董智豪，張秋雪，郭冠華，段晨瑩，趙羚均，白俊艷，王 棟

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；2.河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院，洛陽 471203；3.寧城縣動物疫病預(yù)防控制中心，赤峰 024200；4.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，太谷 030801；5.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春 130118)

發(fā)情鑒定一直是牛場的繁殖管理重點，其準(zhǔn)確程度是人工授精成功的前提基礎(chǔ)[1]。為此，研發(fā)了觀察法、直腸檢查法、陰道溫度監(jiān)測法[2]、超聲波和激素監(jiān)測法[3-4]等發(fā)情鑒定方法，這些方法有時可聯(lián)合使用，檢出率較高，但都必須依靠人力，耗時費(fèi)力，也無法解決夜間發(fā)情的準(zhǔn)確鑒定問題，而且，需要技術(shù)員有較高的技術(shù)水平和責(zé)任心；某些方法固有的侵入性，也易使動物產(chǎn)生應(yīng)激，并且增加了動物受傷和病原微生物感染的風(fēng)險[5]。近年來，基于加速度傳感器研發(fā)的計步器發(fā)情鑒定方法，實現(xiàn)了自動化，解決了夜間發(fā)情無人值守問題，但是，越來越多的研究表明，20%以上發(fā)情?；顒恿吭黾硬幻黠@，隱性發(fā)情使計步器發(fā)情鑒定面臨巨大挑戰(zhàn)[6]。在本交情況下，配種前，種公牛要先找出發(fā)情母牛，并嗅聞其排泄物、陰部，經(jīng)過公母牛接觸、交流，進(jìn)行爬跨配種。這給人以啟示，除視覺、聽覺、觸覺刺激外，嗅覺刺激在公母牛性行為中發(fā)揮了重要作用。不同性別間通過信息素(pheromones)化學(xué)分子傳遞兩性信息的交流方式在昆蟲中普遍存在，且這些種內(nèi)信息素交流可能是生物進(jìn)化的結(jié)果[7]，例如，雌性飛蛾通過性信息素吸引雄蛾完成兩性交配[8]。長角甲蟲、飛蛾等農(nóng)業(yè)害蟲的信息素被人類破解后，被用于這些害蟲的生物防治[9-12]。信息素與昆蟲繁殖和社會行為息息相關(guān)[13]。同樣，信息素在哺乳動物繁殖中也發(fā)揮了重要作用[14-17]，公牛嗅聞母牛排泄物及母牛陰部，也是因為受到其中信息素化學(xué)成分的刺激[18]。目前，關(guān)于牛信息素的研究為揭示公母牛的性交流提供了重要信息[19-23]，也為母牛發(fā)情監(jiān)測技術(shù)的研發(fā)開辟了新思路。為此，本文將對母牛信息素相關(guān)研究進(jìn)行綜述，希望通過研究發(fā)情牛信息素交流規(guī)律，為及時、準(zhǔn)確、無侵入式的母牛發(fā)情鑒定技術(shù)研發(fā)，提供重要參考。

研究表明，哺乳動物尿液、糞便、陰道分泌物、唾液都含有信息素，汗腺等專門的氣味腺也是其主要的釋放部位[17, 24]，同類動物主嗅覺系統(tǒng)(main olfactory system, MOS)與犁鼻系統(tǒng)(vomeronasal system, VNS)可接收相應(yīng)信息素，并獲取相關(guān)信息[25-26]。這些信息素中，與動物繁殖和性吸引相關(guān)的化學(xué)信號也被稱為性信息素。當(dāng)公牛嗅聞到發(fā)情母牛性信息素時，會產(chǎn)生上唇持續(xù)翻起的性嗅反射行為(Flehmen)，以及重復(fù)性爬跨行為[27]，為此，一些研究用公牛的這兩種反應(yīng)驗證相關(guān)性信息素[20-21, 28]。很多研究在奶牛糞便、尿液等排泄物及陰道液、唾液和牛奶等分泌物中發(fā)現(xiàn)了一些發(fā)情特異性信息素[19-20, 22, 28-29]。這些研究結(jié)果可能有助于發(fā)情監(jiān)測方法的創(chuàng)新研發(fā)。

1 糞便信息素

動物排出的糞便有時會攜帶影響同種動物行為的特異性化合物(包括揮發(fā)性和非揮發(fā)性的)[30-32]。例如，母馬糞便含有發(fā)情特異性化合物十四烷酸和十六烷酸，研究表明，這兩種化合物可作為信息素吸引公馬與母馬交配[33]；讓雄性大鼠嗅聞發(fā)情雌性大鼠、狐貍及母馬糞便，可引起雄性大鼠陰莖勃起，有趣的是，當(dāng)聞到發(fā)情狐貍糞便時，雄性大鼠不但陰莖勃起，還呈現(xiàn)出瑟瑟發(fā)抖的恐懼狀態(tài)，說明性欲刺激和危險信號并存時，大鼠會受到性欲的支配[34]；在母豬糞便中含有甲基吲哚和十四烷酸，可以作為母性信號吸引仔豬，并減少仔豬間打斗，改善保育效果[35]。同樣，Sankar和Archunan[20]在娟姍(Jersey)奶牛糞便中發(fā)現(xiàn)10種反映發(fā)情狀態(tài)的化合物，其中，丁酸、戊酸、羧酸、2-丙烯酯只存在于發(fā)情前期糞便中，乙酸、丙酸和1-碘十一烷只被發(fā)現(xiàn)于發(fā)情期，而丁烷、3-己醇、膦酸只被發(fā)現(xiàn)于發(fā)情后期，通過公牛驗證，發(fā)現(xiàn)發(fā)情期獨(dú)有的3種化合物(乙酸、丙酸和1-碘十一烷)可能是引起公牛性嗅反射、爬跨等性行為的原因之一，并且，用這3種化合物組合處理臺牛比單獨(dú)用某一種成分處理臺牛更容易使種公牛產(chǎn)生性嗅反射和爬跨反應(yīng)。但Mozūraitis等[36]并沒有在同期發(fā)情處理荷斯坦奶牛糞便中檢測出1-碘十一烷，乙酸、丙酸也不是發(fā)情期特有，只是在發(fā)情期有一個峰值。兩者研究差異很大，推斷可能是奶牛品種和采樣方法差異(前者是乙醚萃取，后者是固相微萃取)導(dǎo)致的。Mozūraitis等[36]針對發(fā)情奶牛糞便中乙酸、丙酸兩種信息素，結(jié)合傳感器技術(shù)，與Wiegerinck等[37]合作開發(fā)出電子鼻，進(jìn)行母牛自動化發(fā)情鑒定，但發(fā)情檢出率僅為70%。此外，Manikkaraja等[38]基于L-酪氨酸功能化銀納米離子開發(fā)了奶牛發(fā)情鑒定技術(shù)，利用預(yù)處理銀納米離子遇到乙酸或丙酸時由黃色變成紅棕色的現(xiàn)象，通過顏色變化進(jìn)行發(fā)情鑒定。而對莫拉水牛的研究發(fā)現(xiàn)，4-甲基苯酚和反式戊烯醇為發(fā)情水牛糞便所特有，而十一烷僅不存在于發(fā)情期，或許可單獨(dú)或與發(fā)情特異化合物聯(lián)合進(jìn)行發(fā)情預(yù)測[21]。分析上述研究結(jié)果，不同品種(如澤西奶牛和荷斯坦奶牛)發(fā)情牛糞便信息素組成相似，但不同屬(奶牛和水牛)發(fā)情期牛糞便信息素差別極大，表明糞便信息素有一定種屬特異性。此外，還從發(fā)情階段各個時期的糞便中檢測到孕酮、類固醇等非揮發(fā)性化合物，這些物質(zhì)不同時期的含量差異一定程度上也反映了動物的發(fā)情階段特征[39-40]。因此，糞便化學(xué)物質(zhì)尤其是發(fā)情期特異性化合物的檢測，為奶牛發(fā)情鑒定方法研發(fā)開辟了新思路，Sankar和Archunan[20]及Mozūraitis等[36]對奶牛的鑒定結(jié)果雖然不太理想，但證明了通過糞便發(fā)情信息素檢測進(jìn)行發(fā)情鑒定的可行性，然而，目前對母牛糞便中發(fā)情期特異性信息素的檢測尚存爭議，還缺乏權(quán)威、科學(xué)的分析結(jié)果，只有系統(tǒng)科學(xué)地揭示母牛糞便的發(fā)情特異性信息素，才能利用這些生命奧秘服務(wù)于母牛發(fā)情鑒定技術(shù)研發(fā)。

2 唾液信息素

唾液是一種含有無機(jī)鹽、脂肪酸、蛋白質(zhì)等多種分泌物成分的生物體液[41-44]，成分的復(fù)雜性賦予了其復(fù)雜的功能，尤其是發(fā)情動物唾液的一些特定化合物在動物繁殖過程中發(fā)揮了化學(xué)信號(信息素)作用，對其繁殖和社會行為產(chǎn)生了重要影響。對蒙古沙鼠的研究表明，與非發(fā)情雌鼠唾液相比，有性經(jīng)驗的雄鼠更喜歡發(fā)情雌鼠的唾液，說明雌鼠唾液中性信息素對雄鼠有較強(qiáng)的性引誘作用[45-46]。公豬唾液中也檢測到性信息素，并被用于誘導(dǎo)母豬發(fā)情[47]。Sankar等[28]發(fā)現(xiàn)，發(fā)情前期奶牛唾液含有碳酸、二氯化膦、丁酸和2-丙烯酯，發(fā)情期含有三甲胺、乙酸、丙酸、戊酸和4-丙基苯酚，發(fā)情后期含有3-己醇、丁酸、2-丙烯酯和戊酸，用公牛驗證后發(fā)現(xiàn)，不同于丁酸和2-丙烯酯，用三甲胺、乙酸、丙酸、戊酸、4-丙基苯酚處理臺牛，可引起公牛更多性嗅反射反應(yīng)和爬跨次數(shù)，其中，對三甲胺的反應(yīng)效果極顯著高于其他化合物，而對戊酸的反應(yīng)效果最不明顯。三甲胺等對公牛引誘效果明顯的化合物，值得進(jìn)一步研究。Muthukumar等[48]在發(fā)情水牛唾液中檢測到27種蛋白質(zhì)，其中β-烯醇酶和TOLL樣受體4(TLR4)在發(fā)情期階段特異表達(dá)，可作為發(fā)情特異性標(biāo)記物。Shashikumar等[49]發(fā)現(xiàn),Cullin相關(guān) NEDD8 解離蛋白 1(cullin associated NEDD8-dissociated protein 1)、熱休克蛋白 1A(70 ku)、Ⅰ型17-β-羥基類固醇脫氫酶、抑制素βA 鏈、睪丸素等唾液蛋白是發(fā)情特異性的。唾液是一種反映身體生理和生化變化的診斷介質(zhì)，還可用于評估內(nèi)分泌功能，反映激素循環(huán)水平[50-52]，研究唾液中的發(fā)情特異性物質(zhì)，對于發(fā)情鑒定方法研發(fā)具有重要意義，但是，不同于公、母豬，生產(chǎn)中很少發(fā)現(xiàn)公、母牛通過唾液進(jìn)行交流，可能不同體液在不同物種中作用大小有差異。

3 尿液信息素

哺乳動物尿液含有尿酸、尿素、蛋白質(zhì)[53]等非揮發(fā)性物質(zhì)及短鏈脂肪酸等揮發(fā)性和半揮發(fā)性物質(zhì)[54-56]，也含有一些同種動物間信號交流分子即信息素。研究表明，白足鼠(Peromyscusleucopus)群體中成年雌鼠尿液能抑制幼齡雌鼠性成熟[57]；而發(fā)情雌性鼠尿液能促進(jìn)幼齡小鼠性成熟，但同時用發(fā)情鼠、懷孕鼠和哺乳期鼠尿液處理幼齡小鼠卻沒有這種作用[58]。推斷尿液可能是哺乳動物發(fā)情信息交流的一種重要途徑。這些發(fā)情特異性信息素在尿蛋白配體承載下，進(jìn)行化學(xué)信號傳遞[59]，發(fā)情雌小鼠尿液中較高的蛋白排泄量表明，同種異性個體間信息交流具有重要作用，是發(fā)情期雌鼠對雄鼠產(chǎn)生強(qiáng)烈性吸引的重要途徑，推測，尿液的信息素成分對于小鼠繁殖不可或缺。

受小鼠研究啟發(fā)，牛尿液信息素研究也取得重要進(jìn)展。Kumar等[19]在奶牛尿液中檢測到了7種化學(xué)物質(zhì)，其中，鄰苯二甲酸二丙酯和1-碘十一烷僅存在于奶牛發(fā)情期，其后續(xù)Archunan[60]研究表明，奶牛尿液中的1-碘十一烷可作為發(fā)情特異標(biāo)志物。針對一種歐洲蠅類可區(qū)分瑞典紅牛和瑞典荷斯坦奶牛黃體期和發(fā)情期尿液現(xiàn)象，進(jìn)行的尿液成分檢測表明，發(fā)情期尿液中1-十六醇的含量(5.49±0.89)ng·μL-1顯著高于黃體期尿液(1.86±0.36)ng·μL-1，由此推斷，1-十六醇可能也是發(fā)情母牛分泌的信息素[61]。Rajanarayanan和Archunan[62]及Samuthirapandi等[63]研究了正常發(fā)情和同步發(fā)情水牛的尿液成分，檢測出4-甲基苯酚、9-十八碳烯酸為發(fā)情牛尿液特有；并且，基于4-甲基苯酚開發(fā)出發(fā)情檢測試劑盒，向該試劑盒加入發(fā)情期尿液時無顏色變化，加入發(fā)情前期尿液時尿液顏色變粉色，而加入發(fā)情間期尿液時顏色變深粉色[64]。盡管僅達(dá)到約60%的檢測效率，但開辟了通過尿液信息素成分檢測研發(fā)母牛發(fā)情檢測技術(shù)的重要方向。如果能深入揭示尿液中信息素成分及其存在形式，或許能推動該研究方向取得突破性進(jìn)展。

4 陰道黏液信息素

發(fā)情動物陰部對同種異性動物有較強(qiáng)吸引力，不僅是因為性器官對視覺的感官刺激，雄性動物還表現(xiàn)出強(qiáng)烈的性嗅反射，說明陰道黏液中含有可刺激雄性動物性行為的信息物質(zhì)，這種物質(zhì)可誘引雄性動物嗅、舔發(fā)情母畜陰部，并表現(xiàn)出持續(xù)的性嗅反射行為[65]。雌性倉鼠陰道分泌物可誘引雄性倉鼠嗅聞和舔這些分泌物，并產(chǎn)生性行為[66]；狗經(jīng)過訓(xùn)練后，也可通過嗅聞陰道黏液找出發(fā)情母牛，證明牛陰道黏液中存在性信息素[67]。研究表明，牛陰道黏液中除存在能吸引公、母牛的信息素外，還包含動物本身的個體氣味[65, 68]。

陰道黏液中化學(xué)物質(zhì)種類、含量等的變化以及因此產(chǎn)生的黏液物理特性改變，可用來預(yù)測動物發(fā)情階段[69-70]。很多研究進(jìn)行了牛陰道液的化學(xué)物質(zhì)檢測，例如，Ma等[71]在發(fā)情周期各階段奶牛陰道液中均檢測到乙醛，但乙醛會在發(fā)情前0～3 d內(nèi)出現(xiàn)一個濃度峰值；Sankar和Archunan[72]研究發(fā)現(xiàn)，三甲胺、乙酸、丙酸為發(fā)情期母牛陰道液所特有，可促進(jìn)公牛產(chǎn)生性行為；Pluta等[73]發(fā)現(xiàn)，小母牛陰道黏液中存在 47 種揮發(fā)性有機(jī)物(volatile organic compounds，VOC)，其中豐度較高的2-丁酮、丙酮、2-戊酮、4-甲基 2-戊酮、1-(1-甲基乙氧基)-2-丙酮、乙醇、2-甲基-2-丙醇和2-丁醇等物質(zhì)的含量在發(fā)情開始后 24～47 h之間達(dá)到峰值(排卵發(fā)生在發(fā)情開始后((26.6±5.6)h)。研究還表明，經(jīng)PGF2α同期發(fā)情誘導(dǎo)后，嗅聞到發(fā)情牛陰道黏液的荷斯坦母牛同步化程度高于未嗅聞母牛[74]。與未嗅聞發(fā)情牛陰道黏液的PGF2α處理牛比，嗅聞組瑞典紅牛的血液LH濃度變化幅度更小((1.03±0.09)ng·mL-1vs.(0.87±0.09)ng·mL-1)(P=0.001)，最低濃度更高((1.79 ±0.16)ng·mL-1vs.(2.04±0.1)ng·mL-1)(P<0.001)，峰值濃度更接近((2.83±0.13)ng·mL-1vs.(2.92±0.17)ng·mL-1)(P=0.375)，受到陰道黏液信息素的影響，母牛生理活動更穩(wěn)定可靠，同步效果更好[75]，但其背后的調(diào)節(jié)機(jī)制以及參與的信息素尚需深入探索，該機(jī)制研究可能會進(jìn)一步促進(jìn)同期排卵效果改善，提高人工授精妊娠率。此外，Nordéus等[76]研究還顯示，嗅聞發(fā)情牛陰道黏液和尿液后，瑞典紅牛發(fā)情周期長度無明顯變化，LH濃度變化與前述結(jié)果相似，但對發(fā)情強(qiáng)度(陰道狀況、躁動情況、黏液狀態(tài))可能有負(fù)面影響。這一點很值得思考，處理母牛生理指標(biāo)正常且穩(wěn)定，排卵一致性較好，穩(wěn)定的激素水平及神經(jīng)調(diào)節(jié)應(yīng)該強(qiáng)化母牛發(fā)情表現(xiàn)，或至少不應(yīng)影響到發(fā)情表現(xiàn)，所以，對上述對發(fā)情強(qiáng)度的負(fù)面影響還需進(jìn)行試驗驗證。也許現(xiàn)代的集約化養(yǎng)殖，過高的養(yǎng)殖密度等導(dǎo)致了母牛發(fā)情抑制，甚至造成部分奶牛安靜發(fā)情。

有些研究還從牛陰道黏液中檢測到了胺類、酯類[77]、HSP70(熱休克蛋白)[78]等信息素類化合物。這些揮發(fā)性和非揮發(fā)性信息素類物質(zhì)共存，對研發(fā)原創(chuàng)性發(fā)情鑒定技術(shù)具有重要指導(dǎo)意義。此外，陰道黏液信息素可能還與陰道微生物的種類和豐度有關(guān)，探究陰道微生物及其代謝物的變化規(guī)律對于了解動物繁殖階段可能也有重要意義[79]。

5 其它部位的信息素

除上述常見部位外，哺乳動物乳汁、皮毛、皮膚腺也是一些信息物質(zhì)重要來源[24, 65, 80-81]。其中，關(guān)于皮毛信息素的報道多見于綿羊和山羊研究[82]，在奶牛上并沒有相關(guān)報道，可能是奶牛汗腺不發(fā)達(dá)，信息素分泌較少。

乳汁信息素一般具有吸引幼崽、幫助幼崽尋找母體乳房等作用[83]。但公牛嗅聞發(fā)情奶牛牛奶，性嗅反射行為持續(xù)時間((5.31±0.44)s)顯著高于嗅聞發(fā)情前、后期奶牛牛奶的持續(xù)時間((3.20±0.18)svs.(3.66±0.36)s)，推測發(fā)情牛乳汁含有吸引公牛的信息素成分[65]。不同發(fā)情階段荷斯坦奶牛、瑞士紅牛、西門塔爾奶牛和高山灰奶牛乳成分對比結(jié)果表明，各品種牛乳成分均呈現(xiàn)發(fā)情期和非發(fā)情期差異，從發(fā)情前高孕酮期到發(fā)情期，脂肪增加0.14%，其中，C14:0和C16:0下降(-0.34%和-0.48%)，C18:0和C18:1cis-9增加(0.40%和0.73%)，不飽和脂肪酸、反式脂肪酸和長鏈脂肪酸增加，而飽和脂肪酸、中鏈脂肪酸和短鏈脂肪酸下降[84]。對牛奶中脂肪酸的專門檢測表明，發(fā)情當(dāng)天乙酸(P<0.001)、戊酸(P=0.016)、己酸(P<0.001)和十四烷酸(P=0.035)均顯著高于發(fā)情后第14天，而花生四烯酸濃度卻顯著降低(P=0.004)[29]，以此推斷，發(fā)情奶牛乳成分還有待深入研究，或許可基于乳汁檢測建立非侵入性發(fā)情鑒定技術(shù)。

皮膚腺信息素的報道多見于兩棲類動物相關(guān)研究[80, 85-86]，其在兩棲類動物繁殖中發(fā)揮了重要作用，而在哺乳動物中鮮見報道。Melo和Gonzlez-Mariscal[81]綜述了兔子的相關(guān)研究，異性兔子通過皮膚腺體(下頜腺、肛門腺、哈德氏腺、淚腺、包皮腺)和乳腺-乳頭復(fù)合體進(jìn)行繁殖相關(guān)的信息傳遞。有研究對同期發(fā)情母牛會陰部位注射腎上腺素促進(jìn)其會陰腺分泌，用公牛驗證發(fā)現(xiàn)，相比于未注射組，公牛嗅聞注射組會陰分泌物次數(shù)更多，說明會陰腺中存在對公牛具有吸引作用的信息素[87]。然而，與牛皮膚腺信息素相關(guān)的研究很少，這些分泌物中都含有什么成分，是什么成分向公牛傳遞了發(fā)情信息，這些都有待深入、系統(tǒng)的科學(xué)研究。

6 小 結(jié)

除聽覺、視覺、觸覺等感官刺激作用外，嗅覺刺激對于種公牛精準(zhǔn)的發(fā)情鑒定至關(guān)重要，受到仿生學(xué)的啟發(fā)，人們企圖通過破譯母牛信息素，創(chuàng)新發(fā)情鑒定技術(shù)，解決目前無法突破的安靜發(fā)情產(chǎn)業(yè)瓶頸。有關(guān)母牛唾液、陰道黏液、尿液、糞便等來源的信息素研究已經(jīng)取得一定進(jìn)展，為該方向研究露出了冰山一角，然而，到目前為止，公、母牛信息交流重要信息源間的關(guān)系是什么？都有什么成分，各成分是如何組合和發(fā)揮作用的？這些問題的解決還需進(jìn)行更多深入、系統(tǒng)、科學(xué)的基礎(chǔ)研究。目前，色譜質(zhì)譜分析技術(shù)、代謝組學(xué)等都取得了較快進(jìn)展，生物樣品化學(xué)成分的定向測定和組學(xué)分析效率大幅提升，為不同來源母牛信息素的研究鑒定提供了更多便利條件，相信公、母牛間性交流的奧秘不久就將被揭示，并推動母牛發(fā)情鑒定技術(shù)取得突破性進(jìn)展。