趙為民，王慧利，曹少先，郭日紅，王澤平，陳 哲，徐 奎，付言峰，李碧俠，任守文，程金花*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院畜牧研究所 江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護與利用平臺，南京 210014；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部種養(yǎng)結(jié)合重點實驗室，南京 210014；3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院宿遷農(nóng)科所，宿遷 223800；4.中國農(nóng)業(yè)科學院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所，深圳 518124)

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是細菌為抵御病毒入侵所進化的一種適應性免疫系統(tǒng)[1-3]。該系統(tǒng)利用gRNA識別并引導核酸酶Cas9對靶DNA進行切割，誘發(fā)DNA的非同源重組(NHEJ)或同源重組(HDR)損傷修復機制，從而實現(xiàn)對靶基因序列的編輯[4-6]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)自開發(fā)以來已被廣泛用于疾病治療、基因功能研究與新品種培育[7-11]。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)誘導DNA雙鏈斷裂后，細胞內(nèi)傾向于利用非同源重組方式修復[12]，這種修復方式隨機性強，插入或刪除的堿基數(shù)難以控制,有時無法對目的基因產(chǎn)生敲除效果，從而導致篩選有效的突變體耗時耗力。單堿基編輯技術(base editor)是基于CRISPR系統(tǒng)的新型靶基因定點修飾技術，在不產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂的情況下，利用胞嘧啶脫氨酶或腺嘌呤脫氨酶對靶位點進行精準的單堿基編輯，實現(xiàn)C-T或A-G的替換，從而開發(fā)了CBE和ABE系統(tǒng)[12-13]，自2016年報道以來受到了廣泛的關注。CRISPR/Cas9系統(tǒng)在制備動物疾病模型和治療單堿基遺傳疾病的潛力成為了研究熱點。然而后續(xù)許多研究表明，胞嘧啶單堿基編輯器存在嚴重的DNA脫靶[14-15]，胞嘧啶單堿基編輯器和腺嘌呤單堿基編輯器還存在著大量的RNA脫靶效應[16-17]，使單堿基編輯工具的安全性受到了質(zhì)疑，限制了單堿基編輯系統(tǒng)在動植物中的精準和多樣化突變的應用。Zuo等[18]通過突變APOBEC1上的ssDNA結(jié)構域相應氨基酸，得到了顯著降低DNA脫靶的CBE突變體YE1-BE3-FNLS工具。優(yōu)化后的YE1-BE3-FNLS在保證高保真的情況下，顯著提高了基因編輯效率，從而成為既安全又高效的新單堿基基因編輯工具。Doman等[19]也報道了YE1-CBE系統(tǒng)在保持較高編輯效率的同時降低了DNA和RNA上的脫靶。

豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)俗稱藍耳病，是一種世界性傳染病，也是嚴重危害我國生豬產(chǎn)業(yè)的高度烈性傳染病，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[20]。研究表明，CD163基因是藍耳病毒侵入細胞的重要受體[21-24]，通過敲除CD163基因或功能域能有效的抵御藍耳病毒的感染[25-29]。

本研究通過YE1-BE3-FNLS系統(tǒng)對豬CD163基因進行單堿基編輯，通過C>T，在其第七外顯子將其中一個密碼子CAA改變?yōu)榻K止密碼子TAA，可實現(xiàn)該基因翻譯的提前終止，為后續(xù)制備安全有效的CD163基因敲除豬提供了技術支撐。

1 材料與方法

1.1 細胞、菌株與質(zhì)粒

PX330載體由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部種養(yǎng)結(jié)合重點實驗室保存；YE1-BE3-FNLS載體由中國農(nóng)業(yè)科學院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所左二偉研究員贈予。

1.2 主要試劑

MEGAshortscriptTMT7 Transcription Kit、mMESSAGE mMACHINETMT7 ULTRA Transcription Kit、MEGAclearTMTranscription Clean-Up Kit、TCM-199和EGF購于Thermo fisher公司；REPLI-g single cell kit購于Qiagen公司；化學試劑購于Sigma公司。DNA marker、DNA聚合酶PrimerSTAR Max Premix、購于TaKaRa公司；DNA純化回收試劑盒購于Zymo Research公司；引物合成與測序驗證由北京擎科公司完成。

1.3 CD163基因的sgRNA設計

使用在線軟件(http://chopchop.cbu.uib.no/)設計CD163基因(XM_021091120.1)的sgRNA靶標位點[30]。首先考慮Efficiency>50%的sgRNA，然后是Off-targets指標，選取的sgRNA序列位點盡量沒有Off-targets所述的0、1、2、3錯配類型；綜合Self-complementarity和GC含量篩選CD163基因的候選sgRNA序列。在候選sgRNA的基礎上，進一步采取以下規(guī)則：由于YE1-BE3-FNLS載體的單堿基編輯窗口較短(C5-C6)，因此設計的sgRNA的第5或第6位堿基為C，并且C5或C6后續(xù)的兩個堿基為GA、AG或AA，而且CGA、CAG、CAA與起始密碼子ATG之間的堿基數(shù)為3的整數(shù)倍。

1.4 CD163基因的sgRNA與YE1-BE3-FNLS載體的擴增與體外轉(zhuǎn)錄

以PX330載體為模板，在設計的CD163-sgRNA的正向引物引入T7 promoter引物(加粗堿基)和sgRNA序列(下劃線堿基)，正向引物序列F:TAATACGACTCACTATAGGGAGTACAACATGG-AGACACGTGTTTTAGAGCTAGAAATAG，反向引物R: AAAAGCACCGACTCGGTGCC。以YE1-BE3-FNLS載體為模板，擴增APOBEC-Cas9n-UGI，正向引物F: TAATACGACTCACTATAGGGGATCC;反向引物R: TCGAGGCTGATCAGCGGGTTTTTA。PCR擴增體系：mix 10 μL，F(xiàn)引物0.5 μL，R引物0.5 μL，DNA 1 μL，ddH2O補至20 μL；擴增條件：94 ℃預變性1 min；98 ℃變性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸25 s，33個循環(huán)；72 ℃延伸1 min。

對CD163-sgRNA和APOBEC-Cas9n-UGI片段進行回收純化，進行體外轉(zhuǎn)錄。CD163-sgRNA利用MEGAshortscriptTMT7 Transcription Kit進行體外轉(zhuǎn)錄，方法參考試劑盒說明書。APOBEC-Cas9n-UGI片段利用mMESSAGE mMACHINETMT7 ULTRA Transcription Kit進行體外轉(zhuǎn)錄，方法參考試劑盒說明書。轉(zhuǎn)錄后的RNA純化參考MEGAclearTMTranscription Clean-Up Kit。對體外轉(zhuǎn)錄純化后的CD163-sgRNA和APOBEC-Cas9(D10A)-UGI mRNA進行混合，使兩者終濃度分別為50 和100 ng·μL-1。

1.5 卵母細胞體外成熟培養(yǎng)

屠宰場收集豬卵巢后3 h內(nèi)運回實驗室，生理鹽水充分洗滌后，注射器抽取3～6 mm卵泡，體視鏡下挑選卵丘致密、胞質(zhì)均勻的卵丘細胞-卵母細胞復合體(cumulus-oocyte complexes，COCs)。將挑選的COCs置于卵母細胞體外成熟液中(TCM-199培養(yǎng)基含10% porcine follicular fluid, 0.1% PVA, 3.05 mmol·L-1D-glucose, 0.91 mmol·L-1sodium pyruvate,0.5 IU·mL-1FSH,0.5 IU·mL-1LH, 10 ng·mL-1EGF和0.57 mmol·L-1cysteine)，在38.5 ℃，5% CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)44～48 h，培養(yǎng)結(jié)束后將COCs轉(zhuǎn)移到0.1%透明質(zhì)酸酶中脫去卵丘細胞，挑選排出第一極體、質(zhì)膜完整的MII期卵母細胞備用。

1.6 卵母細胞孤雌激活與體外注射

將上述MII期卵母細胞用激活液(0.3 mol·L-1mannitol, 0.05 mmol·L-1CaCl2, 0.1 mmol·L-1MgSO4, 0.1% BSA)充分洗滌后，置于注滿激活液的電融合槽內(nèi)，利用ECM2001融合儀施加1.2 kv·cm-1，40 us的直流電脈沖進行孤雌激活，經(jīng)PZM3胚胎培養(yǎng)液充分洗滌后，放入含5 μg·mL-1CB的PZM3培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)3 h，再經(jīng)充分洗滌并轉(zhuǎn)入石蠟油覆蓋的PZM3中于38.5 ℃, 5% CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～12 h后，利用Nikon NT88-V3顯微注射系統(tǒng)進行顯微注射。

1.7 單堿基編輯驗證與off-target分析

利用REPLI-g single cell kit提取擴增單個胚胎的基因組DNA。在酒精燈上拉細毛細管后吸取單個胚胎置于0.2 mL離心管，加入PBS和D2 buffer，65 ℃裂解10 min，加入stop buffer，最后加入預混的master mix，30 ℃ 8 h，65 ℃3 min。結(jié)束后用TE buffer稀釋10倍。對單堿基編輯區(qū)域進行PCR擴增，引物為F: TCTGGTGTGCCTTTGACTCC; R: CCAGTGAGAGTTGCAGAGGG,預期擴增產(chǎn)物大小為865 bp。PCR擴增體系：mix 10 μL，F(xiàn)引物0.5 μL，R引物0.5 μL，DNA 1 μL，ddH2O補至20 μL；擴增條件：94 ℃預變性1 min；98 ℃變性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，33個循環(huán)；72 ℃延伸1 min。PCR產(chǎn)物擴增后進行回收純化，送北京擎科公司進行sanger測序。off-target分析所用引物見表1。

表1 Off-target分析所用引物

2 結(jié) 果

2.1 CD163基因的sgRNA序列的設計與篩選

CD163基因位于5號染色體的正義鏈，有17個外顯子。網(wǎng)站結(jié)果顯示共有423個sgRNA針對CD163基因的外顯子。在綜合分析Efficiency(>50%)、Off-targets指標(MM0、MM1、MM2值為0)、Self-complementarity(0)和GC含量(40%～60%)后發(fā)現(xiàn)，候選CD163-sgRNA共有49個。由于YE1-BE3-FNLS載體的單堿基編輯窗口較短(C5-C6)，因此對候選sgRNA的第5或第6位堿基要求為C，并且C5或C6后續(xù)的兩個堿基為GA、AG或AA，而且CGA、CAG、CAA與起始密碼子ATG之間的堿基數(shù)為3的整數(shù)倍?？紤]到盡量在基因的前中部進行單堿基編輯，綜合這些因素最終篩選的CD163-sgRNA序列為：AGTACAACATGGAGACACGT，PAM為GGG。此sgRNA的第5位堿基為C，其后續(xù)兩個堿基為AA，位于CD163基因的第7外顯子(num1479，圖1)。并且在CD163的mRNA序列中，CD163-sgRNA序列中的CAA與起始密碼子ATG之間堿基數(shù)為1 479，為3的整數(shù)倍。當發(fā)生C>T突變時，密碼子發(fā)生了CAA>TAA突變，形成終止密碼子，可使CD163基因在第7外顯子處提前終止翻譯。CD163-sgRNA的特征如表2所示，符合預期要求。

表2 CD163-sgRNA序列特征

圖1 CD163-sgRNA序列的位置示意圖

2.2 CD163基因的sgRNA與APOBEC-Cas9(D10A)-UGI片段的體外擴增

如圖2顯示，分別以PX330和YE1-BE3-NLS載體為模板，PCR擴增的CD163-sgRNA和APOBEC-Cas9(D10A)-UGI片段大小與預期相符合。

A: M.DNA相對分子質(zhì)量標準；1.CD163-sgRNA擴增產(chǎn)物；B: M.DNA相對分子質(zhì)量標準；1.APOBEC-Cas9n-UGI擴增產(chǎn)物

2.3 豬孤雌胚胎的顯微注射

利用顯微操作儀對激活的豬孤雌胚胎進行CD163-sgRNA和APOBEC-Cas9n-UGI mRNA的顯微注射，每個胚胎注射10～20 pL后繼續(xù)培養(yǎng)。圖3為注射后2～4細胞期的豬孤雌胚胎。

圖3 豬孤雌胚胎注射RNA混合物的2～4細胞期

2.4 單堿基編輯的效果驗證

挑選單個發(fā)育至桑椹胚或囊胚的胚胎，利用單細胞全基因組擴增試劑盒REPLI-g single cell kit對胚胎進行基因組DNA的提取與擴增。經(jīng)過8 h擴增后，單個胚胎的DNA濃度為1.7～1.8 μg·μL-1，滿足后續(xù)PCR擴增要求。分別對對照組和注射組的胚胎DNA進行編輯區(qū)域的PCR擴增，產(chǎn)物測序的序列分析發(fā)現(xiàn)對照組的預期位點為C(圖4A)，注射組的20個胚胎中有8個胚胎的DNA在預期位點(num 1479)出現(xiàn)C>T突變(圖4B)。而進一步分析發(fā)現(xiàn)有額外4個胚胎的DNA在預期位點中雖然序列顯示為C，但峰圖結(jié)果顯示該位點出現(xiàn)C與T堿基的雜峰，表明該位點被成功編輯(圖4C-D)。綜合分析在挑選的20個胚胎中有12個的DNA在預期位點出現(xiàn)C>T突變，單堿基編輯效率約60%。

2.5 CD163-sgRNA的off-target分析

由于選取的CD163-sgRNA在錯配3個堿基的情況下能匹配到豬基因組的5個位置，利用Cas-OFFinder對這5個錯配的位置進行序列分析。表3顯示了這5個off-target的基因組位置，4個位于1號染色體，1個位于4號染色體，這5個off-target在基因組中相應的錯配位點分別用小寫字母表示，如表3的第3列。Off-target1在C9、C11、C15三個位點有錯配；Off-target2在C13、C14、C18三個位點有錯配；Off-target3在 C4、C14、C19三個位點有錯配；Off-target4在C3、C11、C18三個位點有錯配；Off-target5在C2、C13、C14三個位點有錯配。這5個off-target區(qū)域在C5位點都是C，因此對這5個off-target區(qū)域進行PCR擴增，測序結(jié)果的峰圖顯示選取的CD163-sgRNA在這5個off-target位置上的C5位點并沒有發(fā)生C>T單堿基編輯(圖5)。

圖5 對照組(A)與注射組(B)CD163-sgRNA的off-target位點測序分析

表3 CD163-sgRNA的off-target位點

3 討 論

豬是最重要的家畜動物之一，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生物醫(yī)藥中具有重要的應用價值。單核苷酸多態(tài)性(SNPs)是豬品種和個體間遺傳變異的一種主要類型，對性狀的形成起著重要作用[31]，對重要的功能性SNP位點進行預期突變可加速豬的育種進程，然而CRISPR/Cas9系統(tǒng)誘發(fā)的同源重組的損傷修復存在效率低以及細胞內(nèi)傾向于非同源重組修復[12]，因此很難實現(xiàn)高效穩(wěn)定的單堿基突變。單堿基編輯器作為新一代基因編輯工具，可為豬的精準遺傳改良提供一種可行的解決方案。

YE1-BE3-FNLS作為新一代的高精度、高活性的單堿基編輯工具，可顯著降低脫靶效應和提高編輯效率[18]，具有廣闊的應用前景。但是該工具的編輯窗口較短C5-C6，而且胞嘧啶脫氨酶rAPOBEC1對GC motif中胞嘧啶的編輯效率不高[32]，因此在設計sgRNA的時候需要進行大量的篩選，如果是利用sgRNA創(chuàng)造終止密碼子，很有可能篩選不到好的sgRNA。本研究中針對CD163初篩了49個參數(shù)較好的候選sgRNA，但是最終確定的CD163-sgRNA只有1個，因此與傳統(tǒng)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)相比，單堿基編輯工具sgRNA的篩選與鑒定要顯得更為繁瑣。

由于sgRNA本身較短，長度在20 bp左右，因此在基因組上容易匹配到多個位置，從而造成脫靶效應[33]。本研究選取的sgRNA序列位點的off-targets所述的0、1、2、3錯配類型為(0,0,0,5)，而0、1、2、3分別代表在基因組上錯配0～3個堿基數(shù)量的sgRNA個數(shù)，本研究中的CD163-sgRNA在錯配0、1和2個堿基情況下沒有off-target，而在錯配3個堿基下的5個off-target位點都沒有發(fā)生堿基突變，因此表明該CD163-sgRNA在基因組上高度特異。

研究表明，CD163基因不僅可作為PRRSV的受體，還參與清除血漿中的血紅蛋白等生物過程[34]。因此，CD163基因功能的喪失可能存在未知的風險。然而有研究表明與野生型相比，CD163基因敲除豬在經(jīng)濟性狀(例如產(chǎn)肉與繁殖性狀以及免疫性狀例如巨噬細胞作為血紅蛋白-結(jié)合珠蛋白清除劑)的表型都沒有發(fā)生顯著變化[27,35]，因而CD163敲除豬的安全性還需要進一步持續(xù)研究。

目前，已有多個團隊利用CRISPR/Cas9技術制備了CD163 敲除豬，其方式是通過CRISPR/Cas9介導的同源重組(HDR)或DNA片段刪除[25-26]，這兩種方式的效率較低，而且對于DNA片段刪除需要借助2條sgRNA，額外增加了可能的脫靶性。而且DNA片段刪除的方式也容易額外插入堿基序列，不易獲得純合的CD163敲除豬[26]。

姚旭東等[36]利用單堿基編輯系統(tǒng)對羊MSTN基因進行了精準編輯，表明單堿基編輯系統(tǒng)具有較好的特異性。本研究中的單堿基編輯效率較高，達到了60%，而且造成的堿基突變類型單一，容易得到純合突變，為后續(xù)精準制備CD163基因敲除豬提供了技術支撐。

4 結(jié) 論

本研究利用YE1-BE3-FNLS工具在胚胎水平上對豬的CD163基因進行了單堿基編輯，成功使得該基因第7外顯子預期位點(num1479)C突變?yōu)門，從而使得密碼子CAA突變?yōu)門AA，可提前終止CD163基因的翻譯。