翁小建 談毅 高秀飛

作為藥食兩用常見藥材，大棗藥用歷史悠久，《傷寒論》等多部醫(yī)書均有多處闡述，有補(bǔ)中益氣與養(yǎng)血安神之功效[1]?！吨腥A醫(yī)典》記載治療抑郁方劑中，使用頻次最高的十種復(fù)方約半數(shù)含大棗，如甘麥大棗、歸脾湯、大棗湯與紫蘇子湯等[2]。研究表明，甘麥大棗湯等單用或聯(lián)用可通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)、下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸及促進(jìn)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）分泌等，有效治療產(chǎn)后抑郁、乳腺癌合并抑郁以及中風(fēng)后抑郁等[3]。此外，大棗提取物可促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞中BDNF 表達(dá)水平，拮抗活性氧等自由基對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷作用，這些證據(jù)表明大棗在抗抑郁具有潛在治療作用[4]。然而，大棗抗焦慮、抗抑郁的活性成分與作用機(jī)制并未得到揭示與闡明。因此，本文擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，結(jié)合生物信息預(yù)測(cè)研究，探索大棗中抗焦慮、抗抑郁潛在的活性成分與分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 構(gòu)建大棗抗焦慮、抗抑郁活性成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù) 采用TCMSP（版本2.3）檢索大棗的化學(xué)成分，根據(jù)化合物藥代動(dòng)力學(xué)特性，采用口服利用度（OB）大于30%及成藥相似性（DL）大于0.18 兩項(xiàng)參數(shù)，篩選大棗潛在抗焦慮、抗抑郁活性成分。

1.2 構(gòu)建大棗抗焦慮、抗抑郁活性成分靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)采用TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)（更新至2020 年6 月1 日），根據(jù)上述得到的活性成分，預(yù)測(cè)與抗焦慮、抗抑郁相關(guān)靶標(biāo)。

1.3 REACTOME 富集分析 采用REAC 數(shù)據(jù)庫(kù)（版本75，更新至2020 年12 月25 日），根據(jù)上述靶標(biāo)，預(yù)測(cè)大棗活性成分REAC 通路。

1.4 g:Profiler 富集分析 采用g:Profiler（版本：e102_eg49_p15_7a9b4d6）根據(jù)上述候選靶標(biāo)，進(jìn)行GO、KEGG、REAC 和WP 富集分析[5]。

1.5 蛋白-蛋白相互作用（PPI）和轉(zhuǎn)錄因子-miRNA協(xié)同調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)分析 采用NetworkAnalyst（更新至2021 年1 月20 日）[6]根據(jù)上述候選靶標(biāo)，進(jìn)行PPI 和TF-miRNA 協(xié)同調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)均采用數(shù)據(jù)庫(kù)默認(rèn)的參數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析，以Adjusted P 值（AdjP）或FDR＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抗焦慮與抗抑郁活性候選化合物 利用TSMCP 數(shù)據(jù)庫(kù)一共檢索出133 種化合物（含同分異構(gòu)體），其中OB＞30%獲得52 種，87 種DL＞0.18。合并分析后發(fā)現(xiàn)同時(shí)達(dá)到兩項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)共29 種化合物。其中24 種與抗焦慮和抗抑郁無(wú)關(guān)，5 種化合物與抗焦慮和抗抑郁相關(guān)（見表1 和圖1A）。采用這5 種化合物從TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)得到10 個(gè)抗焦慮和抗抑郁靶標(biāo)（見表2）。比如，β-胡蘿卜素（beta-carotene）可分別激活5-羥色胺受體2A（HTR2A）、H/ACA 核糖核蛋白復(fù)合物亞基（GAR）、鈉依賴性血清素轉(zhuǎn)運(yùn)體（SLC6A4）和γ-氨基丁酸受體亞基α1（GABRA1）發(fā)揮抗焦慮作用，激活GAR、SLC6A4、μ 型阿片受體（OPRM1）、γ-氨基丁酸受體亞基γ2（GABRG2）、γ-氨基丁酸受體亞 基β2（GABRB2）、GABRA1 和單胺氧化酶B（MAOB）發(fā)揮抗抑郁作用（見圖1B）。

圖1 大棗中抗焦慮與抗抑郁候選活性成分與靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)

表1 大棗抗焦慮與抗抑郁候選活性成分

2.2 REAC 富集結(jié)果 采用上述候選靶標(biāo)從REAC數(shù)據(jù)庫(kù)富集到28 條信號(hào)通路（P＜0.05）（見圖2）。分類統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn)：這些信號(hào)通路基本集中在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、DNA 修復(fù)和神經(jīng)系統(tǒng)，三者之和達(dá)到75%（見圖2C）。比如，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)現(xiàn)受體蛋白酪氨酸激酶、多巴胺受體、血清素受體、G 蛋白偶聯(lián)受體和胺配體結(jié)合受體等通路；在DNA 修復(fù)富集到DNA 損傷與修復(fù)通路；在神經(jīng)系統(tǒng)中富集到γ-氨基丁酸受體激活、突觸傳遞、神經(jīng)遞質(zhì)受體與突觸后信號(hào)傳遞與5-羥色胺從突觸間隙中清除等通路（見圖2B）。

圖2 REAC 富集分析網(wǎng)絡(luò)

2.3 g:Profiler 富集結(jié)果 繼續(xù)利用候選靶標(biāo)進(jìn)行g(shù):Profiler 進(jìn)行GO 富集分析，共得到623 條顯著差異條目，其中包含92 條分子功能（MF）、462 條生物學(xué)過(guò)程（BP）和69 條細(xì)胞定位（CC）（見圖3A）。如在分子功能中得到神經(jīng)遞質(zhì)受體活性，γ-氨基丁酸受體活性等條目；生物學(xué)過(guò)程富集到組胺反應(yīng)、突觸信號(hào)、單胺轉(zhuǎn)運(yùn)與離子傳輸?shù)葪l目；在細(xì)胞定位富集分析到突觸和質(zhì)膜等細(xì)胞組分（見圖3B）。

在KEGG、REAC 和WP 富集分析中，共獲得48種顯著差異通路，在KEGG、REAC 和WP 中分別得到12 條、19 條和17 條差異通路（見圖3A）。KEGG富集分析評(píng)分靠前的主要有神經(jīng)活性配體受體相互作用、5-羥色胺能突觸、γ-氨基丁酸能突觸、突觸囊泡周期、縫隙連接和多巴胺能突觸（見圖3C）。REAC主要富集分析γ-氨基丁酸受體激活、受體蛋白酪氨酸激酶通路、化學(xué)突觸傳遞、胺配體結(jié)合受體、神經(jīng)遞質(zhì)受體與突觸后信號(hào)傳遞、生物胺被單胺氧化酶氧化脫氨為醛、突觸間隙清除血清素（見圖3D）。WP富集分析到腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)γ-氨基丁酸神經(jīng)傳遞的調(diào)節(jié)、血清素與焦慮、單胺轉(zhuǎn)運(yùn)、G 蛋白偶聯(lián)受體等通路（見圖3E）。

圖3 g:Profiler 富集結(jié)果

2.4 PPIs 網(wǎng)絡(luò) 隨后通過(guò)NetworkAnalyst 進(jìn)行PPIs分析，共發(fā)現(xiàn)4 個(gè)PPI 亞簇（見圖4A）。發(fā)現(xiàn)μ 型阿片受體、D（2）多巴胺受體、鈉依賴性血清素轉(zhuǎn)運(yùn)體、單胺氧化酶B 和鈉依賴性去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與其它蛋白存在廣泛的相互作用，屬于評(píng)分靠前關(guān)鍵蛋白（見圖4B）。

圖4 PPIs 網(wǎng)絡(luò)與Top10 蛋白

2.5 TF-miRNA 協(xié)同調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò) 隨后繼續(xù)采用NetworkAnalyst 進(jìn)行TF-miRNA 協(xié)同網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄因子TFs、miRNAs 和靶標(biāo)間存在復(fù)雜廣泛的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（見圖5A）。其中hsa-miR-155 和hsa-miR-203 與PPARG、CREB1、E2F1-7 和SP1 等轉(zhuǎn)錄因子共同調(diào)控 GABRB2、SLC6A4、OPRM1、GABRA1、SLC6A2、MAOB、HTR2A、GABRG2、DRD2 和PPARG等基因的表達(dá)（見圖5B）。

圖5 TF-miRNA 協(xié)同調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

3 討論

抑郁是一種以情緒低落、興趣減退、快感缺失為主，并伴有一定思維遲緩與認(rèn)知障礙的身心性疾病。抑郁的發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前主要有HPA、單胺類神經(jīng)遞質(zhì)與神經(jīng)元損傷、BDNF 等假說(shuō)[7]。在焦慮及抑郁發(fā)病過(guò)程中涉及眾多相互關(guān)聯(lián)的神經(jīng)化學(xué)分子，如血清素、γ-氨基丁酸及5-羥色胺等。如5-羥色胺可與谷氨酸、γ-氨基丁酸、G 蛋白偶聯(lián)受體和單胺氧化酶等相互作用，共同參與抑郁癥的發(fā)生與發(fā)展[7]。此外，抑郁患者體內(nèi)BNDF 也顯著低于健康人群[8]。

文獻(xiàn)報(bào)道含大棗的方劑，如越鞠甘麥大棗湯等可通過(guò)調(diào)控PKA -CREB -BDNF、AKT/mTOR 與SIRT1/ERK1/2 等信號(hào)通路，調(diào)控腦內(nèi)5-HT 等含量變化，最終發(fā)揮抗抑郁作用[9-12]。本文發(fā)現(xiàn)，大棗活性成分激活了BDNF 與5-羥色胺等信號(hào)通路，這可能是越鞠甘麥大棗湯發(fā)揮抗抑郁的作用機(jī)制之一。

本文采用TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索大棗潛在抗焦慮、抗抑郁活性成分，隨后采用TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)確定潛在作用靶標(biāo)，并結(jié)合g:Profiler 或REACTOME 軟件進(jìn)行REAC、GO、KEGG 和WP 富集分析，最后通過(guò)NetworkAnalyst 軟件構(gòu)建PPIs 和TF-miRNA 協(xié)同調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。初步在大棗中發(fā)現(xiàn)5 個(gè)潛在抗焦慮、抗抑郁活性成分，如（S）-烏藥堿、β-胡蘿卜素、β-谷甾醇與千金藤啶堿等。這些成分與抗抑郁均有明確的關(guān)系。如（S）-烏藥堿可通過(guò)調(diào)控糖原合成酶激酶-3β、胱硫醚β 合成酶等抑郁癥相關(guān)靶點(diǎn)調(diào)控MAPK、VEGF 與胰島素信號(hào)通路等發(fā)揮治療抑郁癥作用[13]。β-胡蘿卜素?cái)z入量大的人群，焦慮和抑郁患病率較低，并與壓力相關(guān)[14]。β-谷甾醇可以通過(guò)調(diào)控由5-羥色胺、多巴胺和Y-氨基丁酸系統(tǒng)介導(dǎo)的信號(hào)通路發(fā)揮抗抑郁作用[15]。通過(guò)本研究篩選得到的活性成分可以發(fā)揮抗抑郁作用，表明本文研究方法的可靠性。

綜上所述，大棗可以通過(guò)調(diào)節(jié)hsa-miR-155 和hsa-miR-203 等miRNAs 與PPARG、CREB1、E2F1-7和SP1 等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，并調(diào)控GABRB2、SLC6A4、OPRM1、GABRA1、SLC6A2、MAOB、HTR2A、GABRG2、DRD2 和PPARG 等基因的表達(dá)，可能最終激活腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、血清素受體、γ-氨基丁酸、5-羥色胺、G 蛋白偶聯(lián)受體和受體蛋白酪氨酸激酶等信號(hào)通路，影響了神經(jīng)遞質(zhì)釋放與傳遞，最終起到抗焦慮、抗抑郁作用。