劉恩寵,田 原,韋 瑤,馬成俊,王振華

(煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,線粒體與健康衰老研究中心,山東 煙臺(tái) 264005)

慢性腦低灌注(Chronic cerebral hypoperfusion,CCH)是指動(dòng)脈硬化等多種原因引發(fā)的長(zhǎng)期腦血流灌注不足,可致漸進(jìn)性認(rèn)知功能障礙,已成為老年人群高發(fā)腦血管病。CCH也可增加阿爾茨海默癥癡呆風(fēng)險(xiǎn),并參與了腦卒中所致的血管性癡呆進(jìn)展[1-2]。目前CCH致認(rèn)知功能障礙的確切機(jī)制仍未完全闡明,亦未有理想的臨床干預(yù)措施。理想的CCH動(dòng)物模型對(duì)于揭示其病理機(jī)制,篩選防治藥物十分必要[3]。SHIBATA等[4]于2004年采用內(nèi)徑為0.18～0.22 mm的不銹鋼微型彈簧,套于成年C57BL/6小鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈,通過單次手術(shù)成功復(fù)制了雙側(cè)頸總動(dòng)脈狹窄致CCH小鼠模型,已成為較為經(jīng)典的CCH模型復(fù)制方法。

毛蕊花苷(Verbascoside,VB)是廣泛存在于肉蓯蓉、馬先蒿等植物藥資源中的苯乙醇苷類化合物[5]。已有研究發(fā)現(xiàn),毛蕊花苷具有明確的抗氧化、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、神經(jīng)保護(hù)、改善記憶障礙等廣泛生理活性[6]。毛蕊花苷可以改善缺氧所致小鼠海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元損傷以及海馬體內(nèi)的氧化脅迫狀態(tài)[7],LI等也證實(shí)毛蕊花苷可改善模擬高原低氧所致海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷及記憶功能損害,或與其調(diào)節(jié)腦組織氧化應(yīng)激和mTOR信號(hào)通路有關(guān)[8]。

我國(guó)已于2018年將荒漠肉蓯蓉(CistanchedeserticoLa Y. C. Ma)納入藥食同源目錄,已有文獻(xiàn)報(bào)道,自管花肉蓯蓉制備的蓯蓉總苷富含松果菊苷(44.3%),對(duì)局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠短期內(nèi)(7 d)的記憶缺陷有明確保護(hù)作用[9]。肉蓯蓉中富含的毛蕊花苷是否可改善慢性腦低灌注所致認(rèn)知功能損害,尚未見明確報(bào)道。本研究建立了不銹鋼微彈簧致小鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈狹窄致全腦低灌注模型,成功復(fù)制了CCH小鼠認(rèn)知功能損害模型,考察了于飲水中添加毛蕊花苷提取物對(duì)小鼠認(rèn)知功能障礙的改善作用,以期為基于肉蓯蓉的相關(guān)功能食品開發(fā)提供可借鑒的思路。

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性ICR小鼠,體重18～22 g,購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司,動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(魯)20140007。飼養(yǎng)于煙臺(tái)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,12 h晝夜明暗交替,室溫23～25 ℃,相對(duì)濕度40%～60%,自由攝食飲水。小鼠飼以滅菌顆粒飼料和滅菌用純凈水。適應(yīng)飼養(yǎng)一周,之后開始正式實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑

新疆荒漠肉蓯蓉由新疆凱美嘉生物科技有限公司提供,采收自新疆和田地區(qū)。參考文獻(xiàn)方法[10]獲得肉蓯蓉苯乙醇苷類粗提取物,再按文獻(xiàn)方法[11]經(jīng)中壓柱層析獲得毛蕊花苷部位,HPLC鑒定提取部位含毛蕊花苷85.3%;水合氯醛(成都市科龍化工試劑廠);青霉素鈉(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司);非吸收性外科縫線4-0(揚(yáng)州源康醫(yī)療器械有限公司);生理鹽水(山東科倫藥業(yè)有限公司);甲苯胺藍(lán)O(北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司);BSA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);AChE測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所);SOD測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所);MDA測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。304不銹鋼微型彈簧,購(gòu)自永嘉縣智翔五金有限公司,線徑0.08 mm,外徑0.35 mm,長(zhǎng)度5.0 mm。

2 方 法

2.1 微彈簧致雙側(cè)頸總動(dòng)脈狹窄復(fù)制小鼠CCH模型

小鼠30只,禁食過夜后,按體重隨機(jī)分為2組,每組15只。腹腔注射水合氯醛400 mg/kg麻醉后,仰臥位固定于37 ℃恒溫手術(shù)臺(tái),碘伏和75%酒精消毒皮膚,沿小鼠頸部中線皮膚剪開一條2 cm的小口,鈍性剝離結(jié)締組織及頜下腺,分離兩側(cè)頸總動(dòng)脈。解剖鏡下將微彈簧繞頸總動(dòng)脈旋轉(zhuǎn)推進(jìn)至套于血管外側(cè)[4],兩側(cè)均套置成功后,縫合創(chuàng)口,同時(shí)腹腔注射5萬單位青霉素鈉,以防感染。小鼠置37 ℃恒溫孵育箱待蘇醒后,常規(guī)飼養(yǎng),每籠3只動(dòng)物。假手術(shù)組小鼠除兩側(cè)頸總動(dòng)脈不套置微彈簧外,其他手術(shù)過程同CCH模型組小鼠。

2.2 模型驗(yàn)證

2.2.1 甲苯胺藍(lán)O灌注染色考察腦低灌程度 小鼠造模后24 h,水合氯醛麻醉,仰臥位固定于37 ℃恒溫手術(shù)臺(tái),開胸暴露心臟,止血鉗鉗夾心尖部位固定心臟,剪開右心耳,自左心室灌注10 mL生理鹽水,沖洗排除血管內(nèi)血液,再于左心室緩慢灌注(30 s)5 mL 0.1%的甲苯胺藍(lán)O生理鹽水溶液,作為組織灌流指示劑,隨即沿顱骨中縫打開顱骨,小心剝離全腦,生理鹽水沖洗粘附血液,濾紙吸干水分,稱重,置于小鼠腦切片模具(東莞市捷凱精工電子有限公司),冠狀切成2 mm厚腦片,前切面向下順序放置于培養(yǎng)皿中,于凝膠成像系統(tǒng)(上海天能5200Multi)反射可見光條件下拍照。另外,收集腦片,加入9倍量生理鹽水,手持式電動(dòng)組織勻漿器(德國(guó)IKA T10)勻漿,5000×g離心10 min,每樣品取上清150 μL,加于96孔板,于540 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下測(cè)定每孔光吸收,基于標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算單位腦質(zhì)量甲苯胺藍(lán)O含量,定量表征腦組織甲苯胺藍(lán)灌注水平,以反映全腦灌注水平。

2.2.2 Morris水迷宮考察學(xué)習(xí)記憶 微彈簧致小鼠CCH造模后4個(gè)月,Morris水迷宮考察小鼠認(rèn)知功能。訓(xùn)練前兩日,平臺(tái)位于水面以上1 cm,第1天將小鼠置于水中平臺(tái)停留30 s以熟悉訓(xùn)練環(huán)境,第2天將小鼠從4個(gè)象限分別放入迷宮,等小鼠尋找到平臺(tái),并在平臺(tái)停留10 s,若在120 s之內(nèi)仍未找到平臺(tái),則引導(dǎo)小鼠至平臺(tái)并停留10 s;隨后進(jìn)行連續(xù)5 d的定位航行實(shí)驗(yàn),將小鼠從每象限中點(diǎn)背靠迷宮壁放入水中,記錄小鼠尋找至平臺(tái)時(shí)間(逃避潛伏期),如果120 s內(nèi)小鼠仍未找到平臺(tái),則引導(dǎo)此小鼠至平臺(tái)停留15 s,將其逃避潛伏期記為120 s,每象限訓(xùn)練間隔時(shí)間30 s。在隨后的空間探索實(shí)驗(yàn)中,撤掉平臺(tái),隨機(jī)選定兩個(gè)非目標(biāo)象限,輪流將小鼠放于迷宮,記錄小鼠于2 min內(nèi)穿越原平臺(tái)位置次數(shù)、不同象限停留時(shí)間及其游泳路程,計(jì)算小鼠在目標(biāo)象限停留時(shí)間及游泳路程百分比,以表征小鼠長(zhǎng)時(shí)程空間學(xué)習(xí)記憶情況。實(shí)驗(yàn)中平臺(tái)位置及參照物保持不變,水溫設(shè)定為25 ℃,小鼠訓(xùn)練結(jié)束后,吸水紙和毛巾擦干,原籠飼養(yǎng)。

2.3 肉蓯蓉毛蕊花苷提取物對(duì)腦低灌注小鼠認(rèn)知功能影響評(píng)價(jià)

本研究中,模型組小鼠造模70只,禁食過夜后隨機(jī)選取12只作為假手術(shù)組,余58只按2.1方法復(fù)制小鼠CCH模型。造模組于第2日隨機(jī)分為CCH模型組、毛蕊花苷提取物低、中、高劑量組,各組小鼠分籠飼養(yǎng),每籠3只。考慮本研究所復(fù)制小鼠CCH模型于雙側(cè)頸總動(dòng)脈套置不銹鋼彈簧,長(zhǎng)期灌胃抓握小鼠可能導(dǎo)致小鼠頸總動(dòng)脈機(jī)械損傷,加之肉蓯蓉已作為藥食同源植物,安全性較高,且本研究旨在為肉蓯蓉提取物作為功能飲品開發(fā)提供借鑒,因此研究采用于飲水中添加毛蕊花苷提取物方式給予小鼠,添加質(zhì)量濃度分別為0.16、0.32和0.64 g/L,毛蕊花苷提取物溶解于無菌純凈水后,0.22 μm除菌濾膜過濾后使用,每日定時(shí)更換新鮮配制的毛蕊花苷提取物溶液。假手術(shù)組和CCH模型組給予無菌純凈水。于給予毛蕊花苷提取物4個(gè)月后,按“2.2.2”中的方法,Morris水迷宮測(cè)定各組小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。

2.4 海馬組織乙酰膽堿酯酶活力及氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,斷頸處死小鼠,迅速取腦,分離兩側(cè)海馬組織,精確稱重后,加入9倍量生理鹽水,冰浴條件勻漿,4 ℃下5000×g離心10 min,取上清液,按照試劑盒方法測(cè)定各組小鼠海馬區(qū)乙酰膽堿酯酶(AChE)活力、超氧化物歧化酶(SOD)活力及丙二醛(MDA)水平。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定上清總蛋白濃度,進(jìn)一步校準(zhǔn)AChE、SOD活力和MDA水平。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié) 果

3.1 微彈簧致雙側(cè)頸總動(dòng)脈狹窄成功復(fù)制小鼠全腦低灌注模型

為驗(yàn)證單次手術(shù)兩側(cè)頸總動(dòng)脈套置微彈簧對(duì)小鼠腦灌注的影響,利用甲苯胺藍(lán)O染液灌注后,觀察腦組織染色情況,結(jié)果如圖1所示。假手術(shù)組小鼠腦組織對(duì)甲苯胺藍(lán)O均有明顯著色,腦白質(zhì)著色最深,CCH模型組小鼠全腦著色明顯降低。圖1中定量比色測(cè)定結(jié)果表明,CCH造模后24 h,腦灌注水平比假手術(shù)組降低了54.9%,表明采用微彈簧致雙側(cè)頸總動(dòng)脈狹窄,可成功復(fù)制全腦低灌注模型。

圖1 甲苯胺藍(lán)O染色表示CCH模型小鼠腦組織灌流改變

為驗(yàn)證模型組小鼠是否產(chǎn)生認(rèn)知功能障礙,利用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠的認(rèn)知情況。小鼠定位航行過程逃避潛伏期的變化(圖2(a))結(jié)果說明,隨著訓(xùn)練天數(shù)增長(zhǎng),模型組小鼠未對(duì)水迷宮內(nèi)標(biāo)注物有所識(shí)別,未表現(xiàn)出學(xué)習(xí)功能,至訓(xùn)練第五天時(shí),逃避潛伏期為73±47 s,與對(duì)照組(26±21 s)比較其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。原平臺(tái)位置的穿越次數(shù)(圖2(b))、目標(biāo)象限(原平臺(tái)所在象限)的路程比(圖2(c))以及時(shí)間比(圖2d)三項(xiàng)指標(biāo),與對(duì)照組比較其差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。以上結(jié)果說明,該慢性全腦低灌注方法可導(dǎo)致小鼠認(rèn)知功能障礙。

圖2 Morris水迷宮測(cè)定全腦低灌注致小鼠認(rèn)知功能變化

3.2 毛蕊花苷改善慢性全腦低灌注所致小鼠認(rèn)知障礙

為確定毛蕊花苷對(duì)小鼠認(rèn)知障礙的影響,利用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠的認(rèn)知功能。小鼠定位航行過程逃避潛伏期(圖3(a))的結(jié)果說明,受毛蕊花苷干預(yù)的CCH小鼠對(duì)水迷宮內(nèi)部標(biāo)志物表現(xiàn)出良好的學(xué)習(xí)記憶能力,隨著訓(xùn)練的進(jìn)行可更快地尋找到救援平臺(tái)。毛蕊花苷各劑量組均能顯著縮短其逃避潛伏期時(shí)間(P<0.01),至訓(xùn)練第五天時(shí),低中高劑量逃避潛伏期分別為50±21 s,44±16 s, 40±27 s,與模型組(83±37s)比較組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。撤去平臺(tái)后,穿越平臺(tái)次數(shù)結(jié)果(圖3(b))表明,中高劑量組與模型組相比組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),低劑量組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。目標(biāo)象限路程百分比(圖3(c))和時(shí)間百分比(圖3(d))兩項(xiàng)指標(biāo)均表明,各劑量組與模型組相比,組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組相比,高劑量毛蕊花苷組可將路程比和時(shí)間比分別提高8.6%、8.3%。

3.3 毛蕊花苷下調(diào)慢性全腦低灌注所致小鼠腦乙酰膽堿酯酶活力升高

為進(jìn)一步探究毛蕊花苷如何改善CCH模型小鼠認(rèn)知功能障礙,通過檢測(cè)小鼠腦部海馬區(qū)AChE活力(圖4),反映小鼠腦部神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo)情況。CCH模型小鼠建成之后,與對(duì)照組相比小鼠腦部海馬區(qū)AChE活力顯著升高(P<0.01)。單因素方差分析的結(jié)果表明:毛蕊花苷各劑量組均能顯著降低CCH小鼠AChE活力(P<0.01)，與模型組相比,高劑量毛蕊花苷組可降低 0.26 U/mg。

3.4 毛蕊花苷改善慢性全腦低灌注所致小鼠腦部氧化應(yīng)激損傷

為探究毛蕊花苷能否改善小鼠腦部氧化應(yīng)激損傷,對(duì)小鼠腦部海馬區(qū)SOD活力、MDA的含量進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果分別如圖5、圖6所示。與假手術(shù)組相比,CCH模型小鼠腦部海馬區(qū)的SOD活力明顯降低(P<0.01),MDA含量明顯升高(P<0.01)。單因素方差分析的結(jié)果表明:毛蕊花苷中高劑量可顯著升高SOD活力(P<0.01),但是低劑量組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。毛蕊花苷各劑量組均能顯著降低MDA含量(P<0.01),高劑量毛蕊花苷組可使MDA 含量降低至模型組的82.5%。

圖3 毛蕊花苷對(duì)全腦低灌注致小鼠認(rèn)知功能損害的影響

圖4 毛蕊花苷對(duì)慢性全腦低灌注小鼠海馬區(qū)AChE活力的影響

圖5 毛蕊花苷影響慢性全腦低灌注小鼠海馬區(qū)SOD活力情況

圖6 毛蕊花苷影響慢性全腦低灌注小鼠海馬區(qū)MDA含量

4 討 論

肉蓯蓉具有補(bǔ)腎陽(yáng),益精血,潤(rùn)腸通便之功效,已有蓯蓉總苷膠囊用于血管性癡呆臨床干預(yù)[12],但該制劑中主要含有松果菊苷和異毛蕊花糖苷,毛蕊花苷含量較低[13],尚不足以支持毛蕊花苷對(duì)血管性癡呆有明確干預(yù)作用。有研究表明毛蕊花苷對(duì)缺血性腦損傷有神經(jīng)保護(hù)作用[14],但缺乏其對(duì)腦低灌注致認(rèn)知功能障礙的確切作用證據(jù)。本研究于飲水中補(bǔ)充較低質(zhì)量濃度(0.16～0.64 g/L)毛蕊花苷，明顯改善了小鼠認(rèn)知功能障礙。有研究表明毛蕊花苷具有良好的水溶性及穩(wěn)定性[15],其來源植物肉蓯蓉已為藥食同源植物。本研究提示或可以毛蕊花苷作為關(guān)鍵指標(biāo)成分,開發(fā)基于肉蓯蓉的功能飲品,以改善老年人因腦供血不足而引發(fā)輕度認(rèn)知功能障礙。

乙酰膽堿(ACh)是腦部神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo)所必需的神經(jīng)遞質(zhì),AChE活力值升高必定會(huì)引發(fā)ACh的過度水解,引發(fā)腦部神經(jīng)傳導(dǎo)紊亂,參與諸多類型癡呆的發(fā)生[16]。本研究表明毛蕊花苷下調(diào)CCH模型小鼠海馬組織AChE活性,或可改善腦內(nèi)ACh水平,改善認(rèn)知功能障礙,但仍待進(jìn)一步研究確證。慢性腦低灌注致神經(jīng)元損傷以及中樞膽堿功能障礙與慢性炎癥及氧化應(yīng)激損傷相關(guān)[17],此時(shí)過量生成活性氧可直接損傷各類生物大分子及不飽合脂肪酸,活性氧可滅活抗氧化酶進(jìn)一步加劇氧化應(yīng)激損傷,這一失代償過程引發(fā)活性氧大量積累并誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡,并致認(rèn)知功能障礙發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)CCH小鼠晚期海馬組織SOD活性明顯下降,MDA水平明顯升高,提示海馬組織抗氧化酶已處于失代償?shù)膰?yán)重氧化應(yīng)激狀態(tài)。給予毛蕊花苷后,CCH小鼠海馬組織SOD活力明顯升高,MDA水平明顯下降,表明毛蕊花苷一定程度上通過抗氧化作用發(fā)揮改善CCH小鼠認(rèn)知功能障礙的作用。

5 結(jié) 論

本研究復(fù)制了CCH小鼠認(rèn)知功能損害模型，于飲水中補(bǔ)充肉蓯蓉毛蕊花苷提取物,明顯改善CCH小鼠認(rèn)知功能下降及腦組織氧化應(yīng)激狀態(tài),提示肉蓯蓉毛蕊花苷部位對(duì)改善慢性腦低灌注致神經(jīng)損傷有一定保護(hù)作用。