路亞嵐 石桂英 王克維 白 琳

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，國家衛(wèi)生健康委員會人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，北京市人類重大疾病實驗動物模型工程技術(shù)研究中心，北京 100021）

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome system，UPS）是存在于真核細(xì)胞內(nèi)的一種高度選擇性的蛋白質(zhì)降解途徑，精確調(diào)控超過80%的錯誤折疊蛋白的降解［1］。泛素化過程需要3種泛素酶的協(xié)同作用，經(jīng)過E1泛素活化酶和E2泛素結(jié)合酶激活泛素，形成E2-泛素復(fù)合物，最后E3泛素連接酶識別特定靶蛋白，并催化泛素分子轉(zhuǎn)移到靶蛋白上［2］。E3 泛素連接酶在特異性靶標(biāo)識別以及泛素化系統(tǒng)活性調(diào)控中起著關(guān)鍵的作用［3］。

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是一種起病緩慢隱匿、呈進(jìn)行性進(jìn)展的神經(jīng)退行性疾病，后期患者會陷入僵木并喪失獨立生活能力［4-5］。中國在快速進(jìn)入老齡化社會，AD的發(fā)病呈現(xiàn)爆發(fā)式增長，給患者、家庭及社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)和嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)［6］。目前，AD 的發(fā)病機制尚不十分明確，極大限制了有效治療技術(shù)的開發(fā)。因此，進(jìn)一步探索AD 的分子病理機制及其基礎(chǔ)上的防治措施，是亟需解決的重要科學(xué)問題。

AD 的發(fā)生與淀粉樣蛋白的合成和清除障礙以及Tau蛋白的過度磷酸化密切相關(guān)，它們的異常沉積形成細(xì)胞外斑塊和胞內(nèi)的神經(jīng)纖維纏結(jié)，干擾神經(jīng) 元 功 能［4］。早 在1987 年，Mori 等［7］和Perry等［8］發(fā)現(xiàn)在老年斑和神經(jīng)纖維纏結(jié)上有泛素的存在。之后研究報道發(fā)現(xiàn)，UPS 功能下降可以抑制Aβ 蛋白降解、增加前體蛋白水解、提高β 位淀粉樣前體蛋白裂解酶1（BACE1）的表達(dá)量和增強γ分泌酶的活性，進(jìn)而導(dǎo)致淀粉樣蛋白沉降［9-10］。UPS受損會導(dǎo)致Tau聚集，引起過度磷酸化，而過度磷酸化的Tau蛋白又可以抑制UPS功能［10-11］。到目前為止，AD的可用藥物數(shù)量十分有限，新近研究的直接靶向Aβ 的藥物臨床實驗相繼宣告失敗［12］。因此，尋找其他有效靶點是AD防治的瓶頸問題［12］。UPS 的功能障礙與β 淀粉樣蛋白聚集、Tau 蛋白過度磷酸化、突觸功能抑制和載脂蛋白E功能異常密切關(guān)。靶向針對泛素蛋白酶體途徑有望防止神經(jīng)元異常聚集，進(jìn)而防止AD 的發(fā)生發(fā)展［13］。

本文通過生物信息學(xué)方法結(jié)合高通量基因芯片和統(tǒng)計學(xué)對生物數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)處理和分析，進(jìn)而揭示其中關(guān)鍵的生物學(xué)過程和信號通路，通過PPI蛋白互作篩選關(guān)鍵節(jié)點蛋白，通過公用數(shù)據(jù)庫查詢其定位和表達(dá)信息，進(jìn)而通過AD小鼠模型驗證，為AD 的深入機理的探索提供重要線索，以期為AD的預(yù)防和治療提供方案依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 AD患者數(shù)據(jù)集

基因表達(dá)數(shù)據(jù)集從NCBI 的GEO 數(shù)據(jù)庫（http://www.nci.nlm.nih.gov/geo）中檢索獲取。納入數(shù)據(jù)集的標(biāo)準(zhǔn)如下：a.樣本來自確診的AD患者和非癡呆對照組的腦組織；b.數(shù)據(jù)集中病例和對照組的可用樣本數(shù)≥50個。最終選擇分析表達(dá)數(shù)據(jù)集GSE15222（共363 例樣本，其中對照186 例，AD 176 例）和GSE36980（共80 例樣本，其中對照47例，AD 33例）。

1.1.2 實驗動物

本研究使用的AD 模型小鼠（APP/PS1 和5×FAD及其對照）為SPF級別，飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所的二層屏障環(huán)境動物房。飼養(yǎng)期間小鼠自由飲水取食，環(huán)境溫度24～26℃，光照12 h，黑暗12 h 常規(guī)飼養(yǎng)。選取8 月齡APP/PS1和6月齡5×FAD及其對照小鼠各3對，取大腦組織進(jìn)行后續(xù)檢測。本實驗中涉及的所有動物操作均得到中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所動物使用與管理委員會的批準(zhǔn)（IACUC 編號：WKW19001），并遵守3R原則人道主義地使用實驗動物。

1.1.3 實驗試劑

TRIzol試劑購買自美國ThermoFisher Scientific公 司；PrimeScript RT Master Mix （Perfect Real Time）（RR036A）和TB Green Premix Ex Taq TM II （TliRNaseH Plus）（RR82WR） 購 買 自 日 本TaKaRa公司。

1.1.4 實驗儀器

-80℃超低溫冰箱購自中國海爾公司；Nanodrop 2000 購買自美國ThermoFisher Scientific公司； StepOnePlusTM購買自美國 Applied Biosystems公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 DEGs的篩選和分析

采用GEO2R（http://www.nci.nlm.nih.gov/geo/GEO2R/）在線工具篩選差異表達(dá)基因（DEGs），篩選條件為padj＜0.05，｜log2FC｜＞1.0（FC即變化倍數(shù)fold change）。兩組數(shù)據(jù)集（GSE15222 和GSE36980）共同的DEGs行后續(xù)分析。

1.2.2 功能富集分析和蛋白質(zhì)相互作用

獲得差異表達(dá)基因后，通過FunRich軟件進(jìn)行GO（gene ontology）分析，其用于描述及注釋基因功能。GO 將基因功能分為細(xì)胞組分（cellular component）、生物學(xué)過程（biological process）、分子功能（molocular function） 和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域（protein domain）4部分，用于發(fā)現(xiàn)在AD發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵生物學(xué)過程。并對以上DEGs 通過STRING 數(shù)據(jù)庫（http://STRING-db.org/）構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction network），利用CytoHuba 評估蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)及各節(jié)點的拓?fù)涮匦圆⒑Y選出關(guān)鍵節(jié)點蛋白分子。

1.2.3 關(guān)鍵基因的大數(shù)據(jù)庫總結(jié)整理分析

通過The Human Protein Atlas 數(shù)據(jù)庫（http://www.proteinatlas.org/）總結(jié)整理E3 泛素連接酶蛋白在腦組織中的細(xì)胞定位；對特異性表達(dá)于神經(jīng)元中的E3 連接酶，通過Pubmed 數(shù)據(jù)庫（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）查找目前在AD 領(lǐng)域中的研究報道，通過Alzdata 數(shù)據(jù)庫（http://www.alzdata.org/）查詢E3連接酶在AD患者與對照在內(nèi)嗅皮層、海馬、顳葉皮層和額皮質(zhì)中的表達(dá)量及其統(tǒng)計學(xué)差異。

1.2.4 總RNA提取和實時定量PCR（qPCR）檢測

按照TRIzol 試劑說明書的操作流程提取3 對APP/PS1 和5×FAD 及對照小鼠整個大腦組織的總RNA，溶解于DEPC 水中。經(jīng)過Nanodrop 2000 測量樣品總RNA 濃度后，將同批次樣品調(diào)節(jié)至相同濃度。按照PrimeScript RT Master Mix （Perfect Real Time）cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書流程將總RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，其反應(yīng)體系包含2 μl 5×PrimeScript RT Master Mix，500 ng Total RNA，在37℃反應(yīng)15 min，85℃5 s 失活反轉(zhuǎn)錄酶后-20℃保存?zhèn)溆?。使用TB Green Premix Ex Taq TM II（TliRNaseH Plus） 試 劑 盒 進(jìn) 行E3 泛 素 連 接 酶（MKRN2、NEDD4L、LNX1、RNF41、TRIM36、RNF8、DTX4）和內(nèi)參基因β-actin 的qPCR 檢測，每個樣本設(shè)置3 個復(fù)孔。其反應(yīng)體系包含20 ng cDNA，正反向引物各400 nmol/L，0.4 μl ROX（50×） 和10 μl SYBR Premix Ex Taq （2×），共20 μl。反應(yīng)程序為95℃30 s，隨后95℃5 s，60℃30 s，進(jìn)行40次循環(huán)，使用Step One Plus實時PCR系統(tǒng)完成實驗后，采用2△△Ct法計算各個基因的相對表達(dá)量，檢測用引物見表1。

Table 1 The qPCR primers of mouse E3 ligases

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，通過GraphPad Prism 8.0 軟件統(tǒng)計作圖，兩組間數(shù)據(jù)比較采用t-test 檢驗，P＜0.05 認(rèn)為差異存在統(tǒng)計學(xué)意義，標(biāo)識如下：ns，無顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 AD患者中差異表達(dá)基因篩選

DEGs 是在AD 的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)生統(tǒng)計學(xué)改變的基因，它們與AD 的進(jìn)程密切相關(guān)。因此，首先將比較AD 組與對照組數(shù)據(jù)，分析DEGs，結(jié)果如下：在GSE15222 數(shù)據(jù)集中篩選到8 093 個DEGs，在GSE36980 數(shù)據(jù)集中篩選到3 671 個DEGs，其中共同DEGs 1 935個，分別占兩個數(shù)據(jù)集總DEGs 的23.91%和52.71%（圖1）。共同的差異基因代表在兩個獨立數(shù)據(jù)分析中這些基因均在AD的進(jìn)程中有顯著改變，將這些基因進(jìn)行后續(xù)分析可以減少系統(tǒng)偏移誤差，提供更準(zhǔn)確的分析結(jié)果。

Fig.1 The DEGs in GSE15222 and GSE36980 databases

2.2 差異表達(dá)基因GO功能富集

對1 935 個共同DEGs 進(jìn)行GO 分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：上述共同差異基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物主要位于細(xì)胞漿、線粒體、細(xì)胞液、溶酶體和外泌體等細(xì)胞組成部分，細(xì)胞核與細(xì)胞膜定位蛋白并不多；主要的生物學(xué)通路涉及能量代謝、神經(jīng)遞質(zhì)通路和突觸生成，其中位于前3 名的分別是糖代謝三羧酸循環(huán)、谷氨酰能神經(jīng)遞質(zhì)和5-羥色胺能神經(jīng)遞質(zhì)的釋放；主要的分子功能涉及泛素化、能量代謝和離子通道等，其中前3 名分別為泛素-蛋白酶體系統(tǒng)、GTP酶活性和ATP 活性；在進(jìn)一步結(jié)構(gòu)域分析中發(fā)現(xiàn)UBCc、WD40、C2、UBQ 等被富集到，其中排名第1 的UBCc 具有統(tǒng)計學(xué)差異，該結(jié)構(gòu)域具有高度保守性，在泛素化的生物學(xué)過程中具有關(guān)鍵作用。這些結(jié)果指向泛素化過程在AD病程的調(diào)控中具有重要功能，可能參與調(diào)控能量代謝和神經(jīng)遞質(zhì)合成（圖2）。

2.3 差異表達(dá)基因編碼蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)分析

為了進(jìn)一步篩選AD發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵調(diào)控分子，進(jìn)行DEGs 基因的PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分基因之間有緊密關(guān)聯(lián)，少數(shù)蛋白質(zhì)只有2～3 個相互作用蛋白，位于核心網(wǎng)絡(luò)之外（圖3）。排名前50的蛋白質(zhì)分子如表2所示，它們涉及信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白泛素化、能量代謝和離子通道等生物學(xué)過程。

Fig.2 GO analysis（cellular component，biological process，molecular function and protein domain）of DEGs

Fig.3 PPI analysis of DEGs

2.4 E3泛素連接酶在腦組織中細(xì)胞定位

前期分析結(jié)果指向泛素化過程在AD的發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用，E3 泛素連接酶在底物識別和泛素化過程調(diào)控中具有關(guān)鍵作用。因此，通過The Human Protein Atlas 和Pubmed 公用數(shù)據(jù)庫，整理DEGs 中的22 個E3 連接酶在腦組織中的細(xì)胞學(xué)定位（內(nèi)皮細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元）以及是否有與AD相關(guān)的文獻(xiàn)報道（表3）。

Table 2 The top 50 proteins in PPI analysis

Table 3 The cellular location of E3 ligases in human brain

2.5 神經(jīng)元特異表達(dá)E3泛素連接酶蛋白分子在Alzdata數(shù)據(jù)庫中表達(dá)分析

AD患者神經(jīng)元的水解功能異常，導(dǎo)致淀粉樣蛋白和神經(jīng)纖維纏結(jié)異常沉積，進(jìn)而引起神經(jīng)元功能障礙。因此，選取神經(jīng)元特異高表達(dá)的E3 泛素連接酶蛋白分子（包括MKRN2、NEDD4L、LNX1、RNF41、TRIM36、RNF8 和DTX4）通過Alzdata數(shù)據(jù)庫查找這些蛋白質(zhì)分子在AD患者和對照人群不同腦區(qū)（包括內(nèi)嗅皮層、海馬、顳葉皮層和額葉皮層）中的表達(dá)量和統(tǒng)計學(xué)差異。經(jīng)過整理具體結(jié)果如下：絕大部分蛋白質(zhì)分子在AD患者中表達(dá)量下調(diào)，大部分具有統(tǒng)計學(xué)差異。例外包括：RNF8 和DTX4 在海馬，NEDD4L 在額皮質(zhì)中略微上調(diào)，但均無統(tǒng)計學(xué)差異；DTX4在內(nèi)嗅皮層和額葉皮層，以及LNX1 在額皮質(zhì)中缺失數(shù)據(jù)（圖4）。它們的下調(diào)與促進(jìn)泛素化降解功能的發(fā)揮，進(jìn)而導(dǎo)致AD患者腦組織中異常蛋白堆積的現(xiàn)象一致，提示可能作為AD進(jìn)展的驅(qū)動基因發(fā)揮作用。

2.6 神經(jīng)元特異表達(dá)E3泛素連接酶蛋白分子在AD小鼠腦組織中表達(dá)驗證

為了進(jìn)一步驗證從AD 患者組織中篩選的E3泛素連接酶蛋白分子表達(dá)特征，選擇具有明顯AD病理學(xué)和行為學(xué)特征的8月齡APP/PS1和6月齡5×FAD的AD小鼠模型［14-15］，將它們整個大腦組織勻漿后進(jìn)行qPCR表達(dá)驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這7個E3泛素連接酶在APP/PS1 和5×FAD 小鼠腦組織中表達(dá)量均有不同程度的下調(diào)趨勢，其中NEDD4L、LNX1和TRIM36 在兩種AD 小鼠模型中表達(dá)量有統(tǒng)計學(xué)意義的降低。在APP/PS1 和對照小鼠腦組織中DTX4沒有統(tǒng)計學(xué)差異，其他蛋白質(zhì)均有統(tǒng)計學(xué)差異的下調(diào)；在5×FAD 小鼠腦組織中，MKRN2、RNF41和RNF8尚無統(tǒng)計學(xué)差異，其他蛋白均有統(tǒng)計學(xué)差異的下調(diào)（圖5）。該結(jié)果與AlzData數(shù)據(jù)庫中AD 患者的結(jié)果趨勢是一致的，這提示在AD 的不同物種間這些基因可能發(fā)揮相似的重要作用，也提示AD小鼠可作為重要的模型工具研究這些基因功能。

Fig.4 Neuron-specific expression of E3 ligases in entorhinal cortex，hippocampus，temporal cortex and frontal cortex between control and AD patients

Fig.5 Neuron-specific expression of E3 ligase in cerebrum tissues between control and AD mouse model

3 討 論

隨著醫(yī)療衛(wèi)生技術(shù)的發(fā)展和人們的壽命延長，AD 成為21 世紀(jì)危害最大的神經(jīng)退行性疾病之一［16］。AD是一種原因不明的變性疾病，目前分子機制尚不明朗，需要進(jìn)一步深入探索。高通量的數(shù)據(jù)（測序、基因芯片等）能同時對大量基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測和分析。為了減少誤差，選擇了樣本量大于50的兩組數(shù)據(jù)，兩者均包括正常和AD組織的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。從兩組數(shù)據(jù)中選擇共有基因進(jìn)行功能富集分析，增加了分析數(shù)據(jù)的可靠性。

AD患者腦組織含有大量的異常表達(dá)基因，泛素-蛋白酶體過程和泛素結(jié)合酶結(jié)構(gòu)域UBCc 分別在參與AD發(fā)生進(jìn)程的生物學(xué)功能和結(jié)構(gòu)域中位居首列，這與差異蛋白主要定位于胞漿和溶酶體的分析結(jié)論一致。而糖脂代謝和多巴胺能神經(jīng)遞質(zhì)代謝是最顯著改變的生物學(xué)通路，由此推測，泛素蛋白酶體功能的異常可能通過能量代謝和神經(jīng)遞質(zhì)代謝紊亂促進(jìn)AD 的發(fā)生和發(fā)展。在PPI 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點得分越高代表與其他蛋白質(zhì)相互關(guān)聯(lián)越強，得分前50 名蛋白質(zhì)中包含大量與泛素化相關(guān)以及能量代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)分子，與GO分析結(jié)果一致。

E3 泛素連接酶在蛋白質(zhì)的識別標(biāo)記中起著核心作用，在進(jìn)一步分析中對富集到的22個E3泛素連接酶行組織細(xì)胞學(xué)定位和AD大數(shù)據(jù)細(xì)致分析以及文獻(xiàn)整理。由于AD的典型病理特征是淀粉樣蛋白的沉積和神經(jīng)元纖維纏結(jié)，前者是在神經(jīng)元中形成，后轉(zhuǎn)運至細(xì)胞外沉積形成老年斑；后者主要在神經(jīng)元胞內(nèi)聚集沉降［17］。因此，神經(jīng)元內(nèi)的泛素化過程異常是我們關(guān)注的重點之一［18］。針對其中特異性高表達(dá)于神經(jīng)元的7 個E3 泛素連接酶（MKRN2、NEDD4L、LNX1、RNF41、TRIM36、RNF8 和DTX4）查閱Alzdata 數(shù)據(jù)庫，對其在4 個不同腦區(qū)中的表達(dá)量和統(tǒng)計學(xué)差異進(jìn)行整理。我們發(fā)現(xiàn)它們在AD組中表達(dá)量均低于對照組。它們的異常低表達(dá)會促進(jìn)異常蛋白的累積，與AD發(fā)生發(fā)展呈正相關(guān)，推測它們可能是AD發(fā)生發(fā)展的驅(qū)動基因。這些E3 泛素連接酶在不同腦區(qū)的統(tǒng)計學(xué)差異有些許不同，可能與大腦不同區(qū)域的特化功能相關(guān)，例如大腦不同分區(qū)負(fù)責(zé)運動、視覺、聽覺等神經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而記憶功能主要在海馬區(qū)。

通過qPCR 方法驗證AD 小鼠中7 個E3 泛素連接酶的表達(dá)趨勢與AD患者基本是一致的，表明這些基因在不同物種間的功能比較保守，也提示AD小鼠可作為重要的模型工具研究這些基因功能。同時，AD 動物模型和AD 患者樣本結(jié)果也存在小量差異，例如：RNF8 和DTX4 在AD 患者組在海馬組織、NEDD4L 在額葉皮層中是相對高表達(dá)的，盡管尚未有統(tǒng)計學(xué)差異。這其中可能原因為物種差異，本文檢測的是AD小鼠組織，而且動物模型的模擬程度是有限的。目前除NEDD4L1 在AD 中有少量報道，其他6 個E3 連接酶在AD 中尚無報道。這些相關(guān)信息給AD機制研究提供了線索，可以考慮構(gòu)建它們的基因編輯動物模型和細(xì)胞模型，深入探索這些基因與AD疾病的關(guān)系。此外，值得注意的是，TRIM36 蛋白在AD 患者、APP/PS1 小鼠模型和5×FAD 小鼠模型中表達(dá)量都是顯著降低的，在以后的研究中可作為重點研究對象進(jìn)行探索。

4 結(jié) 論

本研究通過生物信息學(xué)方法分析發(fā)現(xiàn)泛素蛋白酶體途徑異常是AD 患者最突出的生物學(xué)過程改變。神經(jīng)元特異性表達(dá)的7 個E3 泛素連接酶（MKRN2、NEDD4L、LNX1、RNF41、TRIM36、RNF8 和DTX4）在AD 患者腦組織中顯著低表達(dá)。這7 個E3 泛素連接酶在AD 中的功能幾乎無報道（NEDD4L有少量報告），在進(jìn)一步探討AD病因機制時可以考慮構(gòu)建敲除/轉(zhuǎn)基因動物和細(xì)胞模型，深入研究其內(nèi)在的分子原因，為AD的診療提供新的靶標(biāo)。