負(fù)載酶@ZIF-8復(fù)合物的聚合物微顆?？煽刂苽?/h1>
2022-04-26 09:50:16張彥汪偉謝銳巨曉潔劉壯褚良銀
化工進(jìn)展 2022年4期
張彥，汪偉，2，謝銳，2，巨曉潔，2，劉壯，2，褚良銀，2
（1 四川大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，四川 成都 610065；2 四川大學(xué)高分子材料工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610065）
酶具有催化條件溫和、催化效率高以及選擇性強(qiáng)等特點(diǎn)，在食品加工、醫(yī)藥生產(chǎn)以及工業(yè)廢水處理等方面均展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。但是，酶分子的空間結(jié)構(gòu)容易受到溫度、紫外光等因素的影響，導(dǎo)致酶的活性下降甚至完全失活，這極大限制了酶的應(yīng)用范圍。利用物理吸附、化學(xué)結(jié)合或者包封的方法將酶負(fù)載到固體載體上實(shí)現(xiàn)固定化，可有效維持酶的活性、提升其穩(wěn)定性，有利于其催化反應(yīng)和回收再利用。如研究者通過(guò)將酶固定化到多樣化的功能微顆粒上，有效實(shí)現(xiàn)了酶催化反應(yīng)和便捷回收利用。然而，如何在保持酶良好催化特性的同時(shí)來(lái)實(shí)現(xiàn)酶的良好儲(chǔ)存性能和環(huán)境耐受性，仍然存在著挑戰(zhàn)。
金屬有機(jī)骨架（metal organic-frameworks，MOFs）材料具有比表面積大、孔隙率高、孔徑可調(diào)等特點(diǎn)，在吸附分離、廢水處理、酶固定化等領(lǐng)域具有重要作用。特別是MOFs 材料的微孔結(jié)構(gòu)可對(duì)酶分子的空間結(jié)構(gòu)起到良好的保護(hù)作用。而在MOFs 材料中，ZIF-8 由于具有合成條件溫和、物理化學(xué)穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，因而在酶固定化方面具有良好的應(yīng)用前景。如利用基于仿生物礦化法的酶固定化技術(shù)，研究者將脂肪酶、葡萄糖氧化酶和過(guò)氧化物酶等封裝到ZIF-8的微孔結(jié)構(gòu)中，有效提升了酶的穩(wěn)定性，拓寬了酶在催化生產(chǎn)、分析檢測(cè)、藥物遞送等領(lǐng)域的應(yīng)用。若能將ZIF-8 材料巧妙耦合到微顆粒中以用于酶的固定化，將可在保持酶良好催化特性的同時(shí)實(shí)現(xiàn)其良好儲(chǔ)存性能和環(huán)境耐受性，這對(duì)于酶固定化功能微顆粒的發(fā)展具有重要意義。
針對(duì)上述難題，本文首先利用微流控技術(shù)連續(xù)可控地制備了含有丙烯酰胺與丙烯酸單體的W/O乳液[圖1(a)]，以W/O乳液為模板制備了聚丙烯酰胺-共聚-丙烯酸水凝膠（PAM-AA）微顆粒，再由原位仿生物礦法在PAM-AA微顆粒上原位生長(zhǎng)負(fù)載酶的ZIF-8（酶@ZIF-8）納米顆粒構(gòu)建了一種負(fù)載酶@ZIF-8 的PAM-AA 微顆粒（酶@ZIF-8/PAM-AA微顆粒）[圖1(b)]。基于ZIF-8的微孔結(jié)構(gòu)對(duì)酶分子的良好保護(hù)作用，該微顆?？烧宫F(xiàn)出良好的催化活性，同時(shí)亦具有良好的儲(chǔ)存性能和環(huán)境耐受性。該研究工作為設(shè)計(jì)構(gòu)建新型酶固定化功能微顆粒提供了一種新模型。
圖1 酶@ZIF-8/PAM-AA微顆粒的制備過(guò)程示意圖
1 材料和方法
1.1 試劑與儀器
丙烯酰胺（AM，分析純）、丙烯酸（AA，分析純）、'-亞甲基雙丙烯酰胺（BIS，分析純）、六水合硝酸鋅[Zn(NO)·6HO，純度99%]，成都市科龍化工試劑廠；2-羥基-2-甲基苯丙酮（HMPP，分析純）、正十二烷（純度98%）、聚異丁烯雙丁二酰亞胺（T154）、石油醚（分析純）、異丙醇（分析純）、2-甲基咪唑（Hmim，純度98%）、辣根過(guò)氧化物酶（HRP，分析純）、30%過(guò)氧化氫（分析純）、2,2'-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)（ABTS，分析純），阿拉丁試劑公司；去離子水（電阻率＞18.2MΩ），源自Millopore Elix-10 純水系統(tǒng)（Millipore 公司）。以上試劑均直接使用。
注射泵（LSP01-2A型），保定蘭格恒流泵有限公司；高速攝像機(jī)（Phantom MIRO3 型），美國(guó)Vision Research公司；工業(yè)光學(xué)顯微鏡（BX61型），日本Olympus 公司；體式顯微鏡（SZX16 型），日本Olympus公司；掃描電子顯微鏡（SEM，TM3030型），日立高新技術(shù)公司；X 射線電子能譜分析儀（XPS，XSAM 800 型），英國(guó)曼徹斯特Kratos 公司；紫外光譜儀（UV-2700 型），日本島津儀器公司；水平拉針儀（P-97），美國(guó)Sutter 公司；顯微斷針儀（MF-830），日本Narishige公司。
1.2 微流控裝置的構(gòu)建
制備PAM-AA微顆粒所用的玻璃毛細(xì)管微流控裝置結(jié)構(gòu)如圖1(a)所示。該單級(jí)微流控裝置主要由注射管、方形管和接收管三部分組成。其中，方形管為橫截面外徑為1.4mm、內(nèi)徑為1.0mm的方形玻璃管，而注射管和接收管均是外徑為960μmol/L、內(nèi)徑為550μmol/L的圓柱形玻璃管。其中，注射管的一端經(jīng)過(guò)水平拉針儀和顯微斷針儀加工為錐形，其錐口內(nèi)徑為100μmol/L。將上述方形玻璃管和圓形玻璃管如圖1(a)所示組裝起來(lái)，并使用環(huán)氧樹脂膠將裝置黏合、固定在玻片上，從而構(gòu)建得到用于制備PAM-AA微顆粒的微流控裝置。
1.3 PAM-AA微顆粒的微流控制備
將2g AM、200μL AA、0.1g BIS 以 及60mg HMPP 加入到10mL 去離子水中，并將溶液充分?jǐn)嚢杈鶆蜃鳛榉稚⑾?；使用含?g T154、0.2g HMPP的20g 正十二烷作為連續(xù)相。如圖1(a)所示，使用注射泵將分散相和連續(xù)相溶液分別以20μL/min 和200μL/min 的流速注射進(jìn)微流控裝置相應(yīng)的玻璃管微通道內(nèi)，從而使得分散相在注射管錐口處被連續(xù)相剪切形成均一的液滴。將液滴接入與連續(xù)相組成相同的接收液中，并在紫外光下照射10min，使得液滴中的AM 與AA 聚合形成PAM-AA 水凝膠微顆粒。將制得的微顆粒用石油醚清洗兩次，再用異丙醇清洗兩次以洗掉其中的正十二烷，最后利用去離子水洗滌兩次，從而得到PAM-AA微顆粒。
1.4 HRP@ZIF-8/PAM-AA微顆粒的制備
將上述制備得到的PAM-AA 微顆粒加入到含有0.405g Zn(NO)·6HO、20mg HRP 的4mL 去離子水中，震蕩10min，使溶液中的Zn與PAM-AA 的羧基充分螯合。然后，加入20mL Hmim 水溶液（1.25mol/L），并在恒溫振蕩器（溫度設(shè)置為10℃）中震蕩反應(yīng)10min。反應(yīng)完成后，將所得微顆粒用去離子水多次洗滌，并經(jīng)過(guò)濾得到HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒。該微顆粒經(jīng)凍干后置于干燥柜中儲(chǔ)存待用。
1.5 乳液及微顆粒的形貌結(jié)構(gòu)和組成表征
利用工業(yè)顯微鏡和體式顯微鏡對(duì)W/O 乳液以及微顆粒的形貌進(jìn)行觀察，并對(duì)微顆粒的粒徑進(jìn)行測(cè)量，利用式(1)計(jì)算乳液以及微顆粒的變異系數(shù)（）。
使用SEM 對(duì)干燥后的HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒表面以及剖面處的微觀形貌結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。利用X 射線光電子能譜儀（XPS） 對(duì)干燥后的HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒進(jìn)行元素分析。利用熱重分析儀（TGA）測(cè)試HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒中HRP@ZIF-8 的負(fù)載量。稱取5～8mg 干燥的HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒樣品置于坩堝中并放入TGA 進(jìn)行測(cè)試。參數(shù)設(shè)置為：在氮?dú)夥諊?，溫度?5℃以10℃/min 的升溫速度升高到800℃。在相同的測(cè)試條件下測(cè)試PAM-AA 微顆粒的質(zhì)量變化，導(dǎo)出質(zhì)量變化數(shù)據(jù)并作出質(zhì)量變化圖，對(duì)比兩種曲線計(jì)算出HRP@ZIF-8的負(fù)載量。
1.6 HRP@ZIF-8/PAM-AA微顆粒的催化性能
利用ABTS 顯色反應(yīng)對(duì)HRP@ZIF-8/PAM-AA微顆粒的催化活性進(jìn)行表征。在HRP 的催化作用下，HO可將ABTS 的銨鹽轉(zhuǎn)化為陽(yáng)離子自由基ABTS（顯黃綠色）。由于ABTS在415nm 處有強(qiáng)烈的光吸收，因此可利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)反應(yīng)液在415nm處的吸光度大小來(lái)反映溶液中ABTS的濃度，并由此確定HRP的催化效率。取10mg干燥的HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒加入到裝有4.8mL PBS緩沖液（0.1mol/L，pH=7.4，547μmol/L ABTS）的棕色試劑瓶中，將溶液搖勻使微顆粒均勻分散。將100μL 的NaHPO-KHPO緩 沖 液（0.2mol/L，pH=6.0）以及100μL HO（1%）加入到上述溶液中，并使用紫外分光光度計(jì)中測(cè)試該溶液在415nm處的吸光度，自反應(yīng)60s 開始每隔120s 取一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)。
在制備得到HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒后，每隔24h 取出10mg 樣品測(cè)試其催化活性，以表征其在常溫常壓下的儲(chǔ)存性能。催化活性的測(cè)試方法同上，待反應(yīng)5min 后利用紫外分光光度計(jì)測(cè)試反應(yīng)液在415nm的吸光度。
此外，利用ABTS 顯色反應(yīng)法測(cè)試HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒的環(huán)境耐受性。分別稱取10mg HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒，均勻分散到裝有4.8mL PBS 緩沖液（0.1mol/L，pH=7.4，547μmol/L ABTS）的三個(gè)棕色試劑瓶。將三份溶液分別置于80℃恒溫水浴槽、UV 光照、胰蛋白酶三種條件下處 理30min 后，分 別 加 入100μL 的NaHPO-KHPO（0.2mol/L，pH=6.0） 緩 沖 液 以 及100μL HO（質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%），反應(yīng)5min 后檢測(cè)反應(yīng)液在415nm處的吸光度。
2 結(jié)果與討論
2.1 HRP@ZIF-8/PAM-AA微顆粒的形貌尺寸
微流控技術(shù)可控產(chǎn)生的乳液液滴微具有均一尺寸的特點(diǎn)，這為功能微顆粒的構(gòu)建提供了良好模板。本實(shí)驗(yàn)中，采用了微流控裝置可控產(chǎn)生的單分散W/O 乳液液滴作為模板來(lái)構(gòu)建PAM-AA 微顆粒。如圖2(a)所示為用于制備該P(yáng)AM-AA微顆粒的W/O乳液的光學(xué)顯微鏡圖片，從圖中可以看出，從微流控裝置中產(chǎn)生得到的W/O 乳液呈球狀，無(wú)色透明且大小均一。以該乳液液滴為模板，通過(guò)紫外光照引發(fā)液滴中的單體AM 和AA 發(fā)生聚合，可制備得到尺寸與液滴模板相當(dāng)?shù)腜AM-AA 微顆粒。如圖2(b)所示為PAM-AA 微顆粒的光學(xué)顯微鏡圖片，從圖中可以看出，該微顆粒保持了良好的球形度，且具有均一的尺寸。如圖2(c)所示，W/O乳液液滴的平均粒徑為468.02μm，值為1.70%，這說(shuō)明乳液具有良好的單分散性。此外，相較于圖2(a)中的W/O乳液，置于水相中的PAM-AA微顆粒粒徑明顯增大，其平均粒徑增加為501.64μm。這是由于凝膠微顆粒內(nèi)AA的存在使得微顆粒含有大量親水的羧基，因此使得微顆粒吸水能力增強(qiáng)，最終導(dǎo)致微顆粒更加溶脹、粒徑增加。
圖2 W/O乳液液滴及PAM-AA微顆粒的光學(xué)顯微鏡圖以及粒徑分布圖
如圖3(a)所示HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒的光學(xué)顯微鏡圖。與圖2(b)中未負(fù)載HRP@ZIF-8 的空白PAM-AA 微顆粒相比較，負(fù)載HRP@ZIF-8 后的HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒由無(wú)色變?yōu)樽厣彝该鞫冉档?。這是由于HRP@ZIF-8 納米顆粒的存在降低了PAM-AA 微顆粒的透明度，說(shuō)明HRP@ZIF-8 成功地接枝到凝膠微顆粒上。此外，HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒的粒徑分布如圖3(b)所示，從圖中可以看出，該微顆粒的粒徑呈現(xiàn)出正態(tài)分布，其平均粒徑為559.97μm、值為2.17%，仍具有良好的單分散性。相比于PAM-AA 微顆粒，HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒的粒徑增加主要是由于其內(nèi)部負(fù)載填充了HRP@ZIF-8納米顆粒所致。
圖3 HRP@ZIF-8/PAM-AA微顆粒的光學(xué)顯微鏡圖及粒徑分布圖
2.2 HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒的微觀結(jié)構(gòu)組成
HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒的SEM 形貌表征結(jié)果如圖4(a)所示。從圖中可以觀察到HRP@ZIF-8/PAM-AA微顆粒表面為多孔的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這種多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可促進(jìn)催化過(guò)程中反應(yīng)物質(zhì)在微顆粒中的傳遞，有利于HRP@ZIF-8催化反應(yīng)的順利進(jìn)行。此外，該微顆粒呈現(xiàn)出非球形結(jié)構(gòu)，這是由于在液氮中冷凍的過(guò)程中冰晶沿著微顆粒內(nèi)部的生長(zhǎng)方向不均勻，因此導(dǎo)致微顆粒形貌改變。圖4(b)所示為HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒表面的放大結(jié)構(gòu)，從該圖中可以看出，由于PAM-AA 凝膠網(wǎng)絡(luò)上原位生長(zhǎng)了HRP@ZIF-8 納米顆粒，因而使得其表面粗糙度增加。同時(shí)，從如圖4(c)所示HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒斷面的SEM 圖可看出，微顆粒內(nèi)部亦呈現(xiàn)多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，但從微顆粒剖面處的放大SEM 圖[ 圖4(d)] 中 可 看 出， 微 顆 粒 內(nèi) 部 的HRP@ZIF-8 納米顆粒含量明顯降低。該結(jié)果說(shuō)明HRP@ZIF-8納米顆粒主要負(fù)載到了微顆粒的表面，這更有利于HRP@ZIF-8納米顆粒與底物充分接觸，促進(jìn)催化反應(yīng)進(jìn)行。此外，微顆粒在800r/min的轉(zhuǎn)速下經(jīng)機(jī)械攪拌1h 后，仍能保持良好的球形度，這說(shuō)明微顆粒具有良好的機(jī)械強(qiáng)度，能夠適用于機(jī)械攪拌過(guò)程。
圖4 HRP@ZIF-8/PAM-AA微顆粒的SEM圖
HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒的XPS 表征結(jié)果如圖5 所示。從圖5 中可以看出，微顆粒在285.35mV、399.75mV、531.9mV、1022.1mV 以及1045.2mV 有明顯的出峰。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)的光電子能譜圖相對(duì)照分析可知，在285.35mV 處峰為C 1s 的峰，在399.75mV 處峰為N 1s 的峰，在531.9mV 處的為O 1s；而在1022.1mV和1045.2mV出現(xiàn)兩個(gè)峰分別代表Zn 2p3/2和Zn 2p1/2的峰；兩種不同的峰出現(xiàn)是因?yàn)槲㈩w粒上存在Zn—N鍵以及與羧基螯合的Zn，這說(shuō)明HRP@ZIF-8成功地負(fù)載到了PAMAA微顆粒上。
圖5 HRP@ZIF-8/PAM-AA微顆粒的XPS分析圖
HRP@ZIF-8/PAM-AA 微 顆粒以及PAM-AA 微顆粒的熱重分析表征結(jié)果如圖6所示。在溫度小于400℃時(shí)，兩條曲線幾乎重合，其質(zhì)量的降低主要是由于凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的水分揮發(fā)以及凝膠網(wǎng)絡(luò)的破壞、熱解；而當(dāng)溫度超過(guò)400℃之后，微顆粒的質(zhì)量減緩降低，凝膠結(jié)構(gòu)基本熱解完畢。當(dāng)溫度升高至450℃以后，ZIF-8 結(jié)構(gòu)逐漸被破壞、熱解，通過(guò)計(jì)算HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒和PAM-AA微顆粒在450℃位置處的質(zhì)量差即可估算出為微顆粒中HRP@ZIF-8 納米顆粒的負(fù)載量。計(jì)算結(jié)果表明HRP@ZIF-8 納米顆粒在微顆粒中的負(fù)載量約為14%。
圖6 HRP@ZIF-8/PAM-AA微顆粒的熱重分析
2.3 HRP@ZIF-8/PAM-AA微顆粒的酶催化活性
如圖7 所示為分別含有HRP@ZIF-8/PAM-AA微顆粒以及PAM-AA 微顆粒的反應(yīng)液在415nm 處的吸光度隨時(shí)間變化的曲線。從圖7 中可以看出，含PAM-AA 微顆粒的反應(yīng)液在415nm 處的吸光度無(wú)明顯變化，一直維持在零，說(shuō)明PAM-AA 微顆粒由于不含HRP@ZIF-8 納米顆粒而不具備催化性能。相比之下，含HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒的反應(yīng)液在415nm處的吸光度隨著時(shí)間的增大而呈正比地增加，且擬合優(yōu)度（）為0.9924。這說(shuō)明HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒具有良好的催化性能，能將ABTS 的銨鹽轉(zhuǎn)化為了ABTS。此外，通過(guò)減小顆粒尺寸可以增大微顆粒的比表面積、減小傳質(zhì)路徑，從而通過(guò)傳質(zhì)強(qiáng)化進(jìn)一步提高酶的催化活性和表觀反應(yīng)速率。由于該微顆粒的尺寸主要決定于W/O 乳液液滴的尺寸，因此可利用通過(guò)調(diào)節(jié)微流控裝置的微通道尺寸和液相流速等手段來(lái)減小W/O乳液液滴的尺寸，從而減小微顆粒的尺寸，進(jìn)一步提升其催化性能。
圖7 含HRP@ZIF-8/PAM-AA微顆粒及PAM-AA微顆粒的反應(yīng)液在415nm處的吸光度隨時(shí)間的變化
2.4 HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒的儲(chǔ)存性能和環(huán)境耐受性
如圖8(a)所示為HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒在常溫下的酶相對(duì)活性隨時(shí)間的變化。從圖8(a)中可以看出，隨著時(shí)間由1 天逐漸延長(zhǎng)至7 天，HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒的酶相對(duì)活性基本維持不變。這說(shuō)明HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒中ZIF-8 的微孔結(jié)構(gòu)可以對(duì)HRP 起到良好的保護(hù)作用，有利于酶的長(zhǎng)期保存。如圖8(b)所示為HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒在不同處理?xiàng)l件下的酶相對(duì)活性。從圖8(b)中可以看出，相比于常溫常壓條件下的HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒，經(jīng)80℃處理后的HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒仍能保持約75%的活性；同時(shí)，分別經(jīng)過(guò)紫外線照射處理或者胰蛋白酶處理后的HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒亦可保持75%以上的活性。上述結(jié)果說(shuō)明，ZIF-8的微孔結(jié)構(gòu)可有效地保護(hù)HRP，使其能經(jīng)受熱處理、紫外線處理以及胰蛋白酶處理的苛刻處理?xiàng)l件，展現(xiàn)出良好的環(huán)境耐受性。這主要是因?yàn)椋琙IF-8材料的微孔結(jié)構(gòu)對(duì)酶分子的空間結(jié)構(gòu)具有“限域”作用，使酶即使在外界條件改變的情況下其具有活性的優(yōu)勢(shì)空間結(jié)構(gòu)亦能得到很好的保護(hù)，從而提高了酶的穩(wěn)定性和環(huán)境耐受性。
圖8 HRP@ZIF-8/PAM-AA微顆粒的儲(chǔ)存性能和環(huán)境耐受性能
3 結(jié)論
綜上所述，本文基于微流控法可控制備得到均一PAM-AA 微顆粒，利用仿生物礦化法在該微顆粒的水凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中原位生長(zhǎng)酶@ZIF-8 納米顆粒，成功構(gòu)建了酶@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒。該微顆粒的表面富集有酶@ZIF-8 納米顆粒，而ZIF-8納米顆粒的微孔結(jié)構(gòu)可有效保護(hù)內(nèi)部封裝的酶，使其在保持良好催化活性的同時(shí)，能有效地經(jīng)受熱處理、紫外照射、胰蛋白酶處理等條件的影響，具有良好的儲(chǔ)存性能和環(huán)境耐受性。該研究工作為新型酶固定化功能微顆粒的設(shè)計(jì)構(gòu)建提供了新的策略。
張彥，汪偉，2，謝銳，2，巨曉潔，2，劉壯，2，褚良銀，2
（1 四川大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，四川 成都 610065；2 四川大學(xué)高分子材料工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610065）
酶具有催化條件溫和、催化效率高以及選擇性強(qiáng)等特點(diǎn)，在食品加工、醫(yī)藥生產(chǎn)以及工業(yè)廢水處理等方面均展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。但是，酶分子的空間結(jié)構(gòu)容易受到溫度、紫外光等因素的影響，導(dǎo)致酶的活性下降甚至完全失活，這極大限制了酶的應(yīng)用范圍。利用物理吸附、化學(xué)結(jié)合或者包封的方法將酶負(fù)載到固體載體上實(shí)現(xiàn)固定化，可有效維持酶的活性、提升其穩(wěn)定性，有利于其催化反應(yīng)和回收再利用。如研究者通過(guò)將酶固定化到多樣化的功能微顆粒上，有效實(shí)現(xiàn)了酶催化反應(yīng)和便捷回收利用。然而，如何在保持酶良好催化特性的同時(shí)來(lái)實(shí)現(xiàn)酶的良好儲(chǔ)存性能和環(huán)境耐受性，仍然存在著挑戰(zhàn)。
金屬有機(jī)骨架（metal organic-frameworks，MOFs）材料具有比表面積大、孔隙率高、孔徑可調(diào)等特點(diǎn)，在吸附分離、廢水處理、酶固定化等領(lǐng)域具有重要作用。特別是MOFs 材料的微孔結(jié)構(gòu)可對(duì)酶分子的空間結(jié)構(gòu)起到良好的保護(hù)作用。而在MOFs 材料中，ZIF-8 由于具有合成條件溫和、物理化學(xué)穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，因而在酶固定化方面具有良好的應(yīng)用前景。如利用基于仿生物礦化法的酶固定化技術(shù)，研究者將脂肪酶、葡萄糖氧化酶和過(guò)氧化物酶等封裝到ZIF-8的微孔結(jié)構(gòu)中，有效提升了酶的穩(wěn)定性，拓寬了酶在催化生產(chǎn)、分析檢測(cè)、藥物遞送等領(lǐng)域的應(yīng)用。若能將ZIF-8 材料巧妙耦合到微顆粒中以用于酶的固定化，將可在保持酶良好催化特性的同時(shí)實(shí)現(xiàn)其良好儲(chǔ)存性能和環(huán)境耐受性，這對(duì)于酶固定化功能微顆粒的發(fā)展具有重要意義。
針對(duì)上述難題，本文首先利用微流控技術(shù)連續(xù)可控地制備了含有丙烯酰胺與丙烯酸單體的W/O乳液[圖1(a)]，以W/O乳液為模板制備了聚丙烯酰胺-共聚-丙烯酸水凝膠（PAM-AA）微顆粒，再由原位仿生物礦法在PAM-AA微顆粒上原位生長(zhǎng)負(fù)載酶的ZIF-8（酶@ZIF-8）納米顆粒構(gòu)建了一種負(fù)載酶@ZIF-8 的PAM-AA 微顆粒（酶@ZIF-8/PAM-AA微顆粒）[圖1(b)]。基于ZIF-8的微孔結(jié)構(gòu)對(duì)酶分子的良好保護(hù)作用，該微顆?？烧宫F(xiàn)出良好的催化活性，同時(shí)亦具有良好的儲(chǔ)存性能和環(huán)境耐受性。該研究工作為設(shè)計(jì)構(gòu)建新型酶固定化功能微顆粒提供了一種新模型。
圖1 酶@ZIF-8/PAM-AA微顆粒的制備過(guò)程示意圖
1 材料和方法
1.1 試劑與儀器
丙烯酰胺（AM，分析純）、丙烯酸（AA，分析純）、'-亞甲基雙丙烯酰胺（BIS，分析純）、六水合硝酸鋅[Zn(NO)·6HO，純度99%]，成都市科龍化工試劑廠；2-羥基-2-甲基苯丙酮（HMPP，分析純）、正十二烷（純度98%）、聚異丁烯雙丁二酰亞胺（T154）、石油醚（分析純）、異丙醇（分析純）、2-甲基咪唑（Hmim，純度98%）、辣根過(guò)氧化物酶（HRP，分析純）、30%過(guò)氧化氫（分析純）、2,2'-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)（ABTS，分析純），阿拉丁試劑公司；去離子水（電阻率＞18.2MΩ），源自Millopore Elix-10 純水系統(tǒng)（Millipore 公司）。以上試劑均直接使用。
注射泵（LSP01-2A型），保定蘭格恒流泵有限公司；高速攝像機(jī)（Phantom MIRO3 型），美國(guó)Vision Research公司；工業(yè)光學(xué)顯微鏡（BX61型），日本Olympus 公司；體式顯微鏡（SZX16 型），日本Olympus公司；掃描電子顯微鏡（SEM，TM3030型），日立高新技術(shù)公司；X 射線電子能譜分析儀（XPS，XSAM 800 型），英國(guó)曼徹斯特Kratos 公司；紫外光譜儀（UV-2700 型），日本島津儀器公司；水平拉針儀（P-97），美國(guó)Sutter 公司；顯微斷針儀（MF-830），日本Narishige公司。
1.2 微流控裝置的構(gòu)建
制備PAM-AA微顆粒所用的玻璃毛細(xì)管微流控裝置結(jié)構(gòu)如圖1(a)所示。該單級(jí)微流控裝置主要由注射管、方形管和接收管三部分組成。其中，方形管為橫截面外徑為1.4mm、內(nèi)徑為1.0mm的方形玻璃管，而注射管和接收管均是外徑為960μmol/L、內(nèi)徑為550μmol/L的圓柱形玻璃管。其中，注射管的一端經(jīng)過(guò)水平拉針儀和顯微斷針儀加工為錐形，其錐口內(nèi)徑為100μmol/L。將上述方形玻璃管和圓形玻璃管如圖1(a)所示組裝起來(lái)，并使用環(huán)氧樹脂膠將裝置黏合、固定在玻片上，從而構(gòu)建得到用于制備PAM-AA微顆粒的微流控裝置。
1.3 PAM-AA微顆粒的微流控制備
將2g AM、200μL AA、0.1g BIS 以 及60mg HMPP 加入到10mL 去離子水中，并將溶液充分?jǐn)嚢杈鶆蜃鳛榉稚⑾?；使用含?g T154、0.2g HMPP的20g 正十二烷作為連續(xù)相。如圖1(a)所示，使用注射泵將分散相和連續(xù)相溶液分別以20μL/min 和200μL/min 的流速注射進(jìn)微流控裝置相應(yīng)的玻璃管微通道內(nèi)，從而使得分散相在注射管錐口處被連續(xù)相剪切形成均一的液滴。將液滴接入與連續(xù)相組成相同的接收液中，并在紫外光下照射10min，使得液滴中的AM 與AA 聚合形成PAM-AA 水凝膠微顆粒。將制得的微顆粒用石油醚清洗兩次，再用異丙醇清洗兩次以洗掉其中的正十二烷，最后利用去離子水洗滌兩次，從而得到PAM-AA微顆粒。
1.4 HRP@ZIF-8/PAM-AA微顆粒的制備
將上述制備得到的PAM-AA 微顆粒加入到含有0.405g Zn(NO)·6HO、20mg HRP 的4mL 去離子水中，震蕩10min，使溶液中的Zn與PAM-AA 的羧基充分螯合。然后，加入20mL Hmim 水溶液（1.25mol/L），并在恒溫振蕩器（溫度設(shè)置為10℃）中震蕩反應(yīng)10min。反應(yīng)完成后，將所得微顆粒用去離子水多次洗滌，并經(jīng)過(guò)濾得到HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒。該微顆粒經(jīng)凍干后置于干燥柜中儲(chǔ)存待用。
1.5 乳液及微顆粒的形貌結(jié)構(gòu)和組成表征
利用工業(yè)顯微鏡和體式顯微鏡對(duì)W/O 乳液以及微顆粒的形貌進(jìn)行觀察，并對(duì)微顆粒的粒徑進(jìn)行測(cè)量，利用式(1)計(jì)算乳液以及微顆粒的變異系數(shù)（）。
使用SEM 對(duì)干燥后的HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒表面以及剖面處的微觀形貌結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。利用X 射線光電子能譜儀（XPS） 對(duì)干燥后的HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒進(jìn)行元素分析。利用熱重分析儀（TGA）測(cè)試HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒中HRP@ZIF-8 的負(fù)載量。稱取5～8mg 干燥的HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒樣品置于坩堝中并放入TGA 進(jìn)行測(cè)試。參數(shù)設(shè)置為：在氮?dú)夥諊?，溫度?5℃以10℃/min 的升溫速度升高到800℃。在相同的測(cè)試條件下測(cè)試PAM-AA 微顆粒的質(zhì)量變化，導(dǎo)出質(zhì)量變化數(shù)據(jù)并作出質(zhì)量變化圖，對(duì)比兩種曲線計(jì)算出HRP@ZIF-8的負(fù)載量。
1.6 HRP@ZIF-8/PAM-AA微顆粒的催化性能
利用ABTS 顯色反應(yīng)對(duì)HRP@ZIF-8/PAM-AA微顆粒的催化活性進(jìn)行表征。在HRP 的催化作用下，HO可將ABTS 的銨鹽轉(zhuǎn)化為陽(yáng)離子自由基ABTS（顯黃綠色）。由于ABTS在415nm 處有強(qiáng)烈的光吸收，因此可利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)反應(yīng)液在415nm處的吸光度大小來(lái)反映溶液中ABTS的濃度，并由此確定HRP的催化效率。取10mg干燥的HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒加入到裝有4.8mL PBS緩沖液（0.1mol/L，pH=7.4，547μmol/L ABTS）的棕色試劑瓶中，將溶液搖勻使微顆粒均勻分散。將100μL 的NaHPO-KHPO緩 沖 液（0.2mol/L，pH=6.0）以及100μL HO（1%）加入到上述溶液中，并使用紫外分光光度計(jì)中測(cè)試該溶液在415nm處的吸光度，自反應(yīng)60s 開始每隔120s 取一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)。
在制備得到HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒后，每隔24h 取出10mg 樣品測(cè)試其催化活性，以表征其在常溫常壓下的儲(chǔ)存性能。催化活性的測(cè)試方法同上，待反應(yīng)5min 后利用紫外分光光度計(jì)測(cè)試反應(yīng)液在415nm的吸光度。
此外，利用ABTS 顯色反應(yīng)法測(cè)試HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒的環(huán)境耐受性。分別稱取10mg HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒，均勻分散到裝有4.8mL PBS 緩沖液（0.1mol/L，pH=7.4，547μmol/L ABTS）的三個(gè)棕色試劑瓶。將三份溶液分別置于80℃恒溫水浴槽、UV 光照、胰蛋白酶三種條件下處 理30min 后，分 別 加 入100μL 的NaHPO-KHPO（0.2mol/L，pH=6.0） 緩 沖 液 以 及100μL HO（質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%），反應(yīng)5min 后檢測(cè)反應(yīng)液在415nm處的吸光度。
2 結(jié)果與討論
2.1 HRP@ZIF-8/PAM-AA微顆粒的形貌尺寸
微流控技術(shù)可控產(chǎn)生的乳液液滴微具有均一尺寸的特點(diǎn)，這為功能微顆粒的構(gòu)建提供了良好模板。本實(shí)驗(yàn)中，采用了微流控裝置可控產(chǎn)生的單分散W/O 乳液液滴作為模板來(lái)構(gòu)建PAM-AA 微顆粒。如圖2(a)所示為用于制備該P(yáng)AM-AA微顆粒的W/O乳液的光學(xué)顯微鏡圖片，從圖中可以看出，從微流控裝置中產(chǎn)生得到的W/O 乳液呈球狀，無(wú)色透明且大小均一。以該乳液液滴為模板，通過(guò)紫外光照引發(fā)液滴中的單體AM 和AA 發(fā)生聚合，可制備得到尺寸與液滴模板相當(dāng)?shù)腜AM-AA 微顆粒。如圖2(b)所示為PAM-AA 微顆粒的光學(xué)顯微鏡圖片，從圖中可以看出，該微顆粒保持了良好的球形度，且具有均一的尺寸。如圖2(c)所示，W/O乳液液滴的平均粒徑為468.02μm，值為1.70%，這說(shuō)明乳液具有良好的單分散性。此外，相較于圖2(a)中的W/O乳液，置于水相中的PAM-AA微顆粒粒徑明顯增大，其平均粒徑增加為501.64μm。這是由于凝膠微顆粒內(nèi)AA的存在使得微顆粒含有大量親水的羧基，因此使得微顆粒吸水能力增強(qiáng)，最終導(dǎo)致微顆粒更加溶脹、粒徑增加。
圖2 W/O乳液液滴及PAM-AA微顆粒的光學(xué)顯微鏡圖以及粒徑分布圖
如圖3(a)所示HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒的光學(xué)顯微鏡圖。與圖2(b)中未負(fù)載HRP@ZIF-8 的空白PAM-AA 微顆粒相比較，負(fù)載HRP@ZIF-8 后的HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒由無(wú)色變?yōu)樽厣彝该鞫冉档?。這是由于HRP@ZIF-8 納米顆粒的存在降低了PAM-AA 微顆粒的透明度，說(shuō)明HRP@ZIF-8 成功地接枝到凝膠微顆粒上。此外，HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒的粒徑分布如圖3(b)所示，從圖中可以看出，該微顆粒的粒徑呈現(xiàn)出正態(tài)分布，其平均粒徑為559.97μm、值為2.17%，仍具有良好的單分散性。相比于PAM-AA 微顆粒，HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒的粒徑增加主要是由于其內(nèi)部負(fù)載填充了HRP@ZIF-8納米顆粒所致。
圖3 HRP@ZIF-8/PAM-AA微顆粒的光學(xué)顯微鏡圖及粒徑分布圖
2.2 HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒的微觀結(jié)構(gòu)組成
HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒的SEM 形貌表征結(jié)果如圖4(a)所示。從圖中可以觀察到HRP@ZIF-8/PAM-AA微顆粒表面為多孔的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這種多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可促進(jìn)催化過(guò)程中反應(yīng)物質(zhì)在微顆粒中的傳遞，有利于HRP@ZIF-8催化反應(yīng)的順利進(jìn)行。此外，該微顆粒呈現(xiàn)出非球形結(jié)構(gòu)，這是由于在液氮中冷凍的過(guò)程中冰晶沿著微顆粒內(nèi)部的生長(zhǎng)方向不均勻，因此導(dǎo)致微顆粒形貌改變。圖4(b)所示為HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒表面的放大結(jié)構(gòu)，從該圖中可以看出，由于PAM-AA 凝膠網(wǎng)絡(luò)上原位生長(zhǎng)了HRP@ZIF-8 納米顆粒，因而使得其表面粗糙度增加。同時(shí)，從如圖4(c)所示HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒斷面的SEM 圖可看出，微顆粒內(nèi)部亦呈現(xiàn)多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，但從微顆粒剖面處的放大SEM 圖[ 圖4(d)] 中 可 看 出， 微 顆 粒 內(nèi) 部 的HRP@ZIF-8 納米顆粒含量明顯降低。該結(jié)果說(shuō)明HRP@ZIF-8納米顆粒主要負(fù)載到了微顆粒的表面，這更有利于HRP@ZIF-8納米顆粒與底物充分接觸，促進(jìn)催化反應(yīng)進(jìn)行。此外，微顆粒在800r/min的轉(zhuǎn)速下經(jīng)機(jī)械攪拌1h 后，仍能保持良好的球形度，這說(shuō)明微顆粒具有良好的機(jī)械強(qiáng)度，能夠適用于機(jī)械攪拌過(guò)程。
圖4 HRP@ZIF-8/PAM-AA微顆粒的SEM圖
HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒的XPS 表征結(jié)果如圖5 所示。從圖5 中可以看出，微顆粒在285.35mV、399.75mV、531.9mV、1022.1mV 以及1045.2mV 有明顯的出峰。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)的光電子能譜圖相對(duì)照分析可知，在285.35mV 處峰為C 1s 的峰，在399.75mV 處峰為N 1s 的峰，在531.9mV 處的為O 1s；而在1022.1mV和1045.2mV出現(xiàn)兩個(gè)峰分別代表Zn 2p3/2和Zn 2p1/2的峰；兩種不同的峰出現(xiàn)是因?yàn)槲㈩w粒上存在Zn—N鍵以及與羧基螯合的Zn，這說(shuō)明HRP@ZIF-8成功地負(fù)載到了PAMAA微顆粒上。
圖5 HRP@ZIF-8/PAM-AA微顆粒的XPS分析圖
HRP@ZIF-8/PAM-AA 微 顆粒以及PAM-AA 微顆粒的熱重分析表征結(jié)果如圖6所示。在溫度小于400℃時(shí)，兩條曲線幾乎重合，其質(zhì)量的降低主要是由于凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的水分揮發(fā)以及凝膠網(wǎng)絡(luò)的破壞、熱解；而當(dāng)溫度超過(guò)400℃之后，微顆粒的質(zhì)量減緩降低，凝膠結(jié)構(gòu)基本熱解完畢。當(dāng)溫度升高至450℃以后，ZIF-8 結(jié)構(gòu)逐漸被破壞、熱解，通過(guò)計(jì)算HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒和PAM-AA微顆粒在450℃位置處的質(zhì)量差即可估算出為微顆粒中HRP@ZIF-8 納米顆粒的負(fù)載量。計(jì)算結(jié)果表明HRP@ZIF-8 納米顆粒在微顆粒中的負(fù)載量約為14%。
圖6 HRP@ZIF-8/PAM-AA微顆粒的熱重分析
2.3 HRP@ZIF-8/PAM-AA微顆粒的酶催化活性
如圖7 所示為分別含有HRP@ZIF-8/PAM-AA微顆粒以及PAM-AA 微顆粒的反應(yīng)液在415nm 處的吸光度隨時(shí)間變化的曲線。從圖7 中可以看出，含PAM-AA 微顆粒的反應(yīng)液在415nm 處的吸光度無(wú)明顯變化，一直維持在零，說(shuō)明PAM-AA 微顆粒由于不含HRP@ZIF-8 納米顆粒而不具備催化性能。相比之下，含HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒的反應(yīng)液在415nm處的吸光度隨著時(shí)間的增大而呈正比地增加，且擬合優(yōu)度（）為0.9924。這說(shuō)明HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒具有良好的催化性能，能將ABTS 的銨鹽轉(zhuǎn)化為了ABTS。此外，通過(guò)減小顆粒尺寸可以增大微顆粒的比表面積、減小傳質(zhì)路徑，從而通過(guò)傳質(zhì)強(qiáng)化進(jìn)一步提高酶的催化活性和表觀反應(yīng)速率。由于該微顆粒的尺寸主要決定于W/O 乳液液滴的尺寸，因此可利用通過(guò)調(diào)節(jié)微流控裝置的微通道尺寸和液相流速等手段來(lái)減小W/O乳液液滴的尺寸，從而減小微顆粒的尺寸，進(jìn)一步提升其催化性能。
圖7 含HRP@ZIF-8/PAM-AA微顆粒及PAM-AA微顆粒的反應(yīng)液在415nm處的吸光度隨時(shí)間的變化
2.4 HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒的儲(chǔ)存性能和環(huán)境耐受性
如圖8(a)所示為HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒在常溫下的酶相對(duì)活性隨時(shí)間的變化。從圖8(a)中可以看出，隨著時(shí)間由1 天逐漸延長(zhǎng)至7 天，HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒的酶相對(duì)活性基本維持不變。這說(shuō)明HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒中ZIF-8 的微孔結(jié)構(gòu)可以對(duì)HRP 起到良好的保護(hù)作用，有利于酶的長(zhǎng)期保存。如圖8(b)所示為HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒在不同處理?xiàng)l件下的酶相對(duì)活性。從圖8(b)中可以看出，相比于常溫常壓條件下的HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒，經(jīng)80℃處理后的HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒仍能保持約75%的活性；同時(shí)，分別經(jīng)過(guò)紫外線照射處理或者胰蛋白酶處理后的HRP@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒亦可保持75%以上的活性。上述結(jié)果說(shuō)明，ZIF-8的微孔結(jié)構(gòu)可有效地保護(hù)HRP，使其能經(jīng)受熱處理、紫外線處理以及胰蛋白酶處理的苛刻處理?xiàng)l件，展現(xiàn)出良好的環(huán)境耐受性。這主要是因?yàn)椋琙IF-8材料的微孔結(jié)構(gòu)對(duì)酶分子的空間結(jié)構(gòu)具有“限域”作用，使酶即使在外界條件改變的情況下其具有活性的優(yōu)勢(shì)空間結(jié)構(gòu)亦能得到很好的保護(hù)，從而提高了酶的穩(wěn)定性和環(huán)境耐受性。
圖8 HRP@ZIF-8/PAM-AA微顆粒的儲(chǔ)存性能和環(huán)境耐受性能
3 結(jié)論
綜上所述，本文基于微流控法可控制備得到均一PAM-AA 微顆粒，利用仿生物礦化法在該微顆粒的水凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中原位生長(zhǎng)酶@ZIF-8 納米顆粒，成功構(gòu)建了酶@ZIF-8/PAM-AA 微顆粒。該微顆粒的表面富集有酶@ZIF-8 納米顆粒，而ZIF-8納米顆粒的微孔結(jié)構(gòu)可有效保護(hù)內(nèi)部封裝的酶，使其在保持良好催化活性的同時(shí)，能有效地經(jīng)受熱處理、紫外照射、胰蛋白酶處理等條件的影響，具有良好的儲(chǔ)存性能和環(huán)境耐受性。該研究工作為新型酶固定化功能微顆粒的設(shè)計(jì)構(gòu)建提供了新的策略。
