郭文琴 許勰 劉曦 高建莉

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 杭州 310053 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

乳腺癌是中青年女性高發(fā)疾病之一，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，雖然其病因尚未完全闡明，但既往研究表明，抑郁障礙等不良負(fù)性情緒與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[1-4]。2017年美國(guó)整合腫瘤學(xué)會(huì)（Society for Integrative Oncology，SIO）臨床實(shí)踐指南指出，乳腺癌患者伴發(fā)抑郁的比例為3%～34%，伴發(fā)焦慮的比例12%～47%，11%～16%的患者同時(shí)伴有焦慮和抑郁癥狀[5]。研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥會(huì)進(jìn)一步促使腫瘤惡化，極大降低患者治療的依從性，并影響治療效果[6]。然而，情志失調(diào)是如何促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展的，目前尚缺乏可靠的科學(xué)依據(jù)。

胸腺作為機(jī)體的中樞免疫器官，在維持機(jī)體正常的免疫功能中發(fā)揮重要作用。同時(shí)，人體免疫系統(tǒng)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有密切聯(lián)系，情緒障礙和應(yīng)激事件可以影響免疫功能，而免疫功能的改變也可能成為抑郁障礙的病因[7-12]。有研究表明，抑郁障礙患者體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量明顯下降[13]。但情志失調(diào)對(duì)乳腺癌機(jī)體胸腺的發(fā)育及其功能的影響以及具體機(jī)制如何，尚無(wú)系統(tǒng)研究。

前期研究發(fā)現(xiàn)，胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP），作為一種白細(xì)胞介素-7（interleukin-7，IL-7）樣細(xì)胞因子，在乳腺癌機(jī)體中表達(dá)增加，通過(guò)激活其下游的TSLP因子相關(guān)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活[14-15]。此外，抑郁癥患者體內(nèi)IL-7水平降低，與抑郁程度呈負(fù)相關(guān)[16]。以上結(jié)果提示，TSLP及IL-7的表達(dá)以及下游通路的激活情況，可能是研究情志失調(diào)狀態(tài)下的乳腺癌機(jī)體免疫功能的關(guān)鍵。

為此，本研究采用慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）刺激乳腺癌小鼠，對(duì)其胸腺形態(tài)、病理變化、功能變化及相關(guān)因子和蛋白的表達(dá)進(jìn)行系統(tǒng)的研究，以期探明情志內(nèi)傷時(shí)乳腺癌小鼠胸腺功能的變化及其對(duì)乳腺癌發(fā)展的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞株 小鼠乳腺癌細(xì)胞株4T1由美國(guó)芝加哥大學(xué)何通川教授惠贈(zèng)。5周齡無(wú)特殊病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)雌性BALB/c小鼠，共30只，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005]，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心全封閉SPF環(huán)境中[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（浙）2021-0012]，室溫25℃，相對(duì)濕度40%～60%，每日光照12 h，自由攝食和飲水。本研究經(jīng)過(guò)浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理審查（批準(zhǔn)編號(hào)：IACUC-20210517-07）。

1.2 主要試劑 達(dá)爾伯克改良伊格爾高糖培養(yǎng)基（Dulbecco's modified eagle medium，DMEM） 購(gòu)于美國(guó)Gibco公司（批號(hào)：8121525）；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS） 購(gòu)于天杭生物公司 （批號(hào)：19110503）；DNA提取酚試劑購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司（批號(hào)：1026Y011）；哺乳動(dòng)物基因組DNA提取試劑盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）凝膠制備試劑盒、含4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色液的防熒光淬滅劑均購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所（批號(hào)：081020210105、082720201230、121720201228、041 221211026）；血清素/5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購(gòu)于生工（上海）生物工程股份有限公司（批號(hào)：H129AD0273）；Rabbit anti-mouse CD3、Rabbit anti-mouse CD4、Rabbit anti-mouse CD8a抗體均購(gòu)于BD Pharmingen公司（批號(hào)：1025233、0231898、3276860）；Rat anti-Mouse CK5抗體購(gòu)于Affinity Biosciences公司（批號(hào)：57u2005）；Rabbit anti-Mouse CK8、TSLP，Goat anti-Rabbit IgG抗體均購(gòu)于Abcam公司（批號(hào)：GR3181962-4、GR3728 1-1、GR3299244-3）； 異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate isomer，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的Mouse anti-Rabbit IgG、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（phospho-signal transducer and activator of transcription 3，p-STAT3） 抗體均購(gòu)于Santa Cruz公司（批號(hào)：K2017、D3015、A0521、A0723）；Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2） 抗體、 磷酸化Janus激酶2（phospho-Janus kinase 2，p-JAK2）抗體、磷脂酰肌醇-3-激酶p110α （phosphatidylinositol-3-kinase p110α，PI3K p110α）抗體、磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶p85/p55（phospho-phosphatidylinositol-3-kinase p85/p55，p-PI3K p85/p55）抗體均購(gòu)于Cell Signaling Technology公司（批號(hào)：13、3、9、6）；F（ab’） 2-Goat Anti-Mouse IgG（H+L）Alexa Fluor 594購(gòu)于達(dá)文生物有限公司（批號(hào)：GAR48810900223）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 4T1細(xì)胞采用含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基，置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d傳代。

1.3.2 CUMS乳腺癌小鼠模型建立 選取健康BALB/c小鼠30只，隨機(jī)分為正常組、模型組、CUMS-1組、CUMS-2組及CUMS-3組，每組6只。除模型組及正常組外， 每只小鼠每日施以CUMS：（1）夾尾3 min；（2）160 次/min水平搖晃5 min；（3）圓筒束縛3 h：將小鼠放入固定器中，限制小鼠活動(dòng)，使其不能前進(jìn)、后退及轉(zhuǎn)身，每天夜間進(jìn)行束縛；（4）傾斜鼠籠1 h。每次采用1種刺激，每日分別刺激1（CUMS-1組）、3（CUMS-2組）、5（CUMS-3組）次，隨機(jī)安排，使小鼠不能預(yù)知下次的刺激，以避免產(chǎn)生適應(yīng)，共刺激30 d。CUMS刺激5 d后，除正常組外，每只小鼠均于右側(cè)第二對(duì)乳腺脂肪墊下接種1×107/mL 4T1細(xì)胞懸液100 μL，制備小鼠4T1乳腺癌荷瘤抑郁模型。造模48 h后，觀察到接種部位有點(diǎn)狀凸起，即為造模成功。

1.3.3 模型小鼠行為指標(biāo)檢測(cè)

1.3.3.1 一般狀況觀察 于模型建立前、模型建立后10、20及30 d分別觀察各組小鼠外觀體征、行為活動(dòng)。

1.3.3.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)（open field test，OFT） 模型建立后，用OFT法進(jìn)行測(cè)試。自制方形敞箱，箱底面積為50 cm×50 cm，等分為25格，箱高50 cm。記錄小鼠在中央?yún)^(qū)域（中間9格）及邊緣區(qū)域（中央?yún)^(qū)域外周的16格）的停留時(shí)間。從小鼠4爪均進(jìn)入方格開(kāi)始計(jì)算，每次測(cè)定小鼠3 min內(nèi)的運(yùn)動(dòng)情況。

1.3.3.3 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)（forced swimming test，F(xiàn)ST）正式實(shí)驗(yàn)前1 d先行預(yù)實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練游泳，將小鼠置于高約30 cm，直徑20 cm的透明玻璃圓桶中，水深15 cm，水溫（25±5）℃，確保小鼠不能跳出水槽或觸及底部。正式實(shí)驗(yàn)時(shí)以攝像機(jī)記錄小鼠6 min內(nèi)的游泳過(guò)程，并對(duì)最后4 min內(nèi)的不動(dòng)（漂浮以及上身不動(dòng)，下肢踩水算作不動(dòng)）時(shí)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.3.4 小鼠體質(zhì)量和腫瘤體積的測(cè)量 每5 d稱(chēng)量小鼠體質(zhì)量1次，觀察并記錄給藥后小鼠體質(zhì)量變化。用游標(biāo)卡尺測(cè)量瘤體長(zhǎng)徑（length，L）和短徑（width，W），單位均為mm，根據(jù)公式計(jì)算腫瘤體積（volume，V）（mm3）：V=（L+W）×L×W×0.2618。

1.3.5 小鼠腫瘤質(zhì)量及各臟器指數(shù)的檢測(cè) 眼球取血后脫頸椎處死小鼠，剖取瘤體、胸腺、肺臟、肝臟，稱(chēng)量質(zhì)量后拍照，計(jì)算臟器指數(shù)和肺轉(zhuǎn)移率。按下列公式計(jì)算：臟器指數(shù)（%）=臟器質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）×100%。

1.3.6 ELISA檢測(cè)5-HT水平 小鼠眼球取血后斷頭處死，取小鼠大腦組織0.2 g，置于0.9%氯化鈉溶液中冰浴勻漿，離心取上清液，依照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)5-HT水平。

1.3.7 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time quantitative polymerase chain reaction， Real-time qPCR）檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞基因組DNA中T細(xì)胞受體重排刪除環(huán)（T cell receptor rearrangement excision circles，TRECs）的表達(dá) 小鼠取新鮮抗凝血，裂解紅細(xì)胞后離心收集細(xì)胞沉淀。按哺乳動(dòng)物基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞DNA。反應(yīng)體系共20 μL，包括 2×SG Fast qPCR 10 μL，10 μmol·L-1的上下游引物各0.4μL，PCR-grade water 8.2 μL，Template cDNA 1 μL。 混勻后離心5 s，使用熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：94℃，4 min；94 ℃，30 s；57 ℃，30 s；72 ℃，31 s，共40個(gè)循環(huán)。引物均由生工（上海）生物工程股份有限公司合成，序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3.8 Real-time qPCR檢測(cè)胸腺中TSLP、STAT3、IL-1α、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-17、 叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子p3（forkhead transcription factor p3，F(xiàn)oxp3）、 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）mRNA表達(dá) 以組織RNA快速提取試劑盒提取胸腺RNA，按照cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。 反應(yīng)體系共20 μL， 包括2×SG Fast qPCR 10 μL，10 μmol·L-1的上下游引 物各0.4 μL，PCR-grade water 8.2 μL，Template cDNA 1 μL。 混勻后離心5 s，使用熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：94 ℃，4 min；94 ℃，30 s；57 ℃，30 s；72 ℃，31 s，共40個(gè)循環(huán)。引物均由生工（上海）生物工程股份有限公司合成，序列見(jiàn)表1。

1.3.9 免疫熒光法檢測(cè)胸腺上皮細(xì)胞（thymus epithelial cells，TECs）分布 胸腺組織以4%中性甲醛固定48 h后，脫水，透明，浸蠟，包埋，行5 μm切片。 切片脫臘水化后，進(jìn)行微波修復(fù)，0.3% H2O2室溫孵育15 min，加入一抗后4℃孵育過(guò)夜；洗滌后加入熒光標(biāo)記的二抗，室溫避光孵育2 h；用含DAPI染色液的防熒光淬滅劑封片，以VS120-S6-W數(shù)字病理切片（熒光）掃描分析儀觀察。

1.3.10 流式細(xì)胞術(shù)分析胸腺T細(xì)胞亞群 完整分離小鼠胸腺，用注射器的無(wú)菌活塞研磨胸腺組織，取胸腺細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，1 500 r·min-1低速離心5 min，去掉上清液，重懸細(xì)胞并洗滌1次，4℃下以1%牛血清蛋白（bovine albumin， BSA）封閉20 min。 加入CD3、CD4、CD8抗體， 冰上避光孵育30 min。 以BD C6流式細(xì)胞儀采集數(shù)據(jù)，并使用FCS Express V3進(jìn)行分析，Image J軟件分析熒光強(qiáng)度。

1.3.11 免疫印跡法檢測(cè)TSLP、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、PI3K、p-PI3K蛋白表達(dá) 將小鼠胸腺完整取出，勻漿提取總蛋白，以蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定總蛋白濃度（實(shí)驗(yàn)方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)）。通過(guò)電泳分離，將蛋白轉(zhuǎn)移至活化的聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜上，隨后封閉，加入一抗4℃孵育過(guò)夜；洗膜3次后加入二抗，室溫避光孵60 min。 化學(xué)發(fā)光（efficient chemiluminescence，ECL）試劑盒顯色，利用Image J軟件定量分析蛋白灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)分析，組內(nèi)比較用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。OFT及FST視頻以Smart 3.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般狀況觀察 造模30 d后，正常組及模型組小鼠毛色光亮，身形健碩，活動(dòng)靈敏，自主活動(dòng)能力良好，自主活動(dòng)多；CUMS-1組及CUMS-2組小鼠毛色較粗糙，身形略消瘦，活動(dòng)略遲鈍，自主活動(dòng)能力變差；CUMS-3組小鼠毛色粗糙，身形極消瘦，活動(dòng)遲鈍，自主活動(dòng)能力差。

2.2 各組小鼠OFT比較 與正常組比較，模型組、CUMS-1組及CUMS-3組小鼠的中央?yún)^(qū)域停留時(shí)間均略有減少；CUMS-2組停留時(shí)間延長(zhǎng)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠運(yùn)動(dòng)軌跡Fig.1 Movement trajectory of each group

2.3 各組小鼠FST比較 與正常組小鼠的不動(dòng)時(shí)間（80.07±46.63）s比較，模型組不動(dòng)時(shí)間增加至（132.52±49.78） s、CUMS-1組增至（163.51±18.81） s，CUMS-3組增至（141.65±16.51） s，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），CUMS-2組小鼠不動(dòng)時(shí)間與正常組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 各組小鼠體質(zhì)量和腫瘤體積比較 正常組與模型組小鼠體質(zhì)量隨飼養(yǎng)天數(shù)增加而增加，兩組間體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與正常組比較，造模第1～15天內(nèi)CUMS-1、CUMS-2和CUMS-3組小鼠體質(zhì)量均顯著降低，造模第15天時(shí)降到最低，CUMS-2組下降最為明顯（P＜0.01），CUMS-3組次之（P＜0.001），CUMS-1組下降幅度最小（P＜0.01）。造模15 d后，各組體質(zhì)量逐漸升高。見(jiàn)圖2。

圖2 各組小鼠體質(zhì)量、腫瘤體積比較Fig.2 Comparison of body weight and tumor volume in each group

此外，模型組及CUMS各組小鼠腫瘤體積均隨實(shí)驗(yàn)天數(shù)增加而增加。與模型組比較，CUMS各組腫瘤體積均降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。CUMS-1組小鼠腫瘤體積最大，CUMS-3組次之，CUMS-2組最小，但組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖2。

2.5 各組小鼠腫瘤質(zhì)量及各臟器指數(shù)比較 與正常組比較，模型組及CUMS-1、CUMS-2和CUMS-3組小鼠脾臟指數(shù)升高（P＜0.01，P＜0.0001，P＜0.01，P＜0.0001）。各組胸腺質(zhì)量及指數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組比較，CUMS-1和CUMS-3組小鼠腫瘤質(zhì)量無(wú)明顯變化，腫瘤指數(shù)升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各荷瘤組腫瘤肺轉(zhuǎn)移率均達(dá)到100%。與模型組比較，CUMS-3組小鼠乳腺癌肺轉(zhuǎn)移灶總數(shù)由（12.13±3.06）個(gè)增加至（16.86±4.46）個(gè)。見(jiàn)表2、圖3。

表2 各組小鼠臟器指數(shù)Tab.2 Mice organ index in each group （±s， n=6）

表2 各組小鼠臟器指數(shù)Tab.2 Mice organ index in each group （±s， n=6）

注：與正常組比較，##P＜0.01，####P＜0.0001。Note:Compared with normal group，###P＜0.001，####P＜0.0001.

組別 腫瘤質(zhì)量（g） 腫瘤指數(shù)（%） 脾臟指數(shù)（%） 胸腺質(zhì)量（g） 胸腺指數(shù)（%）正常組 - - 0.45±0.04 0.05±0.02 0.26±0.10模型組 0.47±0.20 2.45±1.01 1.49±0.50## 0.04±0.01 0.22±0.03 CUMS-1 組 0.64±0.25 3.74±1.64 2.04±0.39#### 0.04±0.01 0.27±0.04 CUMS-2 組 0.28±0.07 1.59±0.30 0.99±0.22## 0.05±0.01 0.26±0.05 CUMS-3 組 0.60±0.15 3.45±0.94 1.52±0.14#### 0.04±0.01 0.25±0.03

圖3 各組小鼠代表性臟器Fig.3 The representative organs in each group

2.6 各組小鼠大腦組織5-HT水平比較 與正常組比較，模型組小鼠大腦組織5-HT水平無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組比較，CUMS-1組及CUMS-2組小鼠5-HT水平無(wú)明顯變化，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），CUMS-3組小鼠5-HT水平顯著降低（P＜0.01），提示每日5次刺激使荷瘤小鼠5-HT水平紊亂。見(jiàn)圖4。

圖4 各組小鼠大腦組織5-HT水平比較Fig.4 Comparison of 5-HT levels in brain tissue in each group

2.7 各組小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞基因組DNA中TRECs表達(dá)比較 與正常組比較，模型組外周血中TRECs表達(dá)顯著升高（P＜0.01）； 與模型組比較，CUMS-3組小鼠外周血中TRECs表達(dá)明顯降低（P＜0.01），提示接受刺激的荷瘤小鼠近期胸腺輸出功能顯著降低。見(jiàn)圖5。

圖5 各組小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞基因組DNA中TRECs表達(dá)比較Fig.5 Comparison of TRECs expression in genomic DNA of peripheral blood mononuclear cells in each group

2.8 各組小鼠胸腺TSLP、Foxp3、IL-7、IL-1α、IL-12、IL-17、STAT3、TGF-β1和TNF-α等mRNA水平比較與正常組比較，模型組小鼠胸腺中IL-7 mRNA水平顯著降低（P＜0.001）， 而TSLP、Foxp3、IL-1α、IL-12、IL-5、IL-6、IL-10、STAT3、TGF-β1和TNF-α均顯著升高（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001，P＜0.0001）。 與模型組比較，CUMS-3組小鼠胸腺中TSLP及IL-7 mRNA水平均顯著升高 （P＜0.001）， 而Foxp3、IL-1α、IL-12、IL-6、IL-5、IL-10、IL-17、STAT3、TGF-β1和TNF-α水平均顯著降低（P＜0.01，P＜0.001，P＜0.0001）。 見(jiàn)圖6。

圖6 各組小鼠胸腺中 TSLP、Foxp3、IL-1α、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-17、STAT3、TGF-β1和 TNF-α mRNA表達(dá)比較Fig.6 Comparison of TSLP， Foxp3， IL-1α， IL-5， IL-6， IL-7， IL-10， IL-12， IL-17， STAT3， TGF-β1and TNF-α mRNA expression in thymus in each group

2.9 各組小鼠胸腺中TECs分布比較 免疫熒光結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠胸腺中髓質(zhì)部分TECs（橙色陽(yáng)性細(xì)胞）的數(shù)量減少，CK5及CK8表達(dá)量降低（P＜0.001，P＜0.01）；與模型組比較，CUMS-3組小鼠胸腺中髓質(zhì)部分TECs（橙色陽(yáng)性細(xì)胞）的數(shù)量進(jìn)一步減少，CK5及CK8表達(dá)量顯著降低 （P＜0.01，P＜0.01），提示髓質(zhì)中TECs的萎縮。 見(jiàn)圖7。

圖7 小鼠胸腺組織免疫熒光結(jié)果Fig.7 Results of immunofluorescence in mice thymus

2.10 各組小鼠胸腺中T細(xì)胞亞群變化 與正常組比較，模型組及CUMS-3組小鼠胸腺中CD3+CD4+CD8-及CD3+CD4-CD8+T細(xì)胞百分比均顯著升高（P＜0.05），CD3+CD4-CD8-及CD3+CD4+CD8+T細(xì)胞比例均顯著降低（P＜0.05），CUMS組在模型組的基礎(chǔ)上，變化趨勢(shì)更加明顯。提示腫瘤和慢性應(yīng)激均使胸腺的陽(yáng)性選擇功能和成熟T細(xì)胞向外周血輸出的過(guò)程受抑制。見(jiàn)圖8。

圖8 小鼠胸腺中T細(xì)胞亞群比例Fig.8 T cell subset ratio in mice thymus

2.11 各組小鼠胸腺TSLP、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、PI3K、p-PI3K蛋白表達(dá)比較 與正常組比較，模型組小鼠胸腺中p-JAK2、p-STAT3、PI3K、p-PI3K p55、p-PI3K p85表達(dá)均升高（P＜0.05）；與模型組比較，CUMS-3組p-PI3K p85、TSLP表達(dá)均升高（P＜0.05），p-JAK2、p-PI3K p55表達(dá)均降低（P＜0.05），提示腫瘤可能激活胸腺的JAK2/STAT3通路，而CUMS抑制JAK2及p-PI3K p55的磷酸化。見(jiàn)圖9。

圖9 各組小鼠胸腺中TSLP/STAT3通路及IL-7下游蛋白表達(dá)比較Fig.9 Comparison of expressions of TSLP/STAT3 pathway and IL-7 downstream protein in thymus in each group

3 討論

乳腺腫瘤，中醫(yī)屬于“乳巖”“乳石癰”“奶巖”等范疇，是在各種致瘤因素作用下，乳腺局部組織失去正常生長(zhǎng)形態(tài)而導(dǎo)致的異常增生?！兜は姆āぞ砦濉ぐb疽》云：“不得于夫，不得于舅姑，憂怒郁悶，昕夕累積，脾氣消阻，肝氣橫逆，遂成隱核，如大棋子，不痛不癢，數(shù)十年后，方為瘡陷，名曰奶巖，以其瘡形嵌凹似巖穴也。不可治矣?！盵17]表明乳腺癌與抑郁/焦慮等情緒失調(diào)有密切的聯(lián)系，并在發(fā)生發(fā)展過(guò)程中相互影響。本研究探討了乳腺癌和CUMS刺激下小鼠胸腺功能的變化，并試圖闡明其可能的作用機(jī)制。

研究表明，5-HT作為中樞系統(tǒng)中重要的神經(jīng)遞質(zhì)，參與睡眠、精神活動(dòng)、情緒變化等生理反應(yīng)，擾亂5-HT的釋放和重吸收，將導(dǎo)致抑郁障礙產(chǎn)生[18]。本研究中，CUMS-3組小鼠大腦5-HT水平明顯下降，且強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)，說(shuō)明小鼠發(fā)生情緒失調(diào)，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)主要圍繞正常組、模型組及CUMS-3組開(kāi)展。

TECs是胸腺中最主要的胸腺基質(zhì)細(xì)胞，為胸腺細(xì)胞的發(fā)育提供最適宜的生存環(huán)境，是胸腺發(fā)揮功能的基礎(chǔ)[19]。CK5和CK8是TECs的特異性標(biāo)志物[20-22]。 本研究結(jié)果提示，小鼠胸腺中TECs的CK5及CK8表達(dá)量降低，表明CUMS干預(yù)可能使小鼠TECs表型發(fā)生改變，導(dǎo)致上皮組織發(fā)生萎縮。

本研究發(fā)現(xiàn)，CUMS刺激對(duì)荷瘤小鼠的胸腺輸出功能有明顯的抑制作用，小鼠外周血TRECs降低，胸腺中T細(xì)胞亞群的比例紊亂。TRECs是T細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）基因重排過(guò)程中的副產(chǎn)物，與胸腺的輸出功能密切相關(guān)。通過(guò)定量分析樣本中單位數(shù)量T細(xì)胞中TRECs的水平，可以檢測(cè)胸腺近期輸出初始T細(xì)胞的數(shù)量，從而反映胸腺的輸出功能[23-24]。同時(shí)，機(jī)體免疫功能的正常狀態(tài)依賴于T細(xì)胞亞群數(shù)量和比例的平衡。CD3是所有T細(xì)胞表面的標(biāo)志物，而具有輔助功能的CD4＋T細(xì)胞和具有殺傷功能的CD8＋T細(xì)胞是T細(xì)胞中最重要的兩類(lèi)亞群，在胸腺細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。本研究中，CUMS-3組小鼠T細(xì)胞亞群比例失調(diào)，胸腺輸出功能受限，T細(xì)胞的陽(yáng)性選擇受阻，胸腺免疫功能出現(xiàn)下降，提示CUMS刺激下荷瘤小鼠胸腺輸出功能降低。

本研究進(jìn)一步檢測(cè)了胸腺相關(guān)基因的表達(dá)，以探究CUMS影響胸腺功能的可能機(jī)制。IL-7可促進(jìn)T細(xì)胞的分化、維持幼稚T細(xì)胞在胸腺中分化，并參與維持外周CD4＋、CD8＋T細(xì)胞等免疫細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。 TSLP作為一種IL-7樣細(xì)胞因子，可調(diào)節(jié)未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC）激活、CD4+T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞發(fā)育[25-27]。同時(shí)，IL-7與抑郁也存在一定聯(lián)系，抑郁患者體內(nèi)的IL-7水平降低，而且IL-7水平與抑郁程度呈負(fù)相關(guān)，可能是與抑郁相關(guān)的T細(xì)胞功能受損所致[16]。本研究中，CUMS刺激可特異性調(diào)控荷瘤小鼠胸腺內(nèi)TSLP及IL-7水平。 Foxp3、IL-1α、IL-12、IL-6、IL-5、IL-10、IL-17、STAT3、TGF-β1及TNF-α同樣參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)。研究表明，乳腺癌機(jī)體中Foxp3、IL-1α、IL-6、IL-12、IL-17、STAT3、IL-10、TNF-α、TGF-β1等因子表達(dá)明顯上調(diào)[28-32]，這與本研究結(jié)果一致，而CUMS干預(yù)后前述因子變化趨勢(shì)一致，未出現(xiàn)特異性改變，因此未進(jìn)行更進(jìn)一步的研究。以上結(jié)果提示，小鼠胸腺免疫功能的改變可能主要受TSLP及IL-7表達(dá)影響。免疫印跡結(jié)果顯示，CUMS刺激抑制了荷瘤小鼠體內(nèi)受TSLP過(guò)度激活的JAK2-PI3K通路蛋白p-JAK2及IL-7下游蛋白p-PI3K p55的表達(dá)。既往研究證明，在乳腺癌機(jī)體中TSLP表達(dá)增加，并通過(guò)誘導(dǎo)抗凋亡分子Bcl-2的表達(dá)來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活，并介導(dǎo)其轉(zhuǎn)移到肺部[14]。由此筆者推測(cè)，乳腺癌機(jī)體中TSLP表達(dá)增加，激活JAK2-STAT3通路，破壞了胸腺結(jié)構(gòu)和輸出功能，導(dǎo)致胸腺功能紊亂；而抑郁情緒可能通過(guò)抑制過(guò)度活化的JAK2-PI3K通路，進(jìn)一步破壞荷瘤機(jī)體的胸腺結(jié)構(gòu)與功能，并進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活和肺轉(zhuǎn)移，加速乳腺癌發(fā)病進(jìn)程。

綜上所述，CUMS刺激下的乳腺癌小鼠會(huì)出現(xiàn)情緒失調(diào)，小鼠胸腺結(jié)構(gòu)發(fā)生以髓質(zhì)上皮組織萎縮為代表的損壞，胸腺輸出淋巴細(xì)胞的功能受到一定程度的抑制，其作用機(jī)制可能與抑制JAK2-PI3K通路有關(guān)。本研究結(jié)果將為乳腺癌的發(fā)生發(fā)展及其與情志的相互影響提供新的科學(xué)依據(jù)，為乳腺癌機(jī)體的胸腺免疫研究提供了新的方向。