陳妍卉，劉軍亭，于 潛，劉久源，裴翊峰，龐富生，高棟鵬，董 浩,2*

（1. 吉林農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，吉林 長春 130118；2. 吉林農(nóng)業(yè)大學生物反應器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心/生命科學學院，吉林 長春 130118）

目前，動物傳染病的防治主要依賴于疫苗，而疫苗主要采用減毒疫苗或滅活疫苗。雖然減毒疫苗和滅活疫苗的研制技術成熟，但仍有較多的不足之處。減毒疫苗是選擇具有活性的無毒或毒力較弱的非致病性病原體所制成的疫苗，能夠誘導機體產(chǎn)生細胞免疫反應和體液免疫反應，但在接種后可能會出現(xiàn)毒力返強的現(xiàn)象[1]。因此，出于安全考慮，預防疾病一般首選滅活疫苗，但滅活疫苗在滅活后可能出現(xiàn)病毒滅活不全的現(xiàn)象。其次，病毒中和抗原決定簇可能在疫苗滅活時被破壞，難以中和抗體，免疫效果不如減毒疫苗[2-3]。綜上所述，如何制備一種高效率并且安全的誘導機體產(chǎn)生免疫應答的疫苗引起了越來越多研究學者的關注。

隨著蛋白質(zhì)組學、基因組學、代謝組學等深入研究，基因工程技術快速發(fā)展，疫苗研究方向逐漸從減毒疫苗和滅活疫苗過渡至基因工程疫苗。相比于傳統(tǒng)疫苗，基因工程疫苗能夠有效的誘導宿主產(chǎn)生免疫應答?；蚬こ桃呙缰饕藖唵挝灰呙?、合成肽疫苗和活載體疫苗[4]。

1950 年，Stasney 等發(fā)現(xiàn)在腫瘤細胞的染色質(zhì)中存在一段可以導致腫瘤惡化的基因，通過質(zhì)粒可將這段基因轉(zhuǎn)移到正常真核細胞中表達，表明所分離的DNA 可以傳遞給正常細胞并在細胞中表達[5]，該發(fā)現(xiàn)為活載體疫苗的研究奠定基礎?；钶d體疫苗是將病毒或細菌作為遞呈載體，相比于減毒疫苗或滅活疫苗，該類疫苗免疫效果更佳，并且可以插入多個外源基因，達到一針防多病的效果?；钶d體疫苗在防治動物傳染病和腫瘤等方面，具有良好的應用前景，逐漸成為當今疫苗研發(fā)的主要方向。本文從細菌活載體疫苗在預防疾病的優(yōu)劣勢、基本原理以及近年來的研究進展等方面概述，并針對目前常用的幾種細菌活載體的應用進行總結(jié)，為細菌活載體疫苗的研發(fā)提供參考。

1 細菌活載體疫苗概述

活載體疫苗主要包括病毒活載體疫苗和細菌活載體疫苗。目前用于病毒活載體疫苗的載體主要有腺病毒、皰疹病毒、慢病毒、痘病毒等。而用于細菌活載體疫苗的載體主要包括乳酸菌、卡介苗、沙門氏菌、大腸埃希菌（E. coli）等。1980 年，Schaffner首次發(fā)現(xiàn)，當重組E. coli和哺乳動物細胞共培養(yǎng)時，E.coli中攜帶的猴空泡病毒40（Simian Virus 40，SV40 virus）基因組能夠從E. coli中傳遞至哺乳動物細胞中[6]。1999 年，F(xiàn)enelly 等構(gòu)建攜帶麻疹病毒基因組的減毒鏈球菌菌株，通過鼻飼免疫能在小鼠體內(nèi)穩(wěn)定定植，并引起機體體內(nèi)Th1 型和Th2 型免疫應答[7]。Shat 等將攜帶人類免疫缺陷病毒Ⅰ型（Human immunodeficiency virus type 1，HIV-1）基因的減毒福氏志賀菌，鼻飼免疫小鼠后發(fā)現(xiàn)減毒福氏志賀菌能夠誘導小鼠體內(nèi)產(chǎn)生有效的免疫應答[8]。這幾個發(fā)現(xiàn)為細菌活載體疫苗的研究提供了新的方向和思路。

細菌活載體疫苗是一種新型疫苗，在過去十多年間發(fā)展快速。目前，以減毒傷寒沙門氏菌為遞呈載體的活載體疫苗應用最為廣泛，免疫后在機體內(nèi)能大量表達外源基因，從而刺激機體產(chǎn)生細胞免疫、體液免疫和黏膜免疫。除了減毒傷寒沙門氏菌外，乳酸菌作為一種食品級益生菌也被廣泛用于新型疫苗的研發(fā)中。

2 細菌活載體疫苗的優(yōu)缺點

近幾年，研究學者所制備的細菌活載體疫苗對豬鏈球菌2 型（SS2）、豬瘟、新城疫等動物疾病均獲得了較好的預防效果。不僅在動物疾病上，細菌活載體疫苗還在HIV、乙肝病毒、寄生蟲等人類疾病的防制領域被視為候選疫苗之一。

以細菌為遞呈載體的活載體疫苗在免疫方式、菌株培養(yǎng)、遞呈基因等方面有較多優(yōu)勢[9-10]，但在免疫過程中仍有不足之處，還需進一步的研究。首先，一些減毒的細菌在免疫機體后可能會出現(xiàn)毒力返強的現(xiàn)象，危害機體健康[11]。其次，由于細菌活載體疫苗免疫效率較低，因此需要長期試驗從而確定最佳免疫劑量和免疫周期來提高免疫效率。并且細菌活載體疫苗在免疫過程中對其免疫抗原可能具有一定的耐受性，導致免疫效果不佳，無法誘導機體產(chǎn)生免疫應答。目前，細菌活載體疫苗和病毒活載體疫苗作為主要的活載體疫苗種類，在預防疾病方面均有不同的優(yōu)缺點（表1），應根據(jù)實際情況選擇最優(yōu)最適合的活載體疫苗種類，將其免疫效果發(fā)揮至最佳水平。

表1 病毒活載體疫苗與細菌活載體疫苗的優(yōu)缺點

3 重組細菌活載體疫苗的基本原理

構(gòu)建重組細菌活載體疫苗的方式主要有以下兩種：（1）將外源基因插入至細菌染色體中；（2）將外源基因插入至細菌質(zhì)粒中。所構(gòu)建的重組細菌活載體疫苗通過口服或鼻飼免疫的方式進入機體消化道，進而在腸道中穩(wěn)定定植。細胞中的高爾基體邊緣凸起形成的初級囊泡，將細菌包裹在囊泡里遞呈至溶酶體中。溶酶體分泌水解酶溶解細菌，暴露出攜帶遺傳信息的質(zhì)粒，隨后通過囊泡轉(zhuǎn)移至細胞核，并在細胞核中將其抗原轉(zhuǎn)錄翻譯后遞呈至T 淋巴細胞，從而引起機體的免疫應答。

例如沙門氏菌攜帶含有抗原的質(zhì)粒進入機體后，從腸道轉(zhuǎn)移至腸道相關淋巴組織（GALT）中的抗原遞呈細胞（Antigen-presenting cell，APC）中，進而形成含沙門氏菌的囊泡。在囊泡的中沙門氏菌仍保持其活性，并且不斷增殖，隨后重組抗原通過沙門氏菌遞呈至宿主細胞胞質(zhì)中，避免腸道中的酶類對抗原的降解作用，進而引起機體細胞免疫和體液免疫[12]。沙門氏菌具有兩個III 型分泌系統(tǒng)，分別為SPI1-T3SS 和SPI12-T3SS[13]。其中SPI1-T3SS 分泌系統(tǒng)可以促進沙門氏菌侵入非吞噬細胞。SPI12-T3SS分泌系統(tǒng)可將經(jīng)過巨噬細胞和樹突狀細胞（DC）加工后的沙門氏菌遞呈至FliC 表位，從而刺激CD4+T 細胞的增殖和IFN-γ 的分泌，進而引起機體的細胞、體液或黏膜免疫[14]。

重組乳酸桿菌進入機體后能夠在胃腸道中穩(wěn)定定植，一般通過兩種途徑激活機體黏膜免疫系統(tǒng)（圖1）。一種是重組乳酸桿菌被腸道上皮細胞中緊密連接的樹突狀細胞所識別，加工后遞呈抗原。另一種為體內(nèi)派爾集合淋巴結(jié)（Peyer′s patch）中的M 細胞識別重組乳酸桿菌，將抗原遞呈至細胞基底外側(cè)的抗原遞呈細胞中，從而激活CD4+T 細胞增殖和漿細胞分泌大量sIgA，引起機體產(chǎn)生全身性免疫應答和局部黏膜免疫應答[15]。

圖1 重組乳酸桿菌誘導機體產(chǎn)生的免疫反應

4 重組細菌活載體疫苗研究進展

4.1 乳酸菌活載體疫苗研究進展乳酸菌（Lactic Acid Bacteria，LAB）是一種在發(fā)酵的過程中利用碳水化合物產(chǎn)生乳酸的革蘭氏陽性菌，通常以球菌或桿菌的形式存在[16]。乳酸菌普遍存在于日常環(huán)境和機體的胃腸道中，具有調(diào)節(jié)機體腸道菌群和維持腸道穩(wěn)態(tài)并誘導機體黏膜免疫的功能[17]。

相比減毒疫苗和滅活疫苗，重組乳酸菌疫苗能夠遞呈抗原并誘導機體產(chǎn)生多種細胞因子，廣泛應用于多種體外實驗中[18]。同時重組乳酸菌能夠在人體腸道中持續(xù)定植，長期釋放特異性抗原蛋白引起機體免疫反應[19]。

Wang 等將構(gòu)建的pSIP409-dRVG 電轉(zhuǎn)至植物乳桿菌NC8 中，口服免疫小鼠后，檢測發(fā)現(xiàn)在小鼠體內(nèi)IgG 抗體含量相比于對照組顯著升高，Th1/Th2 比值升高，釋放細胞因子，提高了機體抵抗狂犬病病毒（Rabies virus，RABV）的免疫力[20]。Wang 等將NC8-pSIP409-pgsA-mIL4 免疫小鼠后，小鼠體內(nèi)sIgA、IL-4 和IL-10 的含量均高于對照組，在接種旋毛形線蟲后能誘導脾臟、腸道中CD3+、CD4+T 細胞大量增殖，誘導機體特異性免疫和非特異性免疫。并且NC8-pSIP409-pgsA-mIL4 還能引起機體Th2 顯性反應，起到一定預防作用[21]。Wang 等對構(gòu)建的LceGFP-VP60進行免疫原性評價，發(fā)現(xiàn)在攻毒后重組干酪乳桿菌組幼兔的存活率為100%，體內(nèi)sIgA 含量均高于PBS 組和滅活疫苗組。并且PBS 組和滅活疫苗組的小腸絨毛壞死同時有嚴重脫皮現(xiàn)象，而重組干酪乳桿菌組并未發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象，證明重組干酪乳桿菌對腸道環(huán)境有一定的保護作用[22]。Zhang 和Kong 研究團隊成功構(gòu)建重組Lc-pPG-1-OmpAI、Lc-pPG-2-OmpAI、Lc-pPG-1-flaB 和Lc-pPG-2-flaB，免疫鯉魚后，發(fā)現(xiàn)鯉魚體內(nèi)溶菌酶、SOD、ACP活性均高于對照組。提取各組織RNA進行RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)各組織中的IL-1β、IL-10和TNF-α顯著上調(diào)，證明重組干酪乳桿菌能誘導鯉魚體內(nèi)產(chǎn)生體液免疫及細胞免疫，提高鯉魚免疫力，有良好的免疫保護效果[23-24]。

4.2 沙門氏菌活載體疫苗研究進展沙門氏菌（Salmonella）是一種革蘭氏陰性菌，有2 500 多種血清型，能夠致多種動物或人的腸胃炎，甚至引起全身性發(fā)熱直至死亡[25-26]。沙門氏菌在減毒后通過口服免疫的途徑將抗原遞呈至宿主細胞中，從而誘導機體產(chǎn)生免疫應答[14,27]。目前國內(nèi)外許多學者將沙門氏菌作為一種遞呈載體用于研制不同疾病的新型疫苗，均獲得了不同程度的成效，是一種較為成熟且極具應用前景的活載體。

Ty21a 是第一種減毒傷寒沙門氏菌疫苗，通過紫外線和化學法使沙門氏菌中galE基因發(fā)生突變從而達到減毒效果[28]。Ty21a 能引起機體分泌IFN-γ 和全身性CD4+和CD8+T 細胞的增殖，并且能誘導機體產(chǎn)生IgA 和IgG 抗體[29]。Li 等發(fā)現(xiàn)帶saoA基因的重組減毒腸炎沙門氏菌rSC0016 和rSC0012 能夠引起機體較強的免疫反應，對SS2 的感染有良好的預防效果[30-31]。Chin′ombe 等將沙門氏菌作為HIV-1 抗原疫苗載體，免疫小鼠后引發(fā)機體特異性Th1 和Th2 細胞因子反應[32]。Bachtiar 等證明重組沙門氏菌疫苗可以將HIV-1 抗原遞呈至免疫系統(tǒng)，以誘導機體產(chǎn)生HIV-1 特異性免疫反應[33]。Zhi 等使用輻射突變技術（Radiation mutation technology，RMT）獲得一株減毒性沙門氏桿菌KST0666，免疫小鼠后發(fā)現(xiàn)所獲得的減毒性沙門氏桿菌可有效的將口蹄疫（FMD）抗原遞呈至免疫細胞中，并能引起機體體內(nèi)IgM、IgG 及IgA 的增加從而誘導機體產(chǎn)生體液免疫及黏膜免疫反應，同時分泌大量IFN-γ、IL-5 和IL-17A，引起機體產(chǎn)生特異性Th1、Th2 和Th17 細胞因子反應，為FMD 疫苗的研究提供新思路[34]。

4.3 卡介苗活載體疫苗研究進展卡介苗（Bacillus Calmette-Guérinrr，BCG）是一種由Albert Calmette 和Camille Guérin 開發(fā)的減毒牛分枝桿菌菌株，目前作為一種相對有效的疫苗被廣泛應用于預防結(jié)核病（Tuberculosis，TB）中[35]。除此之外，以卡介苗作為載體，導入外源性基因，從而誘導機體產(chǎn)生細胞或體液免疫反應，在乙型肝炎、百日咳、弓形蟲病等傳染病中均有較大的突破[36]。

時坤等構(gòu)建rBCG-pMV61-BVDV E2 重組質(zhì)粒，通過頸部皮下注射的方式免疫奶牛，發(fā)現(xiàn)rBCG 能夠誘導免疫組奶牛IFN-γ 的分泌、體內(nèi)CD4+、CD8+T 淋巴細胞的增殖及機體細胞和體液免疫反應[37]。于艷輝等將扁菱形蛋白（Rhomboid）與豬IL-2 基因串聯(lián)后，構(gòu)建pMV261-Rho-IL-2 重組質(zhì)粒并電轉(zhuǎn)入BCG 中，免疫后免疫組體內(nèi)IL-2、IFN-γ 和IL-12的表達水平均明顯提高，證明rBCG 能夠誘導機體產(chǎn)生Th1 型細胞免疫應答，對豬弓形蟲病起到了一定的預防作用[38]。Wang 等將構(gòu)建的pMV361-rho 和pMV361-rho-IL2 電轉(zhuǎn)至BCG 中，鼻飼免疫后發(fā)現(xiàn)相比于對照組，免疫組體內(nèi)CD4+T 細胞和CD8+T 細胞大量增殖，誘導了機體細胞和體液免疫反應，增強了抵抗球蟲感染的能力[39]。羅文武等將犬IL-2 與弓形蟲Rhomboid 蛋白同時構(gòu)建于pMV261 載體中，并電轉(zhuǎn)至BCG 中，免疫后通過ELISA 測得免疫組犬血清中IL-2、IFN-γ 和TNF-α 的含量隨免疫次數(shù)增加而增加，誘導機體產(chǎn)生了Th1 細胞應答，并且相比于對照組，在感染弓形蟲后免疫組的存活時間有所延長，對犬弓形蟲病有一定的預防作用[40]。李文超將rBCG/pMV261-IFN-γ-AMA1 滴鼻免疫雛雞后，機體產(chǎn)生較強的細胞免疫和體液免疫反應，并且rBCG/pMV261-IFN-γ-AMA1 的免疫效果要優(yōu)于rBCG/pMV261-AMA1 的免疫效果，證明了IFN-γ 在重組卡介苗中會增強巨型艾美耳球蟲中AMA1 蛋白（Apical membrane antigen）的免疫保護效力[41]。

4.4 E. coli活載體疫苗研究進展大腸埃希菌（Escherichia coli，E. coli），俗稱大腸桿菌，是一種革蘭氏陰性菌。具有生長周期短、培養(yǎng)方式簡單快捷的特點，并且重組質(zhì)粒能穩(wěn)定保存于E. coli中。目前，以E. coli為遞呈載體的活載體疫苗引起了研究學者的廣泛關注。

如今已發(fā)現(xiàn)E. coli有多個種類，部分E. coli菌株對機體具有一定的益生效果，同時E. coli能夠在機體腸道中穩(wěn)定定植，進而刺激機體的體液免疫反應。劉文鑫通過構(gòu)建ER-A 和ER-B 兩種重組E. coli作為豬源腸致病性E. coli的口服疫苗，使其分別表達兩種嵌合毒素LT192-STa13 和LT192-STb。將兩種重組E. coli口服免疫動物后，分別在免疫組血清、脾臟、腸黏液和腸系膜淋巴結(jié)中均檢測到sIgA 和IgG 抗體，證明所構(gòu)建的重組E. coli口服疫苗不僅可以誘導機體局部的免疫應答還可以誘導機體產(chǎn)生系統(tǒng)性的體液免疫應答。重組E. coli具有良好的遺傳穩(wěn)定性、消化道穩(wěn)定定植能力、對消化環(huán)境良好的耐受性以及對動物的良好免疫保護效果，可作為E. coli性仔豬腹瀉口服減毒活載體疫苗的候選菌株之一[42]。Ruan 等通過構(gòu)建faeG-fedF-ltb 嵌合基因，并轉(zhuǎn)入E. coli中表達后免疫仔豬，發(fā)現(xiàn)免疫組血清、糞便懸液、腸道洗滌液中均檢測到IgG 和IgA 抗體，證明所構(gòu)建的重組E. coli對于豬產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌（EnterotoxigenicEscherichia coli，ETEC）具有良好的免疫保護效果，可以作為開發(fā)豬ETCE 減毒活疫苗的理想候選菌株，并為研發(fā)人類ETEC 疫苗或其他腸道疾病疫苗提供新思路[43]。丁仕豪等人將得到的INP-rMAP62-54c/BL21E. coli免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)免疫組體內(nèi)的CD4+T 細胞在免疫后2 周內(nèi)快速大量增殖，免疫后在2 周～4 周CD8+T 細胞的含量也有所增加，并且在攻毒保護實驗中發(fā)現(xiàn)相比于兩組對照組，免疫組體內(nèi)的IFN-γ 分泌量上升而IL-10 的含量有所下降，說明以E. coli為遞呈載體的重組蛋白能夠引起機體較好的免疫反應，這一結(jié)果為新型副結(jié)核疫苗的研發(fā)提供了一個新的方向[44]。

4.5 其他細菌活載體疫苗研究進展除了以上所提及的細菌活載體疫苗外，李斯特菌（Listeria ivanovii）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，B. subtilis）等細菌也廣泛用于活載體疫苗的構(gòu)建。

Wang 等將B. subtilis-P97R1 和B. subtilis-P46 通過鼻飼途徑免疫小鼠后，小鼠體內(nèi)sIgA、IgG 及T 細胞的分泌均高于對照組，證明重組枯草芽孢桿菌可以誘導機體產(chǎn)生局部的黏膜免疫、體液免疫和細胞免疫反應，對豬肺炎支原體的感染有一定的預防作用[45]。Zhang 等將重組B. subtilis-Cap 通過口服的方式對仔豬免疫后發(fā)現(xiàn)仔豬體內(nèi)IgA、IgG 的含量有所增加，并在仔豬的腸道中檢測發(fā)現(xiàn)體內(nèi)IEL、CD3+和CD4+T 淋巴細胞含量均高于對照組，而IL-1β，IL-6 和IFN-γ 的分泌以及TLR2 和TLR9 的表達量均呈現(xiàn)顯著升高趨勢，證明重組枯草芽孢桿菌可以引發(fā)機體黏膜免疫反應，為豬圓環(huán)病毒2 型新型疫苗的研究提供一個全新的方向[46]。

李斯特菌作為一種革蘭氏陽性菌，攜帶抗原進入細胞后可通過MHCⅠ類分子和MHCⅡ分子將抗原加工遞呈至CD8+和CD4+T 細胞。并且可將其細胞壁表面蛋白和Toll 樣受體與APC 結(jié)合來增強抗原遞呈作用。該菌可作為一種理想的候選載體用于動物疾病、人類疾病和癌癥等活載體疫苗的研制[47-48]，Mahdy 等通過構(gòu)建pCW154-vp1 并電轉(zhuǎn)至減毒李斯特菌中，免疫小鼠后發(fā)現(xiàn)實驗組小鼠體內(nèi)IgG 抗體的含量高于對照組。重組李斯特菌不僅可以誘導機體CD4+T 細胞的增殖還可以誘導CD8+T 細胞的增殖，相比于傳統(tǒng)的FMD 疫苗具有良好的免疫效果[49]。Eung-Jun 等發(fā)現(xiàn)相比于DNA 疫苗，以重組李斯特菌為遞呈載體的活載體疫苗可以有效誘導機體CD8+T細胞的增殖顯著升高，更好的引起機體黏膜反應。并且相比于傳統(tǒng)的皮下注射DNA 疫苗的方式，口服重組李斯特菌能夠減輕動物的應激反應并且更適用于資源匱乏的地區(qū)[50]。

5 小結(jié)及展望

當今許多動物疾病具有極高的死亡率與極強的傳染性，如新城疫、FMD、小鵝瘟等，給中國養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失。不僅如此，還有許多新型疾病的出現(xiàn)如非洲豬瘟、新型禽流感均給中國養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大威脅。而如今傳統(tǒng)的疫苗研制技術雖然成熟但仍有許多不足之處。難以解決由于減毒疫苗毒力返強給動物機體帶來的嚴重后果，也無法大幅提高滅活疫苗的免疫效果，更無法減輕動物的應激反應。因此，新型疫苗的研究迫在眉睫。尤其近十幾年，新型疫苗研制引起了人們的廣泛關注，而新型疫苗研制技術也在這十幾年間快速發(fā)展。而細菌活載體疫苗由于其免疫方式方便快捷，并能引起機體持久性的免疫應答等一系列優(yōu)勢得到了更為廣泛的關注和應用。

以細菌為遞呈載體，通過口服或鼻飼的方式將重組蛋白遞呈至黏膜組織，從而誘導機體黏膜免疫、體液免疫和細胞免疫反應。相比于皮下注射的傳統(tǒng)疫苗，重組細菌活載體疫苗可通過口服或鼻飼的方式在機體腸道中穩(wěn)定定植，操作簡單并且成本較低。而細菌可以將DNA 直接遞呈至細胞內(nèi)部，避免核酸酶對其的降解。不僅如此，細菌進入機體后還可以作為一個天然的抗原，起到調(diào)節(jié)機體先天性免疫和促進特異性免疫反應的作用。

如今重組細菌活載體疫苗在預防和治療動物傳染病和腫瘤等均取得了較好的效果。但如何提高重組活載體疫苗的免疫效率、降低由于染色體整合帶來的潛在風險，從而得到更安全、高效和低價的活載體疫苗，仍然需要更多研究學者的不懈努力，這也是眾多研究學者今后研究的新方向。