韋洪才，韋啟行，王顯晉， 駱霞

(望謨縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州 望謨 552300)

自非洲豬瘟疫情傳入我國(guó)后，給我國(guó)生豬產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重打擊，縣級(jí)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室作為基層實(shí)驗(yàn)室，在非洲豬瘟病毒檢測(cè)中發(fā)揮著非常重要的作用。本文從樣品采集、樣品滅活及混勻處理、設(shè)備與試劑選擇、核酸提取及PCR擴(kuò)增、結(jié)果判讀、非洲豬瘟檢測(cè)關(guān)鍵技術(shù)等環(huán)節(jié)進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)探討，供基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室同行參考，共同提高基層非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測(cè)能力。

1 樣品采集

在對(duì)活豬進(jìn)行非洲豬瘟病毒檢測(cè)中，最常用的樣品之一是豬抗凝血，本次試驗(yàn)檢測(cè)豬抗凝血28份。豬抗凝血采集需要使用2～5mL規(guī)格的含有EDTA-K2抗凝劑的抗凝管(紫色蓋帽)保存，采用前腔靜脈采血法。

2 樣品滅活及混勻處理

2.1 樣品滅活處理

所有需要進(jìn)行核酸檢測(cè)的樣品，檢測(cè)前均需要放在60℃條件下滅活處理30min。

2.2 全血樣品混勻處理

加樣前將抗凝血樣品顛倒混勻2～3次，使血細(xì)胞與血漿混勻。

3 設(shè)備與試劑選擇

本實(shí)驗(yàn)室的熒光定量PCR儀(西安天隆公司GENTIER48E型號(hào))、核酸提取儀(西安天隆公司NP968-C型號(hào))；使用的試劑主要有兩類：核酸提取試劑、熒光PCR檢測(cè)試劑；使用西安天隆科技有限公司生產(chǎn)的病毒DNA/RNA提取試劑盒(4.0版)、青島立見(jiàn)診斷技術(shù)發(fā)展中心生產(chǎn)的非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測(cè)試劑盒(2.0版)。

4 核酸提取及PCR擴(kuò)增

4.1 核酸提取

采用核酸提取儀提取核酸，按核酸提取試劑盒說(shuō)明書(shū)要求在設(shè)備上設(shè)置好提取程序。在反應(yīng)板第1列和第7列分別加入20μL蛋白酶K溶液，再加入200μL樣本。自動(dòng)化程序結(jié)束后，對(duì)應(yīng)的第6列和第12列即為提取的核酸樣品。

4.2 PCR擴(kuò)增體系

根據(jù)熒光PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)要求，根據(jù)檢測(cè)樣品數(shù)量在每個(gè)PCR反應(yīng)管加入20μL PCR反應(yīng)液；先取5μL陰性對(duì)照，再取5μL待檢DNA，最后取5μL陽(yáng)性對(duì)照分別加到不同的PCR反應(yīng)管中，每次加樣均需要更換移液器槍頭。加樣結(jié)束后蓋緊反應(yīng)管，每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)液體的體積為25μL。

4.3 PCR反應(yīng)條件

加樣后將反應(yīng)管瞬時(shí)離心，然后置于熒光PCR儀內(nèi)，37℃孵育2min；95℃預(yù)變性20s; 95℃變性10s、60℃延伸30s，共40個(gè)循環(huán)；設(shè)置60℃時(shí)收集FAM和VIC/HEX熒光信號(hào)。

5 結(jié)果判讀

5.1 單次試驗(yàn)的有效性

每次檢測(cè)試驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照FAM和VIC/HEX通道均出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線且Ct值<35，陰性對(duì)照FAM和VIC/HEX通道均無(wú)特異性擴(kuò)增曲線或無(wú)Ct值，則試驗(yàn)成立，否則試驗(yàn)不成立。

5.2 單管反應(yīng)的有效性

每個(gè)樣品反應(yīng)管VIC/HEX通道Ct值≤37則該反應(yīng)污染，該反應(yīng)管檢測(cè)結(jié)果不成立；當(dāng)37

5.3 結(jié)果判定

結(jié)合FAM通道和VIC/HEX通道進(jìn)行判定。見(jiàn)表1。

本次試驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照FAM通道的Ct值為31.2，HEX通道的Ct值為30.7；陰性對(duì)照FAM通道和HEX通道均無(wú)Ct值，因此判定本次試驗(yàn)有效。每個(gè)待檢樣本的HEX通道均無(wú)Ct值，判定待檢樣本反應(yīng)管檢測(cè)成立，無(wú)污染情況，且每個(gè)待檢樣本FAM通道均無(wú)Ct值，因此判定本次試驗(yàn)28份待檢樣本全部為陰性。

表1 熒光PCR的結(jié)果判定

5.4 試驗(yàn)結(jié)果

共檢測(cè)28份樣品(單份檢測(cè))，樣本設(shè)置及擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖1。

圖1 樣本設(shè)置及擴(kuò)增曲線

6 非洲豬瘟檢測(cè)關(guān)鍵技術(shù)及經(jīng)驗(yàn)探討

6.1 樣品采集

6.1.1活豬樣品采集

活豬樣品主要采集豬口腔液、豬抗凝血等。豬口腔液采集可用大號(hào)滅菌棉簽放到豬口腔涂抹口腔液后，剪取棉球部分將其放入滅菌自封袋(或帶螺旋蓋帽的離心管)內(nèi)，加入適量滅菌生理鹽水后封袋(管)，并做好標(biāo)記。豬抗凝血采集使用2～5mL規(guī)格的含有EDTA-K2抗凝劑的抗凝管，采血后及時(shí)顛倒混勻3～4次，使血液與抗凝劑充分混勻，否則易出現(xiàn)血液凝固現(xiàn)象。不可使用含肝素抗凝劑的抗凝管保存樣品，因肝素會(huì)影響PCR的效率[1]。因全血樣品中含有淋巴細(xì)胞，使用全血檢測(cè)相比使用血清或血漿檢測(cè)可提高檢出率。

6.1.2死豬樣品采集

可以在解剖后采集脾臟、淋巴結(jié)等病變明顯的器官或組織，裝入2mL的帶有螺旋蓋帽的滅菌離心管內(nèi)。組織樣品需要研磨處理(最好在組織研磨儀上處理，人工研磨容易污染)。

6.1.3環(huán)境樣品采集

水樣可用2～5mL規(guī)格的帶螺旋蓋帽的離心管盛裝，樣品量不超過(guò)管容量的四分之三。糞便、塵土等污染物采集可以用大號(hào)滅菌棉簽浸濕滅菌生理鹽水后再涂抹環(huán)境中的糞便、塵土等污染物，剪取棉球部分放入滅菌自封袋(或帶螺旋蓋帽的離心管)內(nèi)，加入適量滅菌生理鹽水后封袋(管)。

6.2 樣品滅活處理

所有需要進(jìn)行核酸檢測(cè)的樣品，檢測(cè)前均需要在60℃條件滅活處理30min。樣品滅活處理后再檢測(cè)，可消除活病毒擴(kuò)散出實(shí)驗(yàn)室的風(fēng)險(xiǎn)。

6.3 檢測(cè)試劑選擇

核酸提取試劑選擇與核酸提取儀相匹配的，最好是同一廠家的核酸提取試劑或支持當(dāng)前樣品核酸提取的試劑(如：樣品為全血時(shí)，核酸提取試劑盒說(shuō)明書(shū)上要支持全血樣品檢測(cè))；熒光PCR試劑選擇有農(nóng)業(yè)農(nóng)村部批準(zhǔn)文號(hào)的試劑。本實(shí)驗(yàn)室使用青島立見(jiàn)診斷技術(shù)發(fā)展中心生產(chǎn)的非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測(cè)試劑盒(2.0版)，相比其他單通道檢測(cè)試劑盒其優(yōu)點(diǎn)如下：該試劑盒可FAM和VIC/HEX雙通道檢測(cè)，可以判斷有無(wú)污染的情況，最大限度減少因污染造成假陽(yáng)性結(jié)果的發(fā)生。

6.4 人員操作技術(shù)要求

6.4.1防止氣溶膠污染

要認(rèn)真按照試劑盒說(shuō)明書(shū)或作業(yè)指導(dǎo)書(shū)步驟進(jìn)行，防止試劑和樣品受到氣溶膠污染。操作時(shí)要戴一次性手套，若不小心濺上反應(yīng)液，應(yīng)立即更換手套。開(kāi)離心管時(shí)要用雙手，動(dòng)作要輕緩，防止液體濺出[2]。

6.4.2移液器槍頭的選擇和更換

核酸檢測(cè)全過(guò)程建議使用帶過(guò)濾棉的槍頭，每次試驗(yàn)需要重新加樣或者對(duì)不同試劑做吸取時(shí)所用槍頭要每次更換，以免對(duì)樣品等造成污染[3]。

6.5 定期校準(zhǔn)或檢查主要設(shè)備

在試驗(yàn)中用到的主要儀器有熒光PCR 儀、冷凍離心機(jī)、生物安全柜、核酸提取儀、微量移液器等，要定期對(duì)這些儀器進(jìn)行校準(zhǔn)或功能性檢查，確保儀器處于正常工作狀態(tài)。要保持熒光PCR 儀的清潔衛(wèi)生，避免儀器內(nèi)部被熒光物質(zhì)污染。試劑準(zhǔn)備室和核酸提取室都要有一套完整移液器(量程覆蓋0.2～1000μL)，不能互相調(diào)換使用[4]。

6.6 實(shí)驗(yàn)后處理

6.6.1嚴(yán)格落實(shí)消毒措施

每次試驗(yàn)結(jié)束后，試驗(yàn)臺(tái)面可用含氯消毒劑擦拭消毒；實(shí)驗(yàn)室地面用含氯消毒劑拖地或噴霧消毒；生物安全柜、超凈工作臺(tái)等金屬臺(tái)面可用酒精棉球擦拭消毒(金屬部件使用含氯消毒劑容易銹蝕，應(yīng)慎用)；各區(qū)在實(shí)驗(yàn)前、后應(yīng)分別開(kāi)啟紫外燈消毒30min。嚴(yán)格消毒是消除實(shí)驗(yàn)室病毒污染、核酸污染的重要措施。

6.6.2醫(yī)療廢棄物的規(guī)范處置

實(shí)驗(yàn)室的所有固體醫(yī)療廢物必須在試驗(yàn)結(jié)束后放入高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌處理，然后由第三方具有醫(yī)療廢物處置資質(zhì)的公司回收處置，未經(jīng)滅活處置的醫(yī)療廢物不可流出實(shí)驗(yàn)室；液體廢物經(jīng)集中消毒處理后再排入污水管道。