鮑榮榮 陳韋華 王 欣 許春雙 牛艷芳 王 芳 樓 瓊宋 飛 朱斌斌 王欽文* 徐淑君1，***

（1）寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院，浙江省病理生理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧波315211；2）寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，寧波315020；3）寧波醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，寧波315000；4）浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，寧波315000；5）寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科，寧波315020）

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一種進(jìn)行性的神經(jīng)退行性疾病，臨床上主要表現(xiàn)為漸進(jìn)性的認(rèn)知功能減退、學(xué)習(xí)記憶能力下降和精神行為異常，在老年人群中AD發(fā)病率占各類癡呆的60%以上［1］，并且隨著平均壽命的增加，AD的發(fā)病率也會(huì)急速上升［2］。

AD 是一個(gè)受環(huán)境和基因影響的復(fù)雜疾病，其中70%AD 發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)因素是由于遺傳改變引起的［3］。AD主要的致病蛋白β淀粉樣蛋白（amyloid beta，Aβ）是由40 或42 個(gè)氨基酸構(gòu)成的短肽，是淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）的水解產(chǎn)物［4］。APP是一種跨膜蛋白，在細(xì)胞生理功能的調(diào)節(jié)中起重要作用，它參與突觸發(fā)生和突觸可塑性［5］。APP在體內(nèi)的裂解存在兩種途徑：一種是α 分泌酶在Aβ 結(jié)構(gòu)域內(nèi)切割，產(chǎn)生具有神經(jīng)營養(yǎng)功能和神經(jīng)保護(hù)作用的APP 片段，稱為非淀粉樣肽源途徑（non-amyloidogenic）［6］；另一種是β位 點(diǎn) 剪 切 酶（β-site APP cleaving enzyme 1，BACE1）和γ 剪切酶在Aβ 結(jié)構(gòu)域的兩端切割，產(chǎn)生Aβ片段，稱為淀粉樣肽源途徑（amyloidogenic）［7］。大量研究都表明，BACE1基因刪除或表達(dá)抑制后，Aβ 生成顯著減少［8］。因此，BACE1的調(diào)節(jié)在AD發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。

精神分裂癥斷裂基因1 （disrupted-inschizophrenia-1，DISC1）位于1號(hào)染色體，最初發(fā)現(xiàn)于一個(gè)精神疾病高發(fā)的蘇格蘭家族［9］。DISC1的基因突變與精神分裂癥、雙向情感障礙、重度抑郁癥等精神疾病的發(fā)病有著密切聯(lián)系［10］。最近的全基因組關(guān)聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)，DISC1的一個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP1q42，rs6675281）與AD的發(fā)病有顯著相關(guān)性［11］。在皮質(zhì)發(fā)育過程中，DISC1和APP的結(jié)合在神經(jīng)元遷移中起關(guān)鍵作用，增加DISC1的表達(dá)挽救了由APP 表達(dá)缺失引起的遷移缺陷［12］。在8 月齡APP/PS1AD 轉(zhuǎn)基因鼠中，DISC1的表達(dá)下降，增加DISC1的表達(dá)會(huì)促進(jìn)BACE 1往溶酶體的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而導(dǎo)致BACE 1在溶酶體的降解［13］。據(jù)此，可以推斷DISC1和AD 的發(fā)病有著顯著相關(guān)性。

表觀遺傳學(xué)是連接環(huán)境與遺傳基因變化的橋梁，DNA 甲基化是一種經(jīng)典表觀修飾，參與多種疾病的發(fā)生，包括糖尿病、精神分裂癥、AD等［14］。然而目前有關(guān)人體血液樣本中DISC1的甲基化修飾與AD的相關(guān)性尚不清楚。本研究采用亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化后焦磷酸測序分析的方法，檢測了中國漢族51 例AD 患者和63 例健康對(duì)照者DISC1的甲基化水平，分析其與AD發(fā)生的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 血液樣本收集

本研究收集了來自寧波第一醫(yī)院和寧波康寧醫(yī)院的散發(fā)性AD患者51例（男性27人，女性24人）和與AD組性別、年齡相匹配的正常對(duì)照63例（男性39人，女性24人）。散發(fā)性AD患者由兩位有經(jīng)驗(yàn)的神經(jīng)內(nèi)科臨床醫(yī)生（CZ 和ZQ）根據(jù)ICD-10、國家神經(jīng)和交流障礙及中風(fēng)-阿爾茨海默病的相關(guān)疾病協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)診斷，結(jié)合患者的病史和家族史、神經(jīng)系統(tǒng)檢查、血液研究、腦成像研究、神經(jīng)心理測試和認(rèn)知篩查測試等方法進(jìn)行判定。所有的對(duì)照人群都沒有任何類型的身體或精神障礙。所有參與者為居住在寧波市的漢族人。本研究經(jīng)寧波大學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。所有參與者或其監(jiān)護(hù)人均已簽署知情同意書。

1.2 生化因子檢測

分別采用雙縮脲法和溴甲酚綠法測定血清總蛋白（total protein，TP）和白蛋白（albumin，ALB）濃度，球蛋白（globulin，GLB）計(jì)算為TP 減去ALB。采用速率法測定谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）的含量。使用循環(huán)酶法測定總膽汁酸（total bile acid，TBA）和同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy） 的水平。采用酶法測糖（glucose，Glu）、甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、肌酐（creatinine，CRE）和尿酸（uric acid，UA）含量。使用一步檢測法測定高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）水平。通過比濁法測量載脂蛋白A（apolipoprotein A，ApoA）和載脂蛋白B（apolipoprotein B，ApoB）含量。分別采用終點(diǎn)法和膠乳凝集法檢測血清脂蛋白a（lipoprotein A，Lp（a））和C 反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）濃度。使用免疫比濁法檢測載脂蛋白E（apolipoproten E，ApoE）水平。

1.3 亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化后焦磷酸測序分析

用核酸提取分析儀（Lab-Aid 820，廈門，中國） 根據(jù)操作規(guī)程從外周血提取DNA。使用Nanodrop 1000測定DNA濃度和純度。通過亞硫酸氫 鈉DNA 轉(zhuǎn) 化 化 學(xué)（EpiTech Bisulfite Kits；Qiagen） 和 聚 合 酶 鏈 式 反 應(yīng)（PCR） 擴(kuò) 增（Pyromark PCR試劑盒；Qiagen）制備DNA。為檢測DISC1甲基化水平，使用Pyromark Q24 儀器進(jìn)行焦磷酸測序分析。用于甲基化定量的PCR 正向引 物：5＇-GGGGATTTAGAGAGGTTGTAAAG-3＇、反向引物：5＇-生物素-CCTAAACTACCTCCTACTCCT-3＇和 測 序 引 物：5＇-GTTAATGTTGGAAAGGAAAT-3＇。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 軟件16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或Mann-Whitney U秩和檢驗(yàn)來確定AD病例和對(duì)照之間基線數(shù)據(jù)的差異。通過Pearson或Spearman 相關(guān)性檢驗(yàn)評(píng)估DISC1甲基化與代謝特征之間的關(guān)聯(lián)（P＜0.05 被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。

2 結(jié) 果

2.1 DISC1啟動(dòng)子的CpG島區(qū)甲基化分析

對(duì)DISC1啟 動(dòng) 子 的CpG 島 區(qū) （chr1：231 762 415～231 763 115） 進(jìn) 行 焦 磷 酸 測 序（圖1），共測量2 個(gè)CpG 位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)2 個(gè)CpG 位點(diǎn)的甲基化水平之間存在顯著相關(guān)性（r＞0.671，P＜0.001，表1），因此在隨后的分析中進(jìn)一步測量了2種CpG的平均DNA甲基化。

Fig.1 Correlations among seven promoter CpG sites of DISC1

Table 1 Comparisons of DISC1 methylation levels between cases and controls

2.2 生化因子與AD之間的關(guān)聯(lián)分析

本研究共納入51 名AD 患者和63 名對(duì)照。在19 個(gè)臨床特征中（表2），AD 組中ALB、Lp（a）和Hcy 水平均高于對(duì)照組（P=0.04，P=0.000 4，P=0.01）；AD 組ALT、HDL-C 和CRP 水平低于對(duì)照組（P=0.04，P=0.000 4，P=0.02）。通過Logistic回歸分析進(jìn)一步證實(shí)Lp（a）升高增加AD 的風(fēng) 險(xiǎn)（OR（95% CI）=19.72 （2.072, 187.693），P=0.009，表3）。

2.3 DISC1甲基化與AD 的相關(guān)性分析

本研究結(jié)果表明，DISC1的兩個(gè)CpG 位點(diǎn)在AD 組均能觀察到顯著的甲基化水平升高（P=0.000 7；P=2.27E-6，表1）。通過ROC 曲線用來評(píng)估診斷能力［15］，DISC1啟動(dòng)子甲基化的曲線下面積（ACU） 為0.726 （95% CI：0.626～0.827），靈敏度和特異度分別為0.569和0.869（圖2）。這些結(jié)果表明，DISC1啟動(dòng)子高甲基化可能是AD 潛在的生物標(biāo)志物。運(yùn)用Logistic 回歸分析評(píng)估AD 的風(fēng)險(xiǎn)，結(jié)果顯示，DISC1啟動(dòng)子高甲基化增加了AD 的風(fēng)險(xiǎn)（OR（95% CI）=2.403（1.117，5.171），P=0.025，表3）。隨后進(jìn)一步分析DISC1啟動(dòng)子甲基化與患者生化指標(biāo)之間的相關(guān)性（圖3），女性患者中ApoA（r=0.490，P=0.003）與DISC1啟動(dòng)子甲基化呈正相關(guān)（r=0.431，P=0.010）；男性患者中Lp（a）與DISC1啟動(dòng)子甲基化呈正相關(guān)（r=0.538，P=1.14E-4）。

Table 2 Characteristics of subjects from cases and controls

Table 3 Logistic regression analysis of the risk of AD

Fig.2 The receiver operating characteristic（ROC）curve analysis of AD

Fig.3 Correlations between biochemical parameters of samples and DISC1 promoter methylation level

3 討 論

本研究分析了AD患者和對(duì)照組DISC1的啟動(dòng)子甲基化水平，以闡明DISC1的啟動(dòng)子甲基化與AD 的關(guān)聯(lián)性，結(jié)果顯示AD 組的甲基化水平顯著高于對(duì)照組。AD的ROC曲線也表明DISC1的啟動(dòng)子高甲基化可以作為AD的潛在生物標(biāo)志物。相關(guān)分析顯示，ApoA 與DISC1的啟動(dòng)子甲基化在女性病例中呈正相關(guān)；Lp（a）與DISC1的啟動(dòng)子甲基化在男性病例中呈正相關(guān)。

外周血樣本方便易得，且甲基化水平與腦組織甲基化水平具有良好的一致［16-17］。本研究表明，AD 組的DISC1啟動(dòng)子甲基化程度顯著高于對(duì)照組，DISC1啟動(dòng)子的高甲基化可能會(huì)降低DISC1的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致AD 發(fā)生。以往的研究表明，在8月齡APP/PS1AD 轉(zhuǎn)基因鼠中，DISC1的表達(dá)下降［13］，本研究結(jié)果提示在AD 病人中也存在類似的改變。DISC1 降低參與AD 的可能機(jī)制是，DISC1 下降使BACE1 往溶酶體的轉(zhuǎn)運(yùn)降低，從而導(dǎo)致BACE 1在溶酶體的降解減少［13］。DISC1含有LC3 的結(jié)合位點(diǎn)，DISC1 有助于促進(jìn)Aβ 引起的受損線粒體自噬，而DISC1 降低，使線粒體自噬過程受阻，從而引起突觸可塑性損傷和AD認(rèn)知功能障礙［18］。

本研究檢測了19個(gè)生化與AD的關(guān)聯(lián)性，發(fā)現(xiàn)AD 組中ALB、Lp（a）和Hcy 水平均高于對(duì)照組。AD組ALT、HDL-C和CRP水平低于對(duì)照組。血漿Hcy 水平的增加被認(rèn)為是AD 的危險(xiǎn)因素，并且最近的研究已經(jīng)證明Hcy濃度的增加能增加總Tau和磷酸化Tau，并形成Tau 寡聚體，從而增加AD 風(fēng)險(xiǎn)［19］。之前的研究也證實(shí)了中度AD 患者血漿CRP 水平的降低［20］。此外，較低的CRP 水平與較快的認(rèn)知衰退相關(guān)［21］。

為了找出DISC1啟動(dòng)子甲基化與生化指標(biāo)之間的關(guān)聯(lián)，本研究還進(jìn)行了相關(guān)分析。結(jié)果顯示，ApoA 水平與女性DISC1啟動(dòng)子甲基化有關(guān)，Lp（a）水平與男性DISC1啟動(dòng)子甲基化有關(guān)。ApoA有轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇和調(diào)節(jié)炎癥的作用，并且影響Aβ 聚集和沉積［22］，因此ApoA 也被視為神經(jīng)退行性疾病潛在的診斷標(biāo)志物［23］；臨床研究結(jié)果證實(shí)，Lp（a）血清濃度與AD風(fēng)險(xiǎn)呈非線性關(guān)系顯著相關(guān)，可能的原因是Lp（a）血清濃度的升高會(huì)增加腦血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)從而間接影響AD的發(fā)?。?4］。

4 結(jié) 論

總之，本研究表明，AD 患者DISC1啟動(dòng)子的甲基化水平顯著高于對(duì)照組，外周血DISC1啟動(dòng)子高甲基化是AD 發(fā)生的高風(fēng)險(xiǎn)因素，其可能是AD診斷潛在的生物標(biāo)志物。