP在葡萄植株中的含量最高，其次為DBP，而DIBP的累積量最小；就高污染處理而言，葡萄植株中DEHP的含量分別是DBP和DIBP的7.9、11.5倍。在相同污染水平下，葡萄植株各部位DBP、DEHP和DIBP的含量表現(xiàn)為根>莖>果實，其中根系中三者的含量顯著高于莖和果實。由表4葡萄植株不同部位PAEs累積量占累積總量的百分比可知，在污染處理中，DBP、DEHP和DIBP的含量在根中占84.91%~99.48%，在莖中占0.34%~8.70%，在果實中占0.18%~8.87%，其中DEHP在根中的占比高達99.48%，DBP和DIBP在根中的占比也在84%以上，可見，這3種化合物主要累積在葡萄根系中。

表3 葡萄植株不同部位PAEs的含量 μg/kg

表4 葡萄植株不同部位PAEs累積量占累積總量的百分比%

2.2 葡萄植株各器官對PAEs的生物富集能力

表5為葡萄植株各器官對PAEs的富集系數(shù)。由表5可知，葡萄根系對DBP、DEHP和DIBP的富集系數(shù)介于0.012~0.163，莖和果實的富集系數(shù)在0~0.002之間，根對三者的富集系數(shù)遠大于莖、果實，說明根系對DBP、DEHP和DIBP的富集能力強于莖和果實。在各化合物中，根系對DEHP的富集系數(shù)最大，為0.163；其次為DBP；對DIBP的富集系數(shù)最小，為0.012。

表5 葡萄植株各器官對PAEs的富集系數(shù)

2.3 葡萄根系中蛋白質(zhì)及其PAEs的含量

由圖1可知，葡萄根系總蛋白含量隨土壤污染水平升高而遞減，高污染處理的根系總蛋白含量與CK差異顯著（P<0.05），表明高濃度的PAEs對葡萄根系蛋白質(zhì)的合成具有顯著的抑制作用。通過對葡萄根系蛋白質(zhì)中的PAEs進行測定，蛋白質(zhì)中均檢出DBP、DEHP和DIBP這3種化合物（圖2）。3種化合物在蛋白質(zhì)中的含量隨著土壤污染水平的升高而顯著增大（P<0.05）。在高污染水平（T2）下，蛋白質(zhì)中DIBP含量高達558.95 μg/kg，分別是DEHP和DBP含量的1.7倍和5.3倍。將不同處理的根系蛋白含量與其PAEs含量進行分析，蛋白質(zhì)中PAEs含量與蛋白含量沒有相關(guān)性，與土壤污染水平顯著相關(guān)。

2.4 葡萄根系總糖及其PAEs的含量

圖3、圖4分別顯示了葡萄根系總糖及其PAEs的含量。由圖3可知，污染處理（T1、T2） 葡萄根系的總糖含量均小于CK，且與CK差異顯著（P<0.05），說明土壤中PAEs污染物對葡萄根系糖的累積具有抑制作用。對糖類物質(zhì)中的DBP、DEHP和DIBP進行檢測，3種化合物均被檢出，其含量隨土壤污染水平升高而增加，高污染水平與低污染水平、CK差異顯著（P<0.05）。各處理根系糖類中3種化合物的含量表現(xiàn)為DEHP>DBP>DIBP，在高污染水平中，DEHP含量高達2135.3 μg/kg，分別是DBP和DIBP含量的3.2倍和16.1倍。對各處理的總糖含量與其PAEs含量進行分析，發(fā)現(xiàn)糖類中PAEs含量與糖含量沒有相關(guān)性，與土壤污染水平顯著相關(guān)。

圖1 PAEs對葡萄根系蛋白含量的影響

圖2 葡萄根系蛋白質(zhì)中PAEs的含量

圖3 PAEs對葡萄根系總糖含量的影響

3 討論

鄰苯二甲酸酯作為農(nóng)業(yè)土壤中普遍存在的一類有機污染物，能在土壤-植物系統(tǒng)間遷移、轉(zhuǎn)運、分配，最終被植物吸收。植物體內(nèi)PAEs的成分、含量與土壤有顯著相關(guān)性。有研究發(fā)現(xiàn)，花生［20］、西紅柿［21］、水稻［22］等農(nóng)作物中鄰苯二甲酸酯的濃度與土壤污染程度呈顯著正相關(guān)。本研究通過盆栽試驗對不同污染水平下葡萄植株吸收累積DBP、DEHP和DIBP的特征進行了分析，發(fā)現(xiàn)葡萄植株中3種化合物的含量隨著土壤污染程度的增加而顯著升高，表明葡萄植株中PAEs污染物來源于土壤，與上述研究結(jié)果一致。在同一污染水平下，葡萄植株各部位PAEs及各單體的含量存在顯著差異，根部含量最高，占比達84.91%~99.48%，表明DBP、DEHP和DIBP這3種化合物主要累積在葡萄根系中。周震峰等［15］研究發(fā)現(xiàn)，鄰苯二甲酸酯在花椰菜和辣椒根中的含量顯著高于葉、莖和果實，而在冬瓜中的含量表現(xiàn)為莖葉>根>果實。張曉蕾等［23］也證實，冬瓜莖中DEHP的含量是根的11倍，說明不同植物對鄰苯二甲酸酯的吸收累積途徑可能存在差異。

圖4 葡萄根系糖中PAEs的含量

在本試驗結(jié)束后對污染處理土壤中PAEs的殘留量進行了測定，發(fā)現(xiàn)各處理土壤中DBP、DEHP和DIBP的含量均出現(xiàn)了不同程度的下降，與初始含量相比，低污染處理3種化合物的含量分別下降了11.2%、29.5%、7.3%，高污染處理分別下降了8.9%、21.2%、5.7%，三者在葡萄植株中的富集量遠小于在土壤中的下降量，說明土壤中PAEs可能通過其他途徑降解或代謝。相關(guān)研究也表明，土壤中的DBP、DEHP能被植物吸收富集，并且在體內(nèi)代謝出毒性比母體更高的單酯產(chǎn)物［24］。本試驗未在培養(yǎng)期間對土壤及植株中DBP、DEHP和DIBP的殘留及其代謝物的累積變化進行監(jiān)測，3種化合物在土壤和葡萄植株中的代謝情況不明確，有待進一步深入研究。

富集系數(shù)可以反映植物對鄰苯二甲酸酯吸收、累積的能力。作物種類不同，其對鄰苯二甲酸酯的吸收富集能力有很大的差異。有學者研究了不同種類蔬菜對鄰苯二甲酸酯的富集能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)根菜類>花菜類>果菜類>莖菜類>葉菜類［25］。吳山等對不同蔬菜可食部位對PAEs富集能力的研究顯示，蘿卜、黃瓜和芥藍的富集系數(shù)較高，富集系數(shù)均大于6，而白菜、生菜等葉菜類的富集系數(shù)為1~3，兩者表現(xiàn)出較大的差異［26］。本研究對葡萄植株不同部位鄰苯二甲酸酯的富集系數(shù)進行了分析，發(fā)現(xiàn)葡萄根系對DBP、DEHP和DIBP的富集系數(shù)在0.012~0.163，莖和果實的富集系數(shù)在0~0.002，富集系數(shù)均小于1，說明葡萄對PAEs的富集能力較弱。鄰苯二甲酸酯在植物葉片、莖、果實、根系等器官中的富集量也因植物種類不同而異。研究表明，在相同的土壤中，大豆、玉米主要在根部累積DBP、DEHP，而小麥對DBP、DEHP的累積主要集中在籽粒中［27］。肖凱恩等研究發(fā)現(xiàn)，蘿卜、茄子、黃瓜等蔬菜吸收的鄰苯二甲酸酯主要累積在表皮，只有少量的PAEs會累積于肉質(zhì)部［28］。在本研究中，鄰苯二甲酸酯主要富集在葡萄根系中，地上部分富集很少，說明根系的富集能力較強。

鄰苯二甲酸酯的理化性質(zhì)，如分子量、辛醇-水分配系數(shù)也影響其在植物中的富集。DIBP、DBP的分子量和Kow較小，比較容易被植物吸收、運移，而DEHP的分子量和Kow較大，不容易被植物吸收并向地上部運移，容易滯留在根部［29］。本研究發(fā)現(xiàn)，葡萄根系對DEHP的富集系數(shù)最大，為0.163，顯著高于DBP和DIBP的富集系數(shù)，說明根系對DEHP的富集能力強于對DBP和DIBP的，在植株中不易遷移、吸收，容易滯留在根部，這符合上述理論。

本研究進一步對葡萄根系蛋白和總糖含量及兩者中PAEs含量進行了測定，發(fā)現(xiàn)在不同濃度PAEs處理下，葡萄根系總蛋白和總糖含量均低于對照，且高污染水平下的兩者含量最低，與對照差異顯著。Sharma R等研究發(fā)現(xiàn)，巨型浮萍在高濃度的DEP脅迫下，其蛋白含量較對照降低了76%［30］。楊子江等通過室內(nèi)盆栽模擬試驗發(fā)現(xiàn)，在成熟期，水稻葉片中可溶性糖含量隨PAEs濃度增加而逐漸下降［8］，說明高濃度PAEs對植物蛋白和糖的合成具有抑制作用。本研究從葡萄根系蛋白質(zhì)和糖類物質(zhì)中均檢出了目標污染物DBP、DEHP和DIBP，其含量隨著土壤污染水平的升高而增大；在高污染水平下，蛋白質(zhì)中DIBP含量分別是DEHP和DBP含量的1.7倍和5.3倍，糖類物質(zhì)中DEHP含量分別是DBP和DIBP含量的3.2倍和16.1倍。吳遵義等［31］對冬瓜植株吸收累積DEHP機制的研究發(fā)現(xiàn)，冬瓜果肉中核蛋白對DEHP的累積較多，根系線粒體和葉綠體對DEHP表現(xiàn)出很強的累積效果，主要可能是因為線粒體和葉綠體都是由主要成分為蛋白質(zhì)、脂類和糖類的磷脂雙分子層包裹。可見，在植株中PAEs的累積可能與蛋白質(zhì)、糖類等物質(zhì)有關(guān)。目前，關(guān)于糖類物質(zhì)和蛋白質(zhì)對PAEs的結(jié)合能力的研究較少，有待進一步研究。

4 結(jié)論

葡萄植株中的DBP、DEHP和DIBP主要來源于土壤，各部位的累積量隨土壤污染水平提高而增大。在3種化合物中，DEHP在葡萄植株中的含量顯著高于DBP和DIBP的，且三者主要分布在葡萄根系中，根系對DBP、DEHP和DIBP的富集能力強于莖和果實。高濃度的PAEs對葡萄根系蛋白和糖的合成具有抑制作用。