崔麗榮，王嘉珍，李 亮，何長生，邢 剛，劉雪蘭，孫 裴，魏建忠，李 郁*

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036；2.安徽動物疫病預(yù)防與控制中心，安徽 合肥 230091；3.馬鞍山史記動物健康管理有限公司，安徽 馬鞍山 238251）

豬鏈球菌病是由鏈球菌屬中豬鏈球菌（Streptococcus suis，SS）、馬鏈球菌類馬亞種、馬鏈球菌獸疫亞種和蘭氏分群中D、E、L 群鏈球菌引起的一種常見豬傳染病。其中，SS 是世界范圍內(nèi)引起豬鏈球菌病最主要的病原。在SS 已知的35 種血清型中，以血清2 型（Streptococcus suisserotype 2，SS2）分離率最高，致病力最強[1]。然而，近年來血清3 型（Streptococcus suisserotype 3，SS3）和血清4 型（Streptococcus suisserotype 4，SS4）在國內(nèi)外發(fā)病豬中均較為普遍且分離率呈逐年上升的態(tài)勢，甚至成為局部地區(qū)的優(yōu)勢血清型[2-6]。本實驗室于2018 年～2020 年對安徽、江蘇、山東、河北、廣西等地區(qū)發(fā)病豬細菌流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，SS2 分離率最高，其次是SS4 和SS3。

一直以來抗生素是養(yǎng)殖企業(yè)治療豬鏈球菌病的主要手段，但長期不合理的濫用亂用，致使SS 耐藥問題日趨嚴重[7]。在當(dāng)前全面開展減抗、限抗并逐步朝向禁抗的大趨勢下，疫苗免疫則成為預(yù)防豬鏈球菌病的有效措施。目前已有的商用SS 疫苗主要針對SS2 和SS7（Streptococcus suisserotype 7，SS7），尚未有SS3 和SS4 疫苗。由于SS 血清型眾多，不同血清型菌株之間缺乏交互免疫力，流行血清型的分布情況也隨著地理區(qū)域不同而有所變化，所以在生產(chǎn)實際中常會出現(xiàn)疫苗接種后免疫效果不確實的現(xiàn)象。滅活苗憑借其使用安全，研制周期短，易于保存及運輸?shù)葍?yōu)點在臨床上普遍應(yīng)用，而多價滅活苗能對多種血清型菌株產(chǎn)生免疫保護作用。因此，開展SS 多價滅活苗的研制意義顯著。

本研究將篩選出的3 株用于制備疫苗的SS 菌株（代號/血清型分別為HF2/SS2，BB15-4/SS3，HBgu18-4/SS4）經(jīng)甲醛滅活后、以ISA 201VG 礦物油佐劑進行配比乳化，制備滅活前為1.0×109cfu/mL、2.0×109cfu/mL、4.0×109cfu/mL 3 種活菌濃度的SS 三價（血清2、3、4 型）滅活苗，進而以昆明鼠為動物模型進行免疫效果評價，同時與SS 商用疫苗作平行比較，為新型SS 三價滅活苗的研發(fā)提供技術(shù)儲備，為有效防控豬鏈球菌病奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、疫苗及實驗動物SS2、SS3 和SS4 疫苗用菌株代號分別為HF2、BB15-4、HBgu18-4，攻毒菌株代號分別為BZ1、BB15-4、HBgu18-4，均由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物傳染病實驗室篩選與保存[8-9]（表1）；豬鏈球菌病三價滅活疫苗（C 群XS 株、SS2 LT 株和SS7 YZ 株）購自武漢科前生物股份有限公司（生產(chǎn)批號：20200406）；體質(zhì)量為18 g～22 g、6 周齡～8 周齡清潔級雌性昆明鼠購自安徽醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心。

表1 菌株的背景信息Table 1 Background information of Streptococcus suis strains used in this study

1.2 主要試劑酵母浸膏胰酪胨大豆瓊脂（TSAYE）、酵母浸膏胰酪胨大豆肉湯（TSB-YE）均購自紹興天恒生物科技有限公司；礦物油佐劑ISA 201VG購自法國賽比克公司；甲醛溶液購自上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司；小鼠脾臟組織淋巴細胞分離試劑盒購自天津灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司；HRP 標記的羊抗鼠IgG（IgG-HRP）購自美國博士德生物工程有限公司；細胞因子ELISA 檢測試劑盒（IL-4、IL-10、IFN-γ、TFN-β、MCP-1）購自美國RB 公司；流式細胞抗體試劑盒購自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司。

1.3 SS 三價（血清2、3、4 型）滅活苗的制備與檢驗將3 株制苗菌株培養(yǎng)液中的活菌數(shù)均分別調(diào)整為1.0×109cfu/mL、2.0×109cfu/mL、4.0×109cfu/mL 3 種濃度后細菌滅活，其中SS2、SS3 試驗菌株（HF2、BB15-4）用終濃度為0.3%的甲醛、37 ℃條件下滅活15 h，SS4 試驗菌株（HBgu18-4）用終濃度為0.15%的甲醛、37 ℃條件下滅活11 h。以ISA 201VG礦物油佐劑配比乳化，制備3 種活菌濃度的SS 三價滅活苗，依次命名V-a、V-b 和V-c，待疫苗檢驗合格后[10]，利用昆明鼠進行免疫效果評價。

1.4 昆明鼠分組及免疫將190 只小鼠，隨機分成6 組（編號分別為A、B、C、D、E、F）。其中A～D組為免疫組（每組35 只小鼠），依次免疫V-a、V-b、V-c、商用疫苗；E、F 組分別為攻毒對照組（35 只小鼠）和陰性對照組（15 只小鼠），均接種等體積滅菌生理鹽水。接種劑量均為0.2 mL/只，接種途徑均為頸部皮下多點注射。接種2 次，間隔14 d。

1.5 各組小鼠血清中IgG 抗體檢測于首免后14 d與二免后7 d，采集A～D 組和F 組小鼠血清，每組3只。用全菌體超聲裂解物包被酶標板，參照文獻[11]中的ELISA 方法檢測HF2（SS2）、BB15-4（SS3）、HBgu18-4（SS4）免疫小鼠后血清中的IgG 抗體效價。

1.6 各組小鼠的血清殺菌試驗于首免后14 d 與二免后7 d，采集A～D 組和F 組小鼠血清，每組3 只，血清經(jīng)56 ℃熱處理30 min 為滅活補體。免疫組為小鼠血清+健康豚鼠血清（補體）+菌懸液（分別為BZ1、BB15-4、HBgu18-4，以生長菌落數(shù)為100 cfu～200 cfu的菌液稀釋濃度為試驗菌懸液濃度。下同）；抗體對照組為小鼠血清＋健康豚鼠血清（滅活補體）+菌懸液；補體對照組為PBS 稀釋液+健康豚鼠血清（補體）+菌懸液；體系對照組為PBS 稀釋液+健康豚鼠血清（滅活補體）+菌懸液。各組置37 ℃孵育1 h 后，涂布于TSA-YE 培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h 后進行菌落計數(shù)，殺菌率（%）=[1-免疫組菌落數(shù)/補體對照組菌落數(shù)]×100%，若免疫組孔內(nèi)菌落的數(shù)量為補體對照孔的50%以下即判為“殺菌”，否則判為“不殺菌”。

1.7 各組小鼠血清中相關(guān)細胞因子含量的測定于首免后14 d 與二免后7 d，采集A～D 組和F 組小鼠血清，每組3 只。利用相應(yīng)細胞因子試劑盒對各組小鼠產(chǎn)生的白細胞介素4（IL-4）、白細胞介素10（IL-10）、γ干擾素（IFN-γ）、腫瘤壞死因子β（TNF-β）、單核細胞趨化蛋白1（MCP-1）的細胞因子含量進行檢測。

1.8 各組小鼠脾淋巴細胞增殖試驗首免14 d 和二免7 d 后，采集各免疫組和陰性對照組小鼠，每組3只。將斷頸處死后的小鼠，在75%乙醇中浸泡消毒3 min～5 min 后，無菌取出脾臟，利用小鼠脾淋巴細胞分離試劑盒制備脾淋巴細胞懸液，以噻唑藍溴化四唑比色法（MTT 法）測定脾淋巴細胞增殖指數(shù)（SI），SI=免疫孔OD570nm均值/陰性對照孔OD570nm均值[12]。

1.9 各組小鼠外周血中CD4+、CD8+ T 細胞亞群百分比的測定于首免后14 d 與二免后7 d，采集A～D組和F 組小鼠外周血至抗凝管，每組3 只。取抗凝管中的100 μL 外周血至2 mL 無菌離心管中，加入1.8 mL 紅細胞裂解液，顛倒混勻后靜置30 min。1 500 r/min 離心5 min，棄上清液。加入1.8 mL 無菌PBS 緩沖液（pH=7.2）反復(fù)吹吸。1 500 r/min 離心10 s，棄去多余液體，保留約200 μL～300 μL 的液體和白細胞于管底，吹打混勻。設(shè)4 個陰性對照組，第1 組只加入紅細胞裂解液，不加熒光抗體染色；另外3 組分別加入CD3+、CD4+和CD8+單一熒光染料。將各組樣品混勻后置4 ℃避光孵育30 min。用無菌PBS 緩沖液（pH=7.2）洗滌孵育后的樣品，2 500 r/min 離心5 min，棄上清液，加入500 μL 無菌PBS 緩沖液（pH=7.2），吹打混勻。將各組細胞懸液轉(zhuǎn)移至流式管。利用流式細胞儀檢測并分析數(shù)據(jù)[13]。

1.10 各組小鼠的免疫保護率測定二免7 d 后，將免疫組（A～D）小鼠分別再分為3 組（編號分別為A1～A3、B1～B3、C1～C3、D1～D3），另設(shè)攻毒對照組（E1～E3）和陰性對照組（F1～F3），每小組5 只。采用腹腔注射的方式對小鼠攻毒，攻毒菌株分別為BZ1（SS2）、BB15-4（SS3）和HBgu18-4（SS4），攻毒劑量分別為5LD100、5LD50和5LD50，陰性對照組注射滅菌生理鹽水。攻毒后，觀察各組小鼠的精神狀態(tài)、飲食欲及死亡等情況，計算各組小鼠免疫保護率。免疫保護率（%）=[1-免疫組死亡率/對照組死亡率]×100%。

1.11 各組小鼠內(nèi)臟組織荷菌數(shù)的測定在小鼠攻毒3 d、7 d 后，分別無菌采集感染小鼠的肺、肝、脾和腎臟于1.5 mL 離心管中，稱量組織重量，按一定比例加無菌PBS 和磁珠研磨；10 倍倍比稀釋后分別取原液、1∶10、1∶100 3 個稀釋度的組織懸液1 mL，均勻涂布于TSA-YE 固體培養(yǎng)基，平板計數(shù)法測定不同菌株攻毒后各臟器（肺、肝、脾、腎）中的細菌菌落數(shù)。

1.12 各組小鼠病理組織學(xué)觀察攻毒7 d 后，采集免疫組、陰性對照組和攻毒對照組小鼠的肺、肝、脾和腎臟，置于10%福爾馬林中，24 h 后重新更換福爾馬林，進行固定和保存，制作組織病理切片，觀察各臟器的組織病理學(xué)變化。

1.13 數(shù)據(jù)處理本實驗所有數(shù)據(jù)的差異性統(tǒng)計均采用SPSS 20.0 軟件進行單因素方差分析，數(shù)據(jù)繪圖均使采用Graphpad.8.0 軟件繪制。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠血清中IgG 抗體檢測結(jié)果于首免后14 d 與二免后7 d，采集A～D 組和F 組小鼠血清，通過間接ELISA 的方法檢測各組小鼠血清中IgG 抗體水平。結(jié)果顯示，首免后14 d 與二免后7 d，A～D 組小鼠的IgG 抗體含量始終保持相同水平，且均顯著高于F 組（P＜0.05）。二免7 d 后，A～D 組的IgG 抗體水平顯著上升（P＜0.05），F(xiàn) 組小鼠的IgG 抗體水平則無顯著變化（P＞0.05）（表2）。表明制備的3 種活菌濃度的SS 三價滅活苗均可刺激小鼠產(chǎn)生較高水平的抗體，且與商用疫苗相一致，均為1∶12 800。

表2 SS三價滅活苗免疫小鼠血清中IgG抗體水平測定結(jié)果Table 2 Determination of IgG antibody level in serum of mice immunized with SS trivalent inactivated vaccine

2.2 各組小鼠的血清殺菌試驗結(jié)果于首免后14 d與二免后7 d，采集A～D 組和F 組小鼠血清，進行血清殺菌試驗。結(jié)果顯示，補體對照組菌落數(shù)為120 cfu。首免14 d 后，A～D 組菌落數(shù)均高于補體對照的50%，對SS 不具有殺滅作用。二免7 d 后，A～D 組菌落數(shù)均顯著降低，且低于補體對照組的50%，對SS具有殺滅作用且各組之間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），但與F 組差異顯著（P＜0.05）。二免7 d 與首免14 d 相比，A～D 組菌落數(shù)均顯著減少（P＜0.05），F(xiàn) 組菌落數(shù)始終無顯著變化（P＞0.05）（圖1）。表明制備的3 種濃度的SS 三價滅活苗免疫小鼠后，血清中的功能性抗體均具有高度殺菌活性，與商用疫苗無顯著差異。

圖1 各組小鼠血清殺菌試驗結(jié)果Fig.1 Results of serum bactericidal test

2.3 各組小鼠血清中相關(guān)細胞因子含量的測定結(jié)果于首免后14 d 與二免后7 d，采集A～D 組和F 組小鼠血清，并按照細胞因子試劑盒說明書，對各組小鼠血清中的細胞因子含量進行檢測。結(jié)果顯示，首免后14 d 與二免后7 d，A～D 組小鼠血清中IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-β、MCP-1 含量與F 組相比均有所升高（P＜0.05），且各免疫組間差異不顯著（P＞0.05）（圖2）。表明制備的3 種濃度的SS 三價滅活苗均可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高水平的細胞因子，與商用疫苗無顯著差異。

圖2 小鼠血清中相關(guān)細胞因子檢測結(jié)果Fig.2 Levels of detection of relevant cytokines in sera of mice

2.4 各組小鼠脾淋巴細胞增殖試驗結(jié)果于首免后14 d 與二免后7 d，采集A～D 組和F 組小鼠血清并制備脾淋巴細胞懸液，以MTT 法進行脾淋巴細胞增殖試驗。結(jié)果顯示，首免后14 d 與二免后7 d，A～D 組小鼠脾淋巴細胞的SI值持續(xù)上升，F(xiàn)組小鼠的SI值始終無顯著變化（P＞0.05）。二免7 d 后，A～D 組小鼠的SI 值持續(xù)上升且顯著高于F 組（P＜0.05）（圖3）。表明制備的3 種濃度的SS 三價滅活苗均能有效地刺激小鼠脾淋巴細胞增殖，使其淋巴細胞不斷活化、增殖和分化，從而增強機體的免疫應(yīng)答能力，且與商用疫苗無顯著差異。

圖3 小鼠脾淋巴細胞增殖試驗結(jié)果Fig.3 Proliferation test results of spleen lymphocytes in mice

2.5 各組小鼠外周血中CD4+、CD8+ T 細胞亞群百分比測定結(jié)果于首免后14 d 與二免后7 d，采集A～D 組和F 組小鼠外周血，并采用流式細胞術(shù)檢測CD4+/CD3+、CD8+/CD3+T 細胞亞群含量。結(jié)果顯示，首免14 d 后，A～D 組的CD4+/CD3+、CD8+/CD3+T細胞比率均顯著高于F 組（P＜0.05）。二免7 d 后，A～D 組的CD8+/CD3+T 細胞比率均呈上升趨勢。其中，B組的CD4+/CD3+T細胞比率顯著高于A、C、D組P＜0.05），但A、C、D 組之間差異不顯著（P＞0.05）（圖4）。表明制備的3 種濃度的SS 三價滅活苗均可誘導(dǎo)小鼠T 細胞亞群比率持續(xù)升高，且B 組的誘導(dǎo)能力強于A、C、D 組。

圖4 小鼠外周血中CD4+、CD8+細胞亞群在總T細胞中所占百分比Fig.4 Percentage of CD4+,CD8+subpopulations in peripheral blood of mice in total T cells

2.6 各組小鼠的免疫保護率測定結(jié)果二免7 d后，均以BZ1、BB15-4 和HBgu18-4 菌株攻毒免疫A～D 組和攻毒對照組（E 組）小鼠，陰性對照組（F組）接種等體積滅菌生理鹽水，每組15 只，觀察7 d，計算小鼠死亡率。結(jié)果顯示，攻毒7 d 后，E組小鼠均死亡，F(xiàn) 組小鼠均存活，試驗成立。在各免疫組中，B、C 組的免疫保護率均為100%，A、D組的免疫保護率分別為86.67%和80%（表3）。表明制備的3 種濃度的SS 三價滅活苗和商用疫苗均能使小鼠產(chǎn)生良好的免疫保護力。

表3 SS三價滅活苗對小鼠的免疫保護率測定結(jié)果Table 3 Immune protection rate of SS trivalent inactivated vaccine in mice

2.7 各組小鼠內(nèi)臟組織荷菌數(shù)檢測結(jié)果在小鼠攻毒3 d、7 d 后，采集不同臟器（肺、肝、脾、腎）測定組織荷菌數(shù)。結(jié)果顯示，攻毒3 d 后，A～D 組小鼠的肺、肝、脾、腎臟組織中均有一定數(shù)量的細菌定植，且各組間無顯著差異（P＞0.05），而與E 組差異顯著（P＜0.05）；攻毒7 d 后，A～D 組BZ1 菌株菌落數(shù)為0 且與E 組不同組織器官的荷菌數(shù)差異顯著（P＜0.05），A～C 組BB15-4 和HBgu18-4 菌株菌落數(shù)為0 且與D、E 組不同組織器官的荷菌數(shù)差異顯著（P＜0.05），而D、E 組不同組織器官的荷菌數(shù)無顯著差異（P＞0.05）（圖5）。表明制備的3 種濃度的SS三價滅活苗均能有效清除SS2、SS3、SS4 在體內(nèi)的定植，商用疫苗能有效清除SS2 在體內(nèi)的定植。

圖5 BZ1、BB15-4、HBgu18-4菌株感染后小鼠各臟器組織中的含菌量Fig.5 BZ1,BB15-4,HBgu18-4 bacterial content of bacteria in various organs of mice after infection

2.8 各組小鼠的組織病理切片觀察結(jié)果于攻毒7 d后取A～F 組小鼠的肺、肝、脾、腎臟制作組織病理切片，觀察組織病理變化。結(jié)果顯示，A1～D1、A2～C2、B3、C3 組肺臟整體結(jié)構(gòu)正常，未見明顯炎性反應(yīng)，D2 組肺間質(zhì)輕微充血，A3、D3 組肺泡壁輕微增厚，但未見明顯炎性細胞浸潤（圖6）。C1 組肝臟整體結(jié)構(gòu)基本正常，A1、B1、D1組有少量炎性細胞浸潤，A2～C2、D2 組肝細胞輕微水腫，A3～C3組肝竇輕微充血擴張，未見明顯炎性反應(yīng)，D3 組肝細胞輕微水腫，少量炎性細胞浸潤（圖7）。A1～C1、B2、C2、B3 和C3 組脾臟整體結(jié)構(gòu)正常，D1～D3、A2～A3 組可見少量多核巨細胞浸潤（圖8）。A1～D1、C2、A3～C3 組腎臟整體結(jié)構(gòu)基本正常，A2、B2 和D2組少量腎小球萎縮，未見明顯炎性細胞浸潤，D3組腎組織可見少量腎小球萎縮，未見明顯炎性細胞浸潤（圖9）。

陰性對照組F 組小鼠各臟器均無明顯病理變化（圖6～圖9）。攻毒對照組E1、E3 組小鼠肺泡壁明顯增厚，E2 組肺泡融合擴張形成較大囊泡（圖6）；E1、E2組肝細胞明顯水腫，大量炎性細胞浸潤，E3組肝竇間隙明顯增大，明顯炎性細胞浸潤（圖7）；E1、E2 和E3 組脾組織整體結(jié)構(gòu)異常，紅髓白髓界限不分明，組織可見大量多核巨細胞浸潤（圖8）；E1 組腎小管上皮細胞細胞核壞死溶解消失，僅存腎小管輪廓，E2 和E3 組整體結(jié)構(gòu)異常，可見大量腎小管上皮細胞疏松水腫，少量腎小球明顯萎縮（圖9）。

圖6 BZI、BB15-4、HBgu18-4攻毒后各組小鼠肺臟組織病理學(xué)變化（HE染色，200×）Fig.6 Histopathological changes of lung in each group of mice after BZ1,BB15-4,HBgu18-4 attack(HE staining,200×)

圖7 BZI、BB15-4、HBgu18-4攻毒后各組小鼠肝臟組織病理學(xué)變化（HE染色，200×）Fig.7 Histopathological changes of liver in each group of mice after BZ1,BB15-4,HBgu18-4 attack(HE staining,200×)

圖8 BZI、BB15-4、HBgu18-4攻毒后各組小鼠脾臟組織病理學(xué)變化（HE染色，200×）Fig.8 Histopathological changes of spleen in each group ofmice after BZ1,BB15-4,HBgu18-4 attack(HE staining,200×)

圖9 BZI、BB15-4、HBgu18-4攻毒后各組小鼠腎臟病理組織學(xué)變化（HE染色，200×）Fig.9 Histopathological changes of kidney in each group of mice after BZ1,BB15-4,HBgu18-4 attack(HE staining,200×)

綜合3 種菌（BZ1、BB15-4、HBgu18-4 株）攻毒后各組小鼠組織（肺、肝、脾、腎臟）病理變化，表明制備的3 種濃度的SS 三價滅活苗免疫小鼠后，均可刺激機體產(chǎn)生良好免疫保護效果，且攻毒后對小鼠肺、肝、脾、腎臟的病理變化的損傷程度均較輕微。

3 討 論

豬鏈球菌病是由SS 引起的以豬的腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎以及敗血癥等臨床癥狀為主要特征的細菌性傳染病。近年來，隨著全球養(yǎng)殖場集約化、規(guī)?；l(fā)展以及生豬頻繁引種和調(diào)動，致使該病的發(fā)病率和致死率明顯升高，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失[14]?？股睾鸵呙缃臃N可用于豬鏈球菌病的防控，但長期不合理的使用抗生素，容易導(dǎo)致SS 耐藥性的產(chǎn)生和耐藥譜的拓寬，疫苗接種儼然成為防控該病的主要措施。但SS 血清型眾多，不同血清型甚至相同血清型不同菌株之間缺乏有效的交叉保護力，且不同地區(qū)優(yōu)勢菌株分布常處于動態(tài)流行中，導(dǎo)致某些豬場雖開展了免疫工作卻未達到理想的保護效果。因此，研制出交叉保護性強的SS 疫苗意義顯著。滅活苗憑借研制周期短，使用安全，易制備多價、多聯(lián)苗等優(yōu)勢，在臨床上得以普遍應(yīng)用，是生產(chǎn)實際中防制多種血清型菌株的最優(yōu)選擇。

不同血清型SS 菌株異質(zhì)性明顯，抗原性存在較大差別，因此鑒定與篩選疫苗用優(yōu)勢菌株，對地區(qū)性豬鏈球菌病的防控至關(guān)重要。此外，在疫苗制備的各個環(huán)節(jié)中，提高疫苗中的有效抗原含量是疫苗免疫效果的關(guān)鍵[15]。不僅如此，滅活條件和佐劑也是影響疫苗免疫效果的主要因素[16]。本實驗室前期對某集團公司分布在安徽、江蘇、山東、河北、廣西等5 個地區(qū)的家庭農(nóng)場，以及安徽地區(qū)不同規(guī)模養(yǎng)豬場（戶）進行豬細菌病流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)主要以SS2、SS3 和SS4 的感染為主。進而通過小鼠致病性、抗原性和穩(wěn)定性試驗，綜合篩選得到3 株用于制備疫苗的SS 菌株（HF2、BB15-4 和HBgu18-4株）。本研究在此基礎(chǔ)上，將HF2 和BB15-4 株采用終濃度為0.3%的甲醛37 ℃條件下作用15 h；HBgu18-4 株采用終濃度為0.15%的甲醛37 ℃條件下作用11 h 后滅活，以ISA 201VG 礦物油佐劑配比乳化，制備滅活前分別為1.0×109cfu/mL、2.0×109cfu/mL、4.0×109cfu/mL 3 種活菌濃度的SS 三價滅活苗，以昆明鼠為實驗動物模型，采用皮下多點注射途徑與SS商用疫苗同步免疫昆明鼠，進行免疫效果評價。

IgG 抗體是血清中含量最多的抗體，且持續(xù)時間長，是機體抗感染免疫的主力，也是介導(dǎo)體液免疫的主要抗體[17]。但并非所有具有抗原結(jié)合能力的抗體均具有殺菌功能，而通過補體介導(dǎo)的血清殺菌試驗?zāi)軌蛑苯臃从吵隹贵w的功能活性和疫苗的保護效果[18]。本研究中，A～D 組小鼠的IgG 抗體含量在整個免疫周期中始終保持相同水平，表明制備的3種濃度的SS 三價滅活苗與商用疫苗均能產(chǎn)生良好的體液免疫反應(yīng)。血清殺菌試驗結(jié)果顯示，A～D 組小鼠免疫后血清中的功能性抗體均具有高度殺菌活性，表明其刺激機體產(chǎn)生的功能性抗體能夠抵抗細菌的感染，具有良好的免疫保護作用。綜合血清殺菌試驗和IgG 抗體水平測定結(jié)果表明3 種濃度的SS三價滅活苗均可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生大量特異性抗體與功能性抗體，可與機體免疫系統(tǒng)結(jié)合殺傷病原菌，與商用疫苗無顯著差異。

脾臟是免疫活性細胞即T、B 淋巴細胞定植及發(fā)生適應(yīng)性免疫應(yīng)答的場所[19]。脾淋巴細胞的增殖能力決定其所產(chǎn)生效應(yīng)淋巴細胞的數(shù)量和機體免疫應(yīng)答反應(yīng)的強度。T 淋巴細胞作為機體免疫系統(tǒng)中最重要的細胞群，可通過CD4+T 淋巴細胞（Th 細胞）和CD8+T 淋巴細胞（Tc 細胞）亞群釋放大量細胞因子增強機體免疫應(yīng)答水平。其中，CD4+T 淋巴細胞可分為Th1 和Th2 兩個細胞亞群，Th1 細胞主要分泌IFN-γ、TNF-β 等，可刺激或增強細胞免疫應(yīng)答反應(yīng)；Th2 細胞主要分泌IL-4 和IL-10 等，輔助體液免疫反應(yīng)。MCP-1 作為炎癥反應(yīng)的始動因子，既能介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，也能促進細胞免疫應(yīng)答[20]。而Tc 細胞可在Th 細胞的輔助作用下，發(fā)揮特異性殺傷的功能。因此，細胞因子水平是機體免疫功能狀態(tài)的重要反映。本研究中，A～D 免疫組均可刺激小鼠脾淋巴細胞大量增殖，在誘導(dǎo)CD4+、CD8+T 淋巴細胞比率持續(xù)升高的同時還可刺激小鼠產(chǎn)生較高水平的細胞因子，表明3 種濃度的SS 三價滅活苗均可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生細胞免疫反應(yīng)，促進體液免疫反應(yīng)，從而產(chǎn)生持久的免疫保護效果，與商用疫苗無顯著差異。

SS 是一種常見的豬呼吸道細菌，常定植于扁桃體但不致病。當(dāng)機體抵抗力下降時，SS 可從扁桃體向周圍淋巴組織擴散，進入血液，進而侵襲不同組織器官，引起炎癥反應(yīng)，使機體相應(yīng)部位形成病灶，造成機體的損傷或死亡。本研究從攻毒保護率、組織荷菌數(shù)、組織病理學(xué)方面，進一步分析比較了3 種濃度的SS 三價滅活苗以及商用疫苗的免疫保護效果。B～C 組的免疫保護率均為100%，優(yōu)于A組（86.67%）和D 組（80%）。結(jié)合組織荷菌數(shù)分析和病理組織學(xué)變化證實，與陰性對照組相比，B～C 組的各組織器官的SS 荷菌數(shù)均降低且無顯著差異，但相較于A 組，B～C 組的各組織器官病理變化較輕微或無明顯病理變化。而D 組經(jīng)BB15-4（SS3）和HBgu18-4（SS4）菌株攻毒后，均有一定數(shù)量的SS 定植且病理變化較明顯，這可能與商用疫苗中不包含SS3 和SS4 抗原有關(guān)。說明SS 不同血清型之間缺乏交叉保護力，多數(shù)血清型菌株只對同源菌株產(chǎn)生免疫保護作用，而對異源菌株的免疫保護力較弱，因而無法切實有效地保護實際生產(chǎn)中SS 優(yōu)勢菌株的感染。因此，在面對SS 多種血清型感染的情況下，選擇使用多價疫苗來防控豬鏈球菌病顯得尤為重要，這不僅可對當(dāng)前SS 動態(tài)流行防制特點提供切實保護，也是對目前商用疫苗無法滿足生產(chǎn)實際需求的有效補充。

綜合上述研究結(jié)果表明，3 種濃度的SS 三價滅活苗（V-a、V-b、V-c）免疫小鼠后均能產(chǎn)生良好的體液免疫和細胞免疫反應(yīng)，其中，當(dāng)SS 的濃度分別為2.0×109cfu/mL 和4.0×109cfu/mL（V-b、V-c）時，疫苗免疫保護效果最佳，其免疫的小鼠均可有效抵抗SS2、SS3、SS4 強毒株的攻擊，可作為SS 三價（血清2、3 和4 型）滅活苗的候選疫苗。