李占君 劉運(yùn)偉 王洪學(xué) 王巖 房柱 興成彬

摘 要：為研究一種超聲誘導(dǎo)促進(jìn)防風(fēng)種子發(fā)芽的方法，本文以超聲時(shí)間、超聲功率、水浴溫度、超聲頻率以及浸種時(shí)間展開單因素影響實(shí)驗(yàn)。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上運(yùn)用PBD（Plackett-Burman Design）進(jìn)行關(guān)鍵因素的篩選，通過爬坡實(shí)驗(yàn)得出關(guān)鍵因素的中心點(diǎn)。結(jié)合BBD（Box-Behnken Design）響應(yīng)面優(yōu)化關(guān)鍵因素條件，最終得出最佳超聲誘導(dǎo)防風(fēng)種子發(fā)芽因素為：超聲時(shí)間16 min、超聲功率62 W、水浴溫度 35 ℃、超聲頻率40 Hz和浸種時(shí)間2 d， 且預(yù)期發(fā)芽率和預(yù)期發(fā)生概率分別為68.21%和98.70%。該條件下防風(fēng)種子發(fā)芽率為65.66%，其相對(duì)誤差為3.74%。最佳超聲誘導(dǎo)條件實(shí)驗(yàn)組與空白組相比，其發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)均優(yōu)于空白組，且發(fā)芽率最終提升了29.71%。超聲誘導(dǎo)處理與空白組種皮掃描電鏡結(jié)果得知，種皮條紋裂隙阻塞程度與通透性會(huì)因超聲過程中所產(chǎn)生的“空化效應(yīng)”的作用得到較大程度的改善。研究表明適宜超聲誘導(dǎo)處理對(duì)防風(fēng)種子的萌發(fā)具有積極促進(jìn)作用。

關(guān)鍵詞：PBD;BBD;超聲誘導(dǎo);防風(fēng)種子;發(fā)芽率;種皮微觀結(jié)構(gòu)

中圖分類號(hào)：S723.1+31.1;S718.3?? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? 文章編號(hào)：1006-8023（2022）01-0076-10

Optimization of Ultrasonic Induced Germination of Saposhnikovia divaricate

Seeds Based on Plackett-Burman and Box-Behnken Design

LI Zhanjun1， LIU Yunwei1， WANG Hongxue1， WANG Yan2， FANG Zhu1， XING Chengbin1

（1.Yichun Branch of Heilongjiang Academy of Forestry， Yichun 153000， China;

2.Heilongjiang Academy of Forestry， Harbin 150081， China）

Abstract：In order to study a method of promoting seed germination of Saposhnikovia divaricate seed by ultrasonic induction， in this article， single factor experiments were carried out based on ultrasonic time， ultrasonic power， water bath temperature， ultrasonic frequency and seed soaking time. Based on the single factor experiment， Plackett-Burman Design （PBD） was used to screen the key factors， and the central point of the key factors was obtained through the climbing experiment. Optimize key factors and conditions in combination with Box-Behnken Design （BBD） response surface， the best ultrasonic-induced seed germination factors of the Saposhnikovia divaricata seed were： ultrasonic time 16 min， ultrasonic power 62 W， water bath temperature 35 ℃， ultrasonic frequency 40 Hz， seed soaking time 2 d， and the expected germination rate and expected occurrence probability were 68.21% and 98.70%， respectively. Under this condition， the germination rate of Saposhnikovia divaricate seed was 65.66%， the relative error was 3.74%. Compared with the CK group， the germination rate， germination potential and germination index of the experimental group were better than those of the CK group， and the germination rate was finally increased by 29.71%. The results of ultrasonic induction treatment and scanning electron microscope of CK seed coat showed that the blockage degree and permeability of seed coat stripe cracks could be greatly improved by "cavitation effect" produced in the process of ultrasound. Research showed that ultrasonic treatment had a positive effect on Saposhnikovia divaricate seed germination.

Keywords：PBD; BBD; ultrasonic induction; Saposhnikovia divaricate seed; germination rate; seed coat microstructure

0 引言

中草藥防風(fēng)（Saposhnikovia divaricata （Trucz.） Schischk）為傘形科，防風(fēng)屬，多年生草本植物[1-2]。我國古代人們很早就應(yīng)用防風(fēng)治療一些病癥，具有久遠(yuǎn)的發(fā)展史，其自身對(duì)外界生存環(huán)境具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力，主要分布于我國的北方平原和半山區(qū)[3]。防風(fēng)植株根部含有大量的藥用活性成分，現(xiàn)階段經(jīng)有效分離鑒定出的有活性成分有100余種，其中代表性活性成分包括：有機(jī)酸、色原酮、香豆素、甘露類以及淄醇類化合物等[4- 5]。醫(yī)藥領(lǐng)域主要以未抽花植株的干燥根入藥，進(jìn)行病癥的治療[6]。

相關(guān)研究表明，防風(fēng)中所含有效活性成分具有較好的抗氧化能力，是一種天然性抗氧化劑，在食品、制藥領(lǐng)域扮演重要的角色，同時(shí)也被作為大宗藥材廣泛應(yīng)用于抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、抑菌以及解熱等多種病癥，具有重要的作用和意義[7-8]。由于防風(fēng)藥用價(jià)值較高，而藥用防風(fēng)主要以野生防風(fēng)為主，致使防風(fēng)藥用資源被過度的開發(fā)與應(yīng)用，而防風(fēng)種子主要通過收集野生防風(fēng)種子的形式獲得，致使現(xiàn)階段我國野生防風(fēng)資源遭受嚴(yán)重破壞，野生防風(fēng)資源儲(chǔ)備已遠(yuǎn)不能滿足中醫(yī)藥領(lǐng)域的需求[9-10]。國內(nèi)外相關(guān)研究人員，對(duì)防風(fēng)藥用資源現(xiàn)狀以及人工培育已展開的工作進(jìn)行了研究和探討，其人工培育方式有：種子直播、幼苗移栽和根段營養(yǎng)繁殖等[11-12]。防風(fēng)中有效活性成分會(huì)因人工培育方式的不同而有顯著性差異，目前種子培育過程中常規(guī)方式為直播培育[13]。由于東北防風(fēng)自身生理原因，種子內(nèi)部種胚需要經(jīng)過后熟作用才能進(jìn)行育種，此過程對(duì)防風(fēng)的人工育種帶來了不可避免的限制和影響，因此防風(fēng)的人工育種方法急需優(yōu)化、改進(jìn)。適宜的超聲對(duì)種子萌發(fā)具有積極促進(jìn)作用，而現(xiàn)階段國內(nèi)未見超聲誘導(dǎo)防風(fēng)種子萌發(fā)相關(guān)性研究報(bào)道，種子發(fā)芽的研究主要集中在單純性單因素處理，較為簡單、系統(tǒng)性不強(qiáng)，未能對(duì)各影響因素進(jìn)行互擾、線性工藝的優(yōu)化。應(yīng)用PBD （Plackett-Burman Design）可對(duì)各影響因素分析，篩選出主要關(guān)鍵性影響因素;結(jié)合BBD（Box-Behnken Design）對(duì)篩選得出的主要關(guān)鍵性因素予以回歸方程的擬合、分析，通過優(yōu)化得到最佳影響參數(shù)。

本實(shí)驗(yàn)主要研究超聲波刺激誘導(dǎo)防風(fēng)種子的發(fā)芽的方法，對(duì)影響種子發(fā)芽的影響因素進(jìn)行分析與研究。實(shí)驗(yàn)過程中，以超聲時(shí)間（min）、超聲功率（W）、超聲水浴溫度（℃）、超聲頻率（Hz）和浸種時(shí)間（d）為單因素實(shí)驗(yàn);對(duì)單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了PBD分析;根據(jù)Pareto chart和各影響因素的貢獻(xiàn)率篩選出3個(gè)關(guān)鍵因素：超聲時(shí)間（min）、超聲功率（W）和超聲水浴溫度（℃） 。對(duì)這3個(gè)關(guān)鍵因素進(jìn)行BBD優(yōu)化，最終得出超聲誘導(dǎo)防風(fēng)種子發(fā)芽的因素參數(shù)。對(duì)最佳超聲條件下的防風(fēng)種子指標(biāo)系數(shù)進(jìn)行了測(cè)定。應(yīng)用掃描電鏡（SEM）對(duì)超聲誘導(dǎo)處理前、后的防風(fēng)種皮微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行鏡檢對(duì)比與分析。研究成果能為防風(fēng)種子及其他植物種子的人工育種提供科學(xué)的理論和實(shí)驗(yàn)性參考。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

優(yōu)等東北防風(fēng)種子，2019年9月采收于內(nèi)蒙古海拉爾;脫脂棉、培養(yǎng)皿、濾紙、鑷子、解剖剪、無水乙醇、超純水、4%次氯酸鈉溶液等。

1.2 儀器

恒溫培養(yǎng)箱（MJ-500-11，上海一恒科技有限公司）;臺(tái)式數(shù)控超聲波清洗器（KQ-100DE，昆山市超聲儀器有限公司），凈化工作臺(tái)（SW-CJ-2FD，蘇州廣源凈化科技有限公司）;超純水機(jī)（CMPL-TP-40L，成都優(yōu)越科技有限公司）;理化干燥箱（LG100B，上海儀器總廠）;其他儀器玻璃器皿（天津化學(xué)玻璃儀器廠）;掃描電鏡（EVO 18，德國蔡司）等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 種子的處理實(shí)驗(yàn)

預(yù)處理實(shí)驗(yàn)：取適量防風(fēng)種子，40 ℃溫水分別浸種0、1、2、3 d。

空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)（CK）：以40 ℃溫水浸泡1 d的種子為研究對(duì)象，75 %乙醇溶液浸泡20 s，同時(shí)滅菌純水沖洗3次;再配合4% NaClO溶液浸泡1 min，滅菌純水沖洗3次，50粒/組置于9 cm培養(yǎng)皿中（1.5%脂、水培養(yǎng)基做床），置于恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃，相對(duì)濕度 60%暗培養(yǎng)，24 h后開始記錄，記錄頻率為24 h/次。

超聲誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)：取適量經(jīng)預(yù)處理的防風(fēng)種子，置于5 cm×10 cm加厚自封袋（袋中以滅菌水為超聲傳輸介質(zhì)浸泡種子）做超聲誘導(dǎo)處理。待超聲誘導(dǎo)處理完畢，再以75%乙醇溶液浸泡20 s，同時(shí)滅菌純水沖洗3次;再配合4% NaClO溶液浸泡1 min，滅菌純水沖洗3次，50粒/組置于9 cm培養(yǎng)皿中（1.5%瓊脂、水培養(yǎng)基），置于恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃，相對(duì)濕度 70 %暗培養(yǎng)，24 h后開始記錄，記錄頻率為24 h/次，連續(xù)3 d無發(fā)芽視為實(shí)驗(yàn)終止。

2.2 單因素分析

2.2.1 超聲時(shí)間

溫水浸種1 d （40 ℃），再將種子浸泡于滅菌水介質(zhì)中，超聲功率80 W，超聲水浴溫度40 ℃，超聲頻率40 Hz，研究不同超聲時(shí)間5、10、15、20、25 min對(duì)種子發(fā)芽率的影響。

2.2.2 超聲功率

溫水浸種1 d （40 ℃），再將種子浸泡于滅菌水介質(zhì)中，超聲時(shí)間15 min，超聲水浴溫度40 ℃，超聲頻率40 Hz，研究不同超聲功率40、60、80、100 W對(duì)種子發(fā)芽率的影響。

2.2.3 超聲水浴溫度

溫水浸種1 d （40 ℃），再將種子浸泡于滅菌水中，超聲時(shí)間15 min，超聲功率80 W，超聲頻率40 Hz，研究不同超聲水浴溫度30、35、40、45、50 ℃對(duì)種子發(fā)芽率的影響。

2.2.4 浸種時(shí)間

種子浸泡于滅菌水介質(zhì)中，超聲時(shí)間15 min，超聲功率80 W，超聲水浴溫度40 ℃，超聲頻率40 Hz，研究不同浸種時(shí)間0、1、2、3 d對(duì)種子發(fā)芽率的影響。

2.2.5 超聲頻率

溫水浸種1 d （40 ℃），再將種子浸泡于滅菌水介質(zhì)中，超聲時(shí)間15 min，超聲功率80 W，超聲水浴溫度40 ℃，研究不同超聲頻率40、60、80、100 Hz對(duì)種子發(fā)芽率的影響。

2.3 PBD 析因?qū)嶒?yàn)

以單因素實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，防風(fēng)種子發(fā)芽率為響應(yīng)值，對(duì)超聲時(shí)間、超聲功率、水浴溫度、超聲頻率和浸種時(shí)間這5個(gè)因素進(jìn)行分析和評(píng)價(jià)，PBD析因?qū)嶒?yàn)共12組，其因素水平見表1。

2.4 實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

結(jié)合BBD對(duì)PBD實(shí)驗(yàn)篩選出的關(guān)鍵性影響因素進(jìn)一步進(jìn)行響應(yīng)面的三因素三水平的優(yōu)化和分析。

2.5 防風(fēng)種子相關(guān)播種指標(biāo)的測(cè)定

千粒質(zhì)量（g）采用電子天平稱取。

發(fā)芽率=（發(fā)芽總數(shù)/供試種子數(shù)）×100%。

發(fā)芽勢(shì)=（7 d內(nèi)發(fā)芽總數(shù)max/供試種子數(shù)）×100%。

發(fā)芽指數(shù)（Gi） = Σ Gt /Dt （Gt 為浸種t 后天的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)）[14]。

2.6 微觀結(jié)構(gòu)對(duì)比與分析

為了能夠更好地對(duì)比超聲預(yù)處理和空白（CK）種子之間的差異，用掃描電鏡（SEM）觀察了防風(fēng)種皮空間的微觀結(jié)構(gòu)。10 μm導(dǎo)電金濺射膜分別涂于樣品表面，5.0 kV加速電壓高真空環(huán)境下鏡檢。

2.7 數(shù)據(jù)處理

在研究過程中，所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均取實(shí)際數(shù)據(jù)的算術(shù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。運(yùn)用Origin 9.0軟件處理單因素實(shí)驗(yàn)折線圖，其中PBD因素篩選實(shí)驗(yàn)和BBD優(yōu)化實(shí)驗(yàn)均通過Design Expert 8.0.6軟件得以實(shí)現(xiàn)。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素影響實(shí)驗(yàn)

3.1.1 超聲時(shí)間

在一定范圍內(nèi)超聲時(shí)間對(duì)防風(fēng)種子的發(fā)芽率具有一定程度的影響，如圖1（a）所示。當(dāng)超聲時(shí)間不足20 min時(shí)，防風(fēng)種子的發(fā)芽率會(huì)因超聲時(shí)間的增加而得到較大程度的提升;當(dāng)超聲時(shí)間為20 min時(shí)，此時(shí)防風(fēng)種子發(fā)芽率最高;當(dāng)時(shí)間在20～25 min時(shí)，防風(fēng)種子的發(fā)芽率開始變小。這主要因?yàn)?，防風(fēng)種子內(nèi)部質(zhì)膜會(huì)因超聲時(shí)間過長而受到不可逆轉(zhuǎn)的損傷，超聲時(shí)間過長對(duì)發(fā)芽起到抑制性作用[15]。因此以超聲時(shí)間10～20 min進(jìn)行分析優(yōu)化。

3.1.2 超聲功率

由圖1（b）可知，適宜的超聲功率對(duì)防風(fēng)種子的發(fā)芽率具有一定程度的促進(jìn)作用。當(dāng)超聲功率低于80 W時(shí)，防風(fēng)種子的發(fā)芽率會(huì)因超聲功率的加強(qiáng)而得到較大程度的提升;當(dāng)超聲功率為80 W時(shí)，此時(shí)防風(fēng)種子發(fā)芽率最高;當(dāng)處理功率在 80～100 W時(shí)，防風(fēng)種子的發(fā)芽率開始有走低的現(xiàn)象發(fā)生。主要原因在于，高強(qiáng)度的超聲作用會(huì)使得防風(fēng)種子內(nèi)部質(zhì)膜受到非逆轉(zhuǎn)性的損傷，高強(qiáng)度超聲作用對(duì)發(fā)芽起到抑制性作用[16-17]。選擇40～80 W范圍進(jìn)行下步優(yōu)化。

3.1.3 超聲水浴溫度

由圖1（c）分析得出，適宜的超聲水浴溫度可以促進(jìn)防風(fēng)種子的發(fā)芽。當(dāng)超聲水浴溫度低于40 ℃時(shí)，防風(fēng)種子的發(fā)芽率會(huì)因超聲水浴溫度的升高而得到較大程度的提升;當(dāng)超聲水浴溫度為40 ℃時(shí)，此時(shí)防風(fēng)種子發(fā)芽率的提升幅度最大;當(dāng)水浴溫度在 40～50 ℃時(shí)，種子的發(fā)芽率開始有降低的趨勢(shì)發(fā)生。主要原因在于適宜的超聲水浴溫度，有利于提高防風(fēng)種子自身的持水性，種子活性得到加強(qiáng)，進(jìn)而種子的發(fā)芽率會(huì)得到提升[17]。因此以30～40 ℃范圍進(jìn)行工藝的優(yōu)化研究。

3.1.4 超聲頻率

超聲頻率對(duì)防風(fēng)種子的發(fā)芽特性具有顯著的影響，適宜的超聲頻率對(duì)防風(fēng)種子有助于發(fā)芽。由圖1（d）可知，當(dāng)超聲頻率低于40 Hz時(shí)，防風(fēng)種子的發(fā)芽率會(huì)因超聲頻率的增加而呈遞增的趨勢(shì);其中以超聲頻率為40 Hz時(shí)，防風(fēng)種子的發(fā)芽率處于最佳值;當(dāng)超聲頻率為40～100 Hz時(shí)，防風(fēng)種子在該頻率范圍影響的情況下，會(huì)因超聲頻率過高而呈遞減的趨勢(shì)。主要原因在于，防風(fēng)種子會(huì)因超聲頻率過高，其內(nèi)部結(jié)構(gòu)會(huì)受到永久性損傷;適當(dāng)?shù)皖l范圍內(nèi)超聲處理對(duì)防風(fēng)種子的發(fā)芽具有一定程度促進(jìn)效應(yīng)，反之頻率過高會(huì)變?yōu)橐种芠18]。因此以頻率20～40 Hz進(jìn)行工藝的優(yōu)化研究。

3.1.5 浸種時(shí)間

浸種時(shí)間對(duì)防風(fēng)種子的發(fā)芽特性影響顯著，適當(dāng)?shù)慕N有利于種子的發(fā)芽。由圖1（e）可知，當(dāng)浸種時(shí)間少于2 d時(shí)，防風(fēng)種子的發(fā)芽率會(huì)因浸種時(shí)間的延長而呈遞增的趨勢(shì);其中以浸種時(shí)間為2 d時(shí)，防風(fēng)種子的發(fā)芽率處于最佳值;當(dāng)浸種時(shí)間為2～3 d范圍時(shí)，防風(fēng)種子會(huì)因浸種時(shí)間過長而呈遞減的趨勢(shì)。原因在于，適宜的浸種處理可以與所浸溶液進(jìn)行物質(zhì)循環(huán)，會(huì)使得溶液中對(duì)植物生長調(diào)節(jié)和營養(yǎng)消耗有幫助作用的物質(zhì)（無機(jī)鹽離子、小分子物質(zhì)）通過滲透作用進(jìn)入種子內(nèi)部，最終影響植物種子的發(fā)芽及各項(xiàng)生理代謝活動(dòng)[19]。因此以浸種1～2 d區(qū)間進(jìn)行工藝的優(yōu)化研究。

3.2 PBD關(guān)鍵因素的篩選

PBD實(shí)驗(yàn)是對(duì)研究過程中各影響因素進(jìn)行高低兩水平設(shè)計(jì)，通過對(duì)比分析兩水平因素存在的差異與實(shí)驗(yàn)整體差異二者之間的關(guān)系，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)判定因素的顯著性，最終能夠快速、有效地完成影響因素的篩選[20-21]。因此，在單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，對(duì)超聲時(shí)間（X1，min）、超聲功率（X2，W）、水浴溫度（X3，℃）、超聲頻率（X4，Hz）和浸種時(shí)間（X5，d）進(jìn)行PBD關(guān)鍵因素篩選，PBD編碼、實(shí)驗(yàn)值、方差分析（ANOVA）、貢獻(xiàn)率和擬合統(tǒng)計(jì)見表1—表4。

由表3、表4和圖2分析可知，根據(jù)各影響因素所對(duì)應(yīng)F分布可以得出影響防風(fēng)種子發(fā)芽率因素影響程度由大到小依次為：X1、X2、X3、X4、X5。其中，X1 （P < 0.01）對(duì)防風(fēng)種子發(fā)芽率影響表現(xiàn)為差異性極顯著;X2、X3 （0.01<P<0.05）為差異性顯著。篩選出關(guān)鍵因素X1 、X2 、X3 ，進(jìn)行BBD響應(yīng)面的設(shè)計(jì)、優(yōu)化和分析。R2=0.912 1、調(diào)整 R2 =0.838 9篩選擬合和線性程度高，預(yù)測(cè)值為91.21%，矯正系數(shù)為83.89%。為了能夠更好地完成實(shí)驗(yàn)，將X4和X5分別定值為40 Hz和2 d（圖2中T值為對(duì)應(yīng)T檢驗(yàn)值）。

3.4 關(guān)鍵因素的優(yōu)化

優(yōu)化實(shí)驗(yàn)對(duì)應(yīng)BBD編碼、實(shí)驗(yàn)值、方差分析（ANOVA）和擬合統(tǒng)計(jì)見表5—表8。

應(yīng)用響應(yīng)面Design-Expert V 8.0.6 （State East），遵循Box-Behnken原則，對(duì)表5中3影響因素超聲時(shí)間（min）、功率（W）、水浴溫度（℃）進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)過模型擬合、優(yōu)化，最終得出對(duì)應(yīng)回歸方程：

Y =+67.92+1.77X1+0.68X2+0.43X3-0.53X1X2+0.55X1X3+0.38X2X3-3.21X12-2.64X22-5.95X32

對(duì)表7回歸方程方差數(shù)據(jù)分析，影響響應(yīng)值Y的影響因素為：X1、X2、X3，X1X2、X1X3、X2X3，X12、X22、X32。通過F可以判定各類型影響因素的影響程度，其中非組合性和組合性影響因素的影響程度分別為：X1>X2>X3，X1X3>X1X2>X2X3和X32>X12>X22;其中，X1、X12、X22、X32表現(xiàn)為差異性極顯著（P<0.01），X2、X3、X1X2、X1X3、X2X3為不顯著（P>0.05）。失擬項(xiàng)差異性不顯著（P>0.05），由此可以證實(shí)該組優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的模型具有較高的擬合度，吻合性好。

R2 = 0.955 3、調(diào)整 R2 = 0.897 9說明優(yōu)化實(shí)驗(yàn)擬合模型的擬合和線性程度高，其預(yù)測(cè)值可達(dá)95.53%，矯正系數(shù)為89.79%。

圖3為關(guān)鍵因素RSM設(shè)計(jì)和優(yōu)化所對(duì)應(yīng)的3D傘狀圖，通過分析3D傘狀圖可以確定優(yōu)化關(guān)鍵因素的極值（最大、最小值）和中間值;下方2D平面等高線圖能夠在二維成像基礎(chǔ)上呈現(xiàn)三維關(guān)系，可以起到確定預(yù)期響應(yīng)水平變量的作用，進(jìn)而確切、直觀反映被優(yōu)化因素對(duì)響應(yīng)值Y（發(fā)芽率）的影響強(qiáng)度[20-21]。在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，以響應(yīng)值Y為Z軸，其他2個(gè)因素分別為X軸和Y軸擬合建立模型，分析和研究3D傘狀圖時(shí)以其中一因素設(shè)定為定值0。

對(duì)圖3（a）分析可知，在一定區(qū)間范圍內(nèi)防風(fēng)種子的發(fā)芽率會(huì)因影響因素X1和X2的提升而得到相應(yīng)程度的提高，當(dāng)發(fā)芽率達(dá)到最大值后伴有走低現(xiàn)象發(fā)生，同時(shí)因素X1、X2之間交互作用為差異性不顯著（P>0.05）。X1為16 min，X2為62 W，此時(shí)防風(fēng)種子發(fā)芽率對(duì)應(yīng)響應(yīng)值增量（Δ）狀態(tài)最佳。

同理，對(duì)圖3（b）、圖3（c）因素X1X3和X2X3分析，可以得出防風(fēng)種子發(fā)芽率對(duì)應(yīng)響應(yīng)值增量（Δ）狀態(tài)最佳時(shí)條件分別為：X1X3（16 min，35 ℃），X2X3（62 W，35 ℃），且X1、X3和X2、X3均為差異性不顯著（P>0.05）。以3D傘狀圖與縱軸的坡度（傾斜程度），可以得出組合影響因素X1X2、X1X3和X2X3中各因素影響程度，X1>X2，X1>X3， X2>X3，最終X1>X2>X3，與表7分析結(jié)果吻合。

3.5 工藝驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

應(yīng)用Origin 9.0和Design Expert 8.0.6軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)系統(tǒng)性地處理、分析與研究，最終響應(yīng)面擬合優(yōu)化得出影響防風(fēng)發(fā)芽各因素的最佳參數(shù)：超聲時(shí)間16 min、超聲功率62 W、水浴溫度 35 ℃、超聲頻率40 Hz和浸種時(shí)間2 d，預(yù)期發(fā)芽率為68.21%，預(yù)期發(fā)生概率為98.70%。最終得出發(fā)芽率的算術(shù)平均值為65.66%，相對(duì)誤差為3.74%，說明優(yōu)化實(shí)驗(yàn)成立，數(shù)據(jù)有效。

3.6 防風(fēng)種子相關(guān)播種指標(biāo)

表9分析可知，最佳超聲誘導(dǎo)條件實(shí)驗(yàn)組與空白組相比，其發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)均優(yōu)于空白組，且發(fā)芽率最終提升了29.71%。說明適宜超聲誘導(dǎo)處理對(duì)防風(fēng)種子的萌發(fā)具有積極促進(jìn)作用。

3.7 防風(fēng)種皮微觀結(jié)構(gòu)對(duì)比與分析

超聲處理防風(fēng)種子過程中，種子的種皮結(jié)構(gòu)發(fā)生了一系列變化。圖4為10.0、15.0 k倍數(shù)情況下空白對(duì)照和超聲誘導(dǎo)處理后種皮微觀結(jié)構(gòu)的掃描電鏡對(duì)比分析圖。由空白未處理的防風(fēng)種皮掃描電鏡圖4（a）觀察可知，未經(jīng)超聲處理情況下防風(fēng)種皮較厚，種皮表面條紋裂隙被種皮分泌的揮發(fā)油性等物質(zhì)填充（阻塞）[22]。種皮通透性不佳將會(huì)抑制種子生物活性，不利于種子自身與外界環(huán)境之間的物質(zhì)循環(huán)、能量流動(dòng)以及信息的傳遞（水分、空氣、光照、溫度）等，進(jìn)而不利于種子的萌發(fā)。

當(dāng)防風(fēng)種子經(jīng)過超聲誘導(dǎo)處理后，圖4（b）種皮條紋裂隙阻塞程度會(huì)因超聲過程中所產(chǎn)生的“空穴效應(yīng)”的作用得到較大程度的改善，進(jìn)而種皮通透性得到改善。防風(fēng)種子內(nèi)有效物質(zhì)（蛋白質(zhì)、酶類）的生物活性會(huì)得到一定程度的提高，種子內(nèi)部與外界環(huán)境之間的物質(zhì)循環(huán)、能量流動(dòng)以及信息的傳遞（水分、空氣、光照、溫度）等相應(yīng)得到改善，因此適當(dāng)?shù)某曌饔脤?duì)防風(fēng)種子的萌發(fā)具有積極促進(jìn)的作用[23]。

4 結(jié)論與討論

本研究以單因素實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，采用PBD法對(duì)防風(fēng)發(fā)芽的影響因素：超聲時(shí)間、超聲功率、水浴溫度、超聲頻率以及浸種時(shí)間進(jìn)行關(guān)鍵因素的篩選，得出關(guān)鍵因素超聲時(shí)間、超聲功率、水浴溫度。再以關(guān)鍵因素中心點(diǎn)展開BBD設(shè)計(jì)和優(yōu)化，最終優(yōu)化得出最佳影響因素條件為：超聲時(shí)間16 min、超聲功率62 W、水浴溫度 35 ℃、超聲頻率40 Hz和浸種時(shí)間2 d， 且預(yù)期發(fā)芽率和預(yù)期發(fā)生概率分別為68.21%和98.70%，該條件下防風(fēng)種子發(fā)芽率為65.66%，相對(duì)誤差為3.74%。

此外，又對(duì)防風(fēng)種子相關(guān)播種指標(biāo)（最佳超聲條件組和空白組）進(jìn)行了測(cè)定，得出超聲誘導(dǎo)處理過的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)均高于空白組，且發(fā)芽率最終提升了29.71%，說明適宜條件的超聲誘導(dǎo)對(duì)防風(fēng)種子的萌發(fā)具有積極促進(jìn)作用。運(yùn)用掃描電鏡對(duì)最佳超聲處理組電鏡對(duì)空白組的防風(fēng)種皮微觀結(jié)構(gòu)予以初步對(duì)比和分析，發(fā)現(xiàn)超聲處理后的種皮的條紋裂隙阻塞、通透程度均得到較大程度改善，因此有利于種子內(nèi)部與外界環(huán)境之間的物質(zhì)循環(huán)、能量流動(dòng)和信息的傳遞。進(jìn)一步說明適當(dāng)?shù)某曌饔脤?duì)防風(fēng)種子的萌發(fā)具有積極促進(jìn)的作用。

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