王 浩 李 濤 肖 歸 劉梅冬 劉 可 張華莉 朱雅茜** 肖獻(xiàn)忠**

（1）中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，長沙410008；2）膿毒癥轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)湖南省重點實驗室，長沙410008；3）醫(yī)學(xué)機能學(xué)國家級實驗教學(xué)中心，長沙410078；4）嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，梅州514031；5）中南大學(xué)湘雅護(hù)理學(xué)院，長沙410008）

膿毒癥（sepsis）是宿主在嚴(yán)重感染等因素作用下，免疫反應(yīng)失調(diào)引起器官功能障礙的一種威脅生命的臨床綜合征［1-3］，是各種嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷、感染以及大手術(shù)后常見的并發(fā)癥，其病情進(jìn)展迅速，病死率高，給臨床救治帶來許多挑戰(zhàn)［4］。據(jù)統(tǒng)計，全球每年住院的嚴(yán)重膿毒癥病例數(shù)接近1 900萬，每年有多達(dá)500萬人死于膿毒癥［5-6］，是當(dāng)前危害人類健康的重要問題。膿毒癥發(fā)病機制復(fù)雜，當(dāng)膿毒癥發(fā)生時，病原體相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular patterns， PAMPs）和損傷相關(guān)分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）作用多個系統(tǒng)，導(dǎo)致各種細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活和多種基因表達(dá)調(diào)控的改變，引起復(fù)雜的病理生理改變和多種組織器官損傷［7］。

凝血功能的紊亂是膿毒癥發(fā)生發(fā)展過程中重要的病理生理變化之一。當(dāng)凝血系統(tǒng)被激活，觸發(fā)凝血級聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生大量微血栓甚至彌散性血管內(nèi)凝血（disseminated intravascular coagulation， DIC）的形成，最終導(dǎo)致多器官功能衰竭，是患者死亡的重要原因［8-9］?？鼓委熆梢欢ǔ潭雀纳颇δ芪蓙y，提高患者膿毒癥DIC 患者的生存率［10］。研究膿毒癥凝血功能紊亂的發(fā)生機制，找到新的藥物干預(yù)靶標(biāo)，對提高患者的生存率具有重要意義。

熱休克因子1（heat shock factor 1，HSFl）是機體內(nèi)一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等病理過程中起到了重要的調(diào)控作用。課題組的前期研究顯示，HSF1 對小鼠內(nèi)毒素血癥具有明顯的保護(hù)作用，HSF1通過上調(diào)熱休克蛋白70的表達(dá)，抑制內(nèi)毒素所致晚期炎癥介質(zhì)高遷移率族蛋白1的釋放，減輕全身炎癥反應(yīng)［11-12］，也可以通過直接調(diào)控粒細(xì)胞集落刺激因子、白介素-10 等多種炎癥因子的表達(dá)［13-15］，減輕內(nèi)毒素血癥小鼠的多器官損傷。HSF1作為膿毒癥發(fā)生發(fā)展過程中重要的保護(hù)因子，對膿毒癥凝血功能紊亂起到調(diào)控作用目前報道較少。因此，本研究旨在探討HSF1是否通過改善膿毒癥小鼠的凝血活性從而對小鼠的肺組織起到一定的保護(hù)作用，以期揭示HSF1在膿毒癥凝血功能障礙中的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗小鼠為HSF1 基因敲除（HSF1-/-）和野生型（HSF1+/+）小鼠，由美國密爾沃基威斯康星州醫(yī)學(xué)院Ivor J Benjamin教授惠贈［16］，中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院實驗動物中心負(fù)責(zé)飼養(yǎng)，SPF級，經(jīng)過小鼠基因型鑒定、篩選及配種繁殖，獲取合格的HSF1-/-和HSF1+/+小鼠，性別和年齡同等匹配，雌雄各半，年齡8～12周，體重20～25 g。動物實驗得到中南大學(xué)實驗動物倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 小鼠行盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（cecal ligation and puncture，CLP）構(gòu)建小鼠膿毒癥模型

小鼠CLP 實驗?zāi)Ｐ徒⒖嘉墨I(xiàn)方法進(jìn)行［17-18］。具體步驟如下：取HSF1-/-和HSF1+/+小鼠，首先用2%異氟烷麻醉小鼠。充分暴露小鼠腹部，沿腹中線垂直剪開腹部皮膚和肌層約0.5～1 cm，于左下腹腹腔中取出盲腸后，在靠近盲腸末端中外1/3 處穿線結(jié)扎，取21 號針在外1/3 處給予盲腸對穿孔，并用鑷子輕輕擠出少許糞便以保證穿孔處通暢，關(guān)閉腹腔，術(shù)后皮下注射1 ml 溫?zé)嵘睇}水液體復(fù)蘇。實驗結(jié)束，觀察小鼠的變化以判斷膿毒癥模型建模成功。

1.3 血液樣本采集和處理

心臟穿刺法采血。在穿刺前，在注射器中加入抗凝劑（3.8%檸檬酸鈉，1∶9），提取血液并上下顛倒充分混合。血液樣本立即在4°C，1 000g，離心15 min。血漿樣本立即用于凝血指標(biāo)分析。剩余的血漿樣品在-80℃下冷凍，用于后續(xù)實驗。

1.4 小鼠肺組織病理學(xué)觀察

小鼠脫頸處死，迅速提取部分肺組織，置于4%多聚甲醛中固定24 h，經(jīng)脫水、透明、透蠟和石蠟包埋后切成3～5μm厚度的薄片，切片再使用二甲苯脫蠟后，各級濃度的乙醇水化及蒸餾水沖洗，蘇木精（hematoxylin，H）及伊紅（eosin，E）水溶液中染色5～15 min，常規(guī)清洗、酒精脫水，二甲苯透明后中性樹膠封片。HE 染色后的組織切片置于光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)的變化并進(jìn)行病理學(xué)評分以判斷組織損傷程度。

1.5 肺組織濕/干重比（wet/dry ratio，W/D）檢測

采用肺組織濕/干重比檢測來評估小鼠肺水腫的程度。小鼠在CLP 后不同時間點脫頸處死，開胸摘除一側(cè)肺組織并稱重（濕重）。肺組織在80°C下加熱24 h，以獲得干重并計算W/D比值。

1.6 組織免疫熒光染色

在不同時間點處死CLP 模型小鼠。立即取出左肺，用4%多聚甲醛固定24 h。石蠟包埋后，將組織切成4 μm的切片。經(jīng)抗原修復(fù)后，加5%山羊血清封閉液，室溫放置20 min。隨后，加入抗纖維蛋白/纖維蛋白原一抗（1∶200，Abcam），4oC 下避光孵育過夜。加入FITC 山羊抗兔IgG（1∶250，Abclonal）的熒光二抗，37℃避光孵育1～1.5 h。加抗熒光衰減封片液封片。熒光顯微鏡（全景MIDI全景250，匈牙利）進(jìn)行圖像采集。

1.7 qRT-PCR

使用TRIzol?試劑（Invitrogen Thermo Fisher，美國） 提取肺組織或細(xì)胞中的總RNA，經(jīng)PrimeScript 逆轉(zhuǎn)錄酶（TaKaRa，日本）和隨機引物逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用Applied Biosystems 7500 PCR 儀器進(jìn)行PCR 反應(yīng)。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃30 s；變性95℃5 s；退火延伸60℃34 s；40個循環(huán)。在60℃設(shè)置熒光檢測點。qRT-PCR 的引物序列為：蛋白質(zhì)C （Pro C） 上游引物，5＇-ATCTGTGACTTCGAGGAGGC-3＇，下游引物，5＇-ATTGTTCACCCGACAGTCCT-3＇；β-actin 上 游 引物，5＇-CATTGCTGAC AGGATGCAGAAGG-3＇，下游引物，5＇-TGCTGGAAGGTGGACAGTGAGG-3＇。以2-△△Ct表示每個樣本mRNA的相對表達(dá)量。

1.8 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

小鼠心臟采血后，立即4°C，1 000g，離心15 min，收集上清即血漿于新的滅菌EP 管中用于BCA 蛋白定量和活化蛋白質(zhì)C （APC）（CSBE09914m，湖北武漢）的含量檢測。方法按照廠家提供的標(biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行。

1.9 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）

從肺組織或細(xì)胞中分離的蛋白質(zhì)樣品經(jīng)SDSPAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移到PVDF膜后，5%牛奶封閉液中（TBST 配制） 封閉2 h，加入蛋白質(zhì)C（1∶1 000，GeneTex）和β-actin（1∶2 500，Cell Signalling Technology）抗體，4°C孵育過夜。加入用5%BSA 配制的相應(yīng)二抗，室溫?fù)u床孵育1.5 h。TBST 洗膜3 次后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光法顯色，結(jié)果采用ImageJ軟件對圖像進(jìn)行定量分析。

1.10 質(zhì)粒構(gòu)建及提取

組成活化型HSF1質(zhì)粒pcDNA3.1（+）/HSF1（+）（mHSF1）和空載體質(zhì)粒pcDNA3.1（+）/HSF1-wt 由瑞士Pharmaceuticals S.A.的Richard Voellmy博士提供。蛋白質(zhì)C 全長質(zhì)粒pGL3-ProC-wt（ProC-wt，-621～-1 bp）和突變質(zhì)粒pGL3-ProC-mut（HSE1-mut，-584～-577 bp突變）的構(gòu)建由上海生物有限工程公司完成，通過測序結(jié)果驗證了合成序列的真實性。質(zhì)粒提?。―6950-01，Omega）根據(jù)廠家說明書進(jìn)行，提取后的質(zhì)粒-20°C下存儲，用于后續(xù)實驗。

1.11 細(xì)胞核蛋白的提取

bEnd.3 細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)皿中43°C 熱處理60 min［19］。 細(xì) 胞 核 蛋 白 提 取（20126ES50，Yeasen）按以下步驟進(jìn)行：細(xì)胞收集于離心管中，在細(xì)胞沉淀中按每20 μl 加入含PMSF 的試劑A 200μl。最高速劇烈渦旋5 s，完全懸浮分散細(xì)胞沉淀，冰浴10～15 min。加入胞漿蛋白抽提試劑B（試劑B）10μl，最高速劇烈渦旋5 s，冰浴1 min。最高速劇烈震蕩渦旋5 s，4℃離心，12 000～16 000g，5 min。去除上清，加入含PMSF的試劑C 50μl。最高速劇烈渦旋15～30 s，完全懸浮分散沉淀，置于冰中，每隔1～2 min 再高速劇烈渦旋15～30 s，共持續(xù)30 min。然后，4℃，12 000～16 000g離心10 min。立即吸取上清（細(xì)胞核蛋白）至另一預(yù)冷的離心管中。BCA 法檢測蛋白質(zhì)濃度后立即使用或-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.12 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

bEnd.3 細(xì)胞在含10% 的胎牛血清（FBS）（Gibco，Thermo Fisher Scientific）的高糖DMEM（Gibco，Thermo Fisher Scientific）培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞鋪板后，待生長密度控制在70%～80%進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，使用Lipofectamine?3000 Reagent（L3000015，Invitrogen）進(jìn)行質(zhì)粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

1.13 凝膠電泳遷移實驗 （electrophoretic mobility shift assay，EMSA）

根據(jù)蛋白質(zhì)C 啟動子區(qū)的HSE［20-21］序列進(jìn)行設(shè)計并由上海生物工程技術(shù)公司合成寡核苷酸探針（包括標(biāo)記探針、競爭探針和突變探針）（表1）。蛋白質(zhì)C 寡核苷酸探針（顯示為單鏈） 如下： 5＇-ctggtcctgagctgaGAAGTTTCagacaacagcattt-3＇。EMSA 使用EMSA 試劑盒（20148，Thermo Fisher Scientific）操作，方法參照文獻(xiàn)進(jìn)行［22］。用鏈霉親和素-辣根過氧化物酶結(jié)合物和化學(xué)發(fā)光底物檢測生物素標(biāo)記的DNA。超遷移實驗加用抗HSF1 抗體（ab2923，Abcam）2 μl 加入到反應(yīng)體系中。

1.14 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?/h3>

bEnd.3 細(xì)胞培養(yǎng)并鋪24 孔板，用500 ng 蛋白質(zhì)C 報告基因質(zhì)粒、500 ng mHSF1 質(zhì)?；蚩蛰d體質(zhì)粒pcDNA3.1 和20 ng 內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK 共轉(zhuǎn)染（L3000015，Invitrogen）48 h。使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（E1910，Promega）進(jìn)行操作，并使用SynergyHI 熒光酶標(biāo)儀（BioTek）分析檢測。數(shù)據(jù)以螢火蟲熒光量與海腎熒光量的比值表示。

1.15 統(tǒng)計學(xué)分析

收集并整理數(shù)據(jù)，使用SPSS21.0 和GraphPad Prism7.0 進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩兩比較采用t檢驗，多組比較采用ANOVA單因素方差分析，然后采用Bonferroni 事后檢驗（Bonferroni post hoc test）。以P＜0.05 表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HSF1減輕膿毒癥小鼠的急性肺損傷

首先采用CLP 構(gòu)建小鼠膿毒癥模型，在不同的時間點觀察CLP后小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)變化。HE 染色結(jié)果表明，CLP 后，小鼠的肺組織出現(xiàn)了不同程度的損傷，如肺臟血管充血、肺泡腔及肺間質(zhì)水腫、肺泡隔增厚、中性粒細(xì)胞浸潤等；通過半定量分析評估［23］膿毒癥小鼠的肺組織損傷程度，顯示肺組織損傷隨著時間的推移而逐漸增加（圖1a，b），而且，膿毒癥小鼠肺組織濕/干比增大（圖1c）。與HSF1+/+組相比，HSF1-/-組小鼠的肺損傷表現(xiàn)更明顯（圖1a-c）。結(jié)果表明，HSF1對膿毒癥所致肺組織損傷起到保護(hù)作用。

2.2 HSF1改善膿毒癥小鼠的凝血紊亂以及減少肺微血栓的形成

凝血功能的異常是膿毒癥的一個重要的病理生理學(xué)變化，為了了解膿毒癥小鼠的凝血功能，檢測了小鼠CLP 后凝血指標(biāo)的變化?；罨糠帜蠲?時 間 （activated partial thromboplastin time，APTT）和凝血酶原時間（prothrombin time，PT）是反映機體凝血功能的重要檢測指標(biāo)，分別反映內(nèi)源性凝血系統(tǒng)功能紊亂和外源性凝血系統(tǒng)功能紊亂。結(jié)果顯示，CLP 術(shù)后12 h 和24 h，小鼠APTT和PT均升高，HSF1-/-組明顯低于HSF1+/+組，兩組比較有統(tǒng)計學(xué)差異（圖2a，b）。結(jié)果表明，膿毒癥發(fā)生后，凝血系統(tǒng)被激活，與膿毒癥早期高凝狀態(tài)相符合，也說明HSF1對凝血過程激活產(chǎn)生了有效的抑制作用。微血栓形成是膿毒癥后凝血活化的重要標(biāo)志，而纖維蛋白原是血栓形成的重要反應(yīng)底物，在凝血過程中網(wǎng)羅紅細(xì)胞、血小板等形成穩(wěn)定血栓結(jié)構(gòu)，微血栓的形成與纖維蛋白（原）的沉積有著密切聯(lián)系［24-25］。因此，觀察了膿毒癥小鼠肺組織中纖維蛋白（原）的沉積。組織免疫熒光結(jié)果顯示（圖2c，d），在CLP后12 h，即可觀察到小鼠肺組織中有纖維蛋白（原）沉積，24 h 時逐漸增多，HSF1-/-組小鼠相比HSF1+/+組纖維蛋白（原）沉積明顯增多，說明膿毒癥小鼠的凝血系統(tǒng)被激活，大量的纖維蛋白（原）形成，從而促進(jìn)了微血栓的形成導(dǎo)致組織損傷。同時，也說明HSF1能夠通過減少小鼠肺組織中纖維蛋白（原）的沉積改善膿毒癥肺損傷。

2.3 HSF1通過增強蛋白質(zhì)C的表達(dá)改善膿毒癥小鼠凝血功能障礙

本課題組前期運用組織芯片已發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)C 在HSF1-/-組和HSF1+/+組內(nèi)毒素血癥小鼠模型中存在明顯差異［26］。分別收集HSF1-/-和HSF1+/+膿毒癥小鼠的血漿并提取肺組織中的mRNA和蛋白質(zhì)，檢測蛋白質(zhì)C的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CLP后血漿中蛋白質(zhì)C 水平升高，于術(shù)后12 h 達(dá)到高峰，而HSF1-/-小鼠血漿中的蛋白質(zhì)C 水平明顯低于HSF1+/+小鼠（圖3a）。膿毒癥造模后24 h，小鼠肺組織中蛋白質(zhì)C mRNA 和蛋白質(zhì)水平顯著降低，其中HSF-/-小鼠顯著低于HSF+/+小鼠（圖3b，c）。以上結(jié)果提示，膿毒癥發(fā)生后，凝血系統(tǒng)功能紊亂同時伴隨抗凝血系統(tǒng)的激活，蛋白質(zhì)C等抗凝血蛋白被釋放到血液中，參與了凝血平衡調(diào)控，HSF1可能通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)C表達(dá)從而抑制膿毒癥小鼠凝血系統(tǒng)活化。

Fig.2 Effects of HSF1 on the coagulatory function and pulmonary microthrombosis in septic mice

Fig.3 Effects of HSF1 on the gene expression and protein expression of activated protein C in plasma and lung tissue of septic mice

2.4 HSF1調(diào)控bEnd.3細(xì)胞中脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)C表達(dá)

為了探究HSF1 對蛋白質(zhì)C 表達(dá)的調(diào)節(jié)機制，采用HSF1 siRNA 或HSF1 過表達(dá)質(zhì)粒干預(yù)LPS 刺激的血管內(nèi)皮bEnd.3 細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS 刺激bEnd.3 細(xì)胞后，蛋白質(zhì)C mRNA 和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平均顯著增加。當(dāng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染HSF1 siRNA，蛋白質(zhì)C mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)水平與對照組細(xì)胞比較有顯著降低（圖4a，b），而HSF1過表達(dá)使蛋白質(zhì)C mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著高于對照組（圖4c，d）。以上結(jié)果表明，LPS刺激顯著上調(diào)bEnd.3細(xì)胞中蛋白質(zhì)C 表達(dá)，轉(zhuǎn)染HSF1 siRNA 或HSF1過表達(dá)質(zhì)粒分別抑制或促進(jìn)蛋白質(zhì)C的上調(diào)。

Fig.4 Effects of HSF1 on protein C mRNA and protein expression level in LPS-stimulated bEnd.3 cells

2.5 HSF1通過上調(diào)蛋白質(zhì)C轉(zhuǎn)錄保護(hù)膿毒癥小鼠凝血功能障礙

HSF1 作為轉(zhuǎn)錄因子，主要與靶基因的啟動子HSE 元件結(jié)合調(diào)控它們的轉(zhuǎn)錄。利用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)在蛋白質(zhì)C 啟動子區(qū)存在HSF1 結(jié)合元件（HSE）（圖5a，b），推測HSF1 可能通過與蛋白質(zhì)C 啟動子區(qū)域的HSEs 結(jié)合，直接調(diào)控蛋白質(zhì)C 的轉(zhuǎn)錄。運用EMSA 和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炋骄縃SF1 是否調(diào)控蛋白質(zhì)C 的轉(zhuǎn)錄。EMSA 實驗結(jié)果顯示，HSF1 可以直接結(jié)合蛋白質(zhì)C 啟動子區(qū)HSE1（-584～-577 bp）（圖5c）。此外，雙熒光素酶報告基因檢測顯示，共轉(zhuǎn)染mHSF1質(zhì)粒和ProCwt 報告質(zhì)粒后，熒光強度顯著增強。然而，共轉(zhuǎn)染mHSF1 質(zhì)粒和ProC-mut 報告質(zhì)粒后，熒光強度顯著降低，與EMSA的結(jié)果相一致（圖5d）。以上結(jié)果證實了HSF1在蛋白質(zhì)C的啟動子區(qū)域與HSEs結(jié)合，從而直接上調(diào)蛋白質(zhì)C的轉(zhuǎn)錄。

Fig.5 HSF1 directly upregulates protein C transcription

3 討 論

膿毒癥發(fā)病機制復(fù)雜，病情進(jìn)展迅速，病死率高。全球每年住院的嚴(yán)重膿毒癥病例數(shù)接近1 900萬，其中高達(dá)25%的嚴(yán)重膿毒癥患者和50%的膿毒性休克患者遭受死亡威脅［27］。凝血功能紊亂是膿毒癥發(fā)生發(fā)展過程中的重要病理過程，加速膿毒癥及多器官功能的惡化［28-29］。當(dāng)膿毒癥發(fā)生時，凝血系統(tǒng)被激活，觸發(fā)凝血級聯(lián)反應(yīng)，血小板消耗減少，微血栓形成，嚴(yán)重者引起DIC，患者可能出現(xiàn)明顯的血栓栓塞并發(fā)癥或臨床上表現(xiàn)不易察覺的微血管血栓形成，最終導(dǎo)致多器官功能衰竭［8-9］。本研究基于HSF1 敲除小鼠的CLP 模型，證實了HSF1 通過參與并抑制膿毒癥凝血系統(tǒng)激活，從而減輕小鼠膿毒癥所致肺損傷，并首次證實了HSF1通過直接上調(diào)蛋白質(zhì)C的轉(zhuǎn)錄對膿毒癥凝血功能紊亂起到部分保護(hù)作用。

本研究采用的是CLP 動物模型，該模型較好地模擬人類的膿毒癥，已被認(rèn)為是研究膿毒癥的金標(biāo)準(zhǔn)模型［30］。在該模型的基礎(chǔ)上，首先探討了HSF1 在整體動物水平對組織器官的保護(hù)作用，并觀察了HSF1是否參與了膿毒癥凝血過程。組織病理學(xué)結(jié)果顯示，HSF1 敲除小鼠在膿毒癥所致肺組織損傷中比野生型小鼠更明顯。凝血相關(guān)指標(biāo)APTT、PT以及肺組織中大量的纖維蛋白（原）沉積也反映了膿毒癥后，小鼠凝血系統(tǒng)激活，觸發(fā)了凝血活化過程，導(dǎo)致微血栓形成，從而加重了肺組織的缺血缺氧和肺功能損傷，且該病理變化在HSF1-/-組小鼠中比在HSF1+/+小鼠更明顯，這表明HSF1 參與了膿毒癥的凝血活化過程，而且HSF1能夠有效抑制膿毒癥的凝血系統(tǒng)活化從而對膿毒癥所致肺損傷起到保護(hù)作用。

蛋白質(zhì)C是一種維生素K依賴的血漿酶原，被凝血酶-凝血調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物激活后形成APC，在凝血的生理調(diào)節(jié)中起著重要作用［31］。蛋白質(zhì)C 能夠通過APC 和凝血酶激活的纖溶抑制劑（TAFI）來調(diào)節(jié)凝血和纖溶［32-33］。已有研究表明，在動物模型中，蛋白質(zhì)C系統(tǒng)的損傷可顯著惡化DIC，增加發(fā)病率和死亡率，而恢復(fù)APC 的功能可預(yù)防凝血功能障礙，減輕器官功能障礙［34］。蛋白質(zhì)C 水平的降低和蛋白質(zhì)C系統(tǒng)的抑制與膿毒癥相關(guān)凝血功能障礙的發(fā)生密切相關(guān)［35］。然而，HSF1是否能通過調(diào)控蛋白質(zhì)C減輕膿毒癥的凝血功能障礙尚不清楚。因此，首先構(gòu)建了HSF1敲除小鼠的膿毒癥模型，通過結(jié)合前期芯片結(jié)果，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)C在內(nèi)毒素血癥的HSF1-/-和HSF1+/+小鼠之間存在差異表達(dá)?；诖耍茰y蛋白質(zhì)C 可能在HSF1 敲除小鼠的膿毒癥肺損傷過程中發(fā)揮了重要作用。為了驗證這一假設(shè)，通過對膿毒癥小鼠血漿和肺組織進(jìn)行了ELISA、qRT-PCR和Western blot。結(jié)果顯示，膿毒癥后小鼠血漿中蛋白質(zhì)C 水平升高，于12 h 達(dá)峰值，隨后降低，且HSF1-/-組水平明顯低于HSF1+/+組。膿毒癥后，小鼠肺組織中蛋白質(zhì)C的蛋白質(zhì)和mRNA 水平均顯著下降，相比HSF1+/+組，HSF1-/-降低更明顯，有明顯統(tǒng)計學(xué)意義。細(xì)胞實驗也發(fā)現(xiàn)，LPS刺激增加了對照組bEnd.3細(xì)胞中蛋白質(zhì)C的蛋白質(zhì)和mRNA 的表達(dá)水平；而在細(xì)胞在轉(zhuǎn)染HSF1 siRNA 后，蛋白質(zhì)C 的蛋白質(zhì)和mRNA 的表達(dá)水平相比對照組明顯降低，在HSF1 過表達(dá)后，結(jié)果發(fā)生了相反的變化，與肺組織的實驗相一致。既往研究表明，在膿毒癥中，凝血系統(tǒng)的激活導(dǎo)致活化蛋白質(zhì)C系統(tǒng)嚴(yán)重破壞，是由于其持續(xù)的消耗和蛋白質(zhì)降解［36］，致其水平顯著降低。在嚴(yán)重膿毒癥時，內(nèi)源性不活躍的前體蛋白質(zhì)C的水平由于其在肝臟產(chǎn)生減少以及酶降解作用（如中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶）而降低，以及顯著下調(diào)血栓調(diào)節(jié)蛋白和內(nèi)皮蛋白質(zhì)C受體，導(dǎo)致蛋白質(zhì)C活化為APC量受損明顯［37-38］。研究的結(jié)果與這些報告相一致。本研究表明，蛋白質(zhì)C在膿毒癥早期階段快速分泌以增加其抗凝功能，之后因快速消耗和蛋白質(zhì)降解大量減少，削弱了其對凝血過程的抑制作用從而加速了微血栓的形成。在此過程中，也發(fā)現(xiàn)HSF1對肺組織和細(xì)胞中蛋白質(zhì)C的表達(dá)變化具有調(diào)控作用從而抑制凝血系統(tǒng)激活從而減輕膿毒癥器官損傷。

HSF1 是機體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，通過對多種基因的調(diào)控影響了疾病的發(fā)病過程。在應(yīng)激狀態(tài)下，HSF1 被激活形成三聚體，然后移位到細(xì)胞核中，與基因啟動子區(qū)域的特定HSE 元件結(jié)合，啟動熱休克（應(yīng)激）基因的轉(zhuǎn)錄激活［39-40］。此外，HSF1 也通過調(diào)節(jié)多種炎癥因子的表達(dá)，參與了炎癥反應(yīng)過程［15，41］。本研究中，分析了蛋白質(zhì)C 啟動子區(qū)域的序列，并確定了在基因啟動子區(qū)域含有HSEs，基于HSF1 的作用機制，推測HSF1 可能通過與蛋白質(zhì)C 啟動子的HSEs 結(jié)合，直接調(diào)控蛋白質(zhì)C 的轉(zhuǎn)錄。為了驗證上述假說，分別進(jìn)行了EMSA和雙熒光素酶報告基因分析，EMSA結(jié)果顯示HSF1 可以與蛋白質(zhì)C 啟動子區(qū)域的一個HSE（-584～-577 bp）結(jié)合。雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果進(jìn)一步揭示了HSF1直接上調(diào)蛋白質(zhì)C的轉(zhuǎn)錄。以上結(jié)果一致證實HSF1 通過與蛋白質(zhì)C 啟動子中HSEs 結(jié)合，上調(diào)蛋白質(zhì)C 的轉(zhuǎn)錄水平，抑制膿毒癥的凝血活化過程，從而減輕小鼠肺組織損傷。

4 結(jié) 論

本研究探討了HSF1 在膿毒癥發(fā)生發(fā)展中的作用，揭示了HSF1參與膿毒癥急性肺損傷的發(fā)生過程。HSF1 通過直接上調(diào)蛋白質(zhì)C 的轉(zhuǎn)錄抑制膿毒癥凝血活化過程從而減輕急性肺損傷的發(fā)生發(fā)展。本研究不僅揭示了膿毒癥凝血功能障礙的發(fā)生機制，而且為膿毒癥中凝血功能障礙的干預(yù)提供了新的理論依據(jù)。

推薦編委熊煒