李慧 陳李蘭 李蕊 戴園園

癲癇是常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，小兒發(fā)病率尤高。長期反復(fù)癲癇發(fā)作可導(dǎo)致不同程度的認(rèn)知功能障礙，約1/3 癲癇患者合并認(rèn)知功能障礙[1]。研究發(fā)現(xiàn)，癲癇患者的起病年齡與其認(rèn)知功能損害程度呈負(fù)相關(guān)，即起病年齡越小對其認(rèn)知功能的損害就越大，尤其反映在精神運(yùn)動方面。已有研究證實，神經(jīng)限制性沉默因子（NRSF）與人類的認(rèn)知功能有相關(guān)性，且NRSF 與受其調(diào)控的基因在對人類認(rèn)知功能的影響上有聯(lián)合作用[2-3]。miR-124 為神經(jīng)元特異性miRNA，與NRSF 相互作用共同調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育[3]。人參皂苷Rg1（ginsenoside Rg1）是人參的主要活性成分之一，具有營養(yǎng)神經(jīng)及神經(jīng)保護(hù)作用[4-6]。谷氨酸類似物紅藻氨酸（kainic acid，KA），為制作癲癇模型常用藥[7]。本研究應(yīng)用KA 制作慢性癲癇模型幼鼠，通過行為學(xué)、海馬內(nèi)NRSF 及miR-124 的表達(dá)及海馬結(jié)構(gòu)的改變，研究人參皂苷Rg1 對慢性癲癇模型幼鼠的影響及機(jī)制。

1 實驗材料

1.1 動物 50 只健康14d 齡清潔級SD 大鼠，雌雄不限，由徐州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，體質(zhì)量（20.0±3.0）g。在室溫（22±2）℃，濕度50%，12h 光/暗循環(huán)（早上8：00 亮）下，自由獲得食物和水。所有動物實驗均經(jīng)徐州醫(yī)科大學(xué)動物倫理和使用委員會審核批準(zhǔn)（編號：2015-46，2015-47），動物合格證號：20200910，動物許可證號：SYXK（蘇）2020-0048。

1.2 主要試劑 KA（K0250，美國Sigma 公司）；兔抗鼠NRSF 抗體（PAB9358，北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；堿磷酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（ZF0308，北京中杉金橋）；Morris 水迷宮（ACT-200A，Coulbourn 公司）；人參皂苷Rg1（GR-133-140620，上海源葉生物科技有限公司）；SYBR Green 染料試劑盒（qPCR001，天根生化科技有限公司），NRSF 引物、miR-124 引物及β-actin 引物（上海生工生物工程有限公司）。

2 實驗方法

2.1 分組 50 只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組（NS）、模型組（KA）、人參皂苷Rg1 低劑量組（人參皂苷Rg1 10mg/kg 組）、中劑量組（人參皂苷Rg1 30mg/kg）和高劑量組（人參皂苷Rg1 60mg/kg），每組10 只。

2.2 造模及給藥 模型組和人參皂苷Rg1 組大鼠稱體質(zhì)量后，給予KA 10mg/kg 腹腔注射。注射KA后1～3mim 開始出現(xiàn)癲癇發(fā)作，按照Lado 幼鼠癲癇發(fā)作分級標(biāo)準(zhǔn)[8]：0 級為無發(fā)作；1 級為機(jī)械性咀嚼；2級為連續(xù)性點(diǎn)頭；3 級為單側(cè)前肢陣攣；3.5 級為前肢交替陣攣；4 級為雙側(cè)前肢陣攣、后退；5 級為雙側(cè)前肢陣攣、后退、摔倒；6 級為狂奔嘶叫；7 級為強(qiáng)直發(fā)作（癲癇發(fā)作達(dá)5 級以上并出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)（status epilepticus，SE）且21d后出現(xiàn)自發(fā)性反復(fù)驚厥（spontaneous recurrent seizure，SRS）的癲癇模型大鼠視為造模成功，對照組大鼠腹腔注射相同體積的生理鹽水。治療組于造模成功后行Morris 水迷宮實驗檢測大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力有無損害，后分別給予人參皂苷Rg1 10、30、60mg/kg，每天1 次，灌胃治療30d。再行Morris 水迷宮實驗檢測大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力有無改善，最后將所有大鼠斷頭取腦并分離雙側(cè)海馬，采用RT-qPCR 法檢測NRSF mRNA 及miR-124 的表達(dá)。用Western blot 法檢測蛋白的表達(dá)，尼氏染色（Nissl 染色）檢測海馬結(jié)構(gòu)的病理改變。

2.3 Morris 水迷宮測定SD 幼鼠學(xué)習(xí)記憶功能（1）定位航行實驗（place navigation task）：歷時6d，每天4 次，將大鼠分別從4 個象限放入水中，記錄90s內(nèi)尋找平臺所需要的時間,找到平臺后休息10s，如果90s 內(nèi)找不到平臺，則逃避潛伏期計為90s，并幫助其找到平臺并在上面休息10s。（2）空間探索實驗（spatial probe test）：用于測量大鼠學(xué)會尋找平臺后，對平臺空間位置記憶的能力。即在訓(xùn)練第7d 撤除平臺，將大鼠從距離平臺最遠(yuǎn)的象限作為入水點(diǎn)面向池壁放入水中，記錄90s 內(nèi)大鼠的游泳軌跡和目的象限游泳的時間。實驗期間迷宮內(nèi)外參照物保持不變，迷宮上方安裝攝像機(jī)，計算機(jī)自動記錄游泳軌跡和時間。

2.4 Western blot 法檢測海馬NRSF 蛋白表達(dá) 提取海馬組織總蛋白，BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白定量，SDS-PAGE 電泳，半干法轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗孵育，洗膜，加入堿磷酶標(biāo)記山羊抗兔IgG 標(biāo)記的二抗孵育，BCIP/NBT 堿性磷酸酯酶顯色試劑盒顯色反應(yīng)，拍照，保存圖像。用Image-J 圖像分析軟件測條帶的灰度值，并做統(tǒng)計學(xué)分析。

2.5 實時熒光定量PCR 檢測海馬NRSF mRNA 及miR-124 表達(dá) 參照Trizol 試劑使用說明的實驗步驟提純大鼠海馬RNA，紫外分光光度計和電泳檢測RNA 濃度、純度和完整性。通過隨機(jī)引物體外反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，RT-qPCR 引物序列如下：NRSF 上游引物5'-AGGTTGGCTTAGTC-3'，下游引物：5'-TGGTCCTTGGGTGTCTCTTC-3'；miR-124 上游引物：5'-TTAAGGCACGCGGTGAATGCCA-3'，下游引物：5'-GCTGTCAACGATACGGCTACGCTAACG-3'；5Sr-RNA 上游引物5'-GTCTACGGCCATACCACCCTGAAC，下游引物：5'-GCTGTCAACGATACGCTACGCTAACG-3'；β-actin 上游引物：5'-TCATCACCATTGGCAATGAG-3'；下游引物：5'-CACTGTGTTGGCGTACAGGT-3’。用SYBR'Green 染料法獲得不同樣本中目的基因的相對表達(dá)量。PCR 反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性15min；95℃變性10s，58℃退火20s，72℃延伸30s，共40 個循環(huán)。通過2-ΔΔCt算法，計算目的基因mRNA 相對表達(dá)量。

2.6 Nissl 染色 10μm 石蠟包埋切片常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精浸水，先用0.3%H2O2室溫作用6～8min，接著浸入配制好的檸檬酸/檸檬酸鈉中，95℃水浴15min。PBS 洗后用血清封閉，上一抗置于4℃48～72h。PBS 洗3 遍，以后的操作按VectABC 試劑盒進(jìn)行，即生物素標(biāo)記的二抗4℃過夜，PBS 洗3 遍，辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的生物素卵白素復(fù)合物，37℃1h。然后梯度酒精脫水、二甲苯透明，中性樹脂封片，光鏡下觀察。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件完成。符合正態(tài)分布的實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），方差齊時采用LSD 法，方差不齊采用Dunnett T3 法，P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 各組大鼠定位巡航逃避潛伏期比較 隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，各組大鼠逃避潛伏期都出現(xiàn)逐漸縮短，與對照組比較，模型組大鼠逃避潛伏期顯著延長（P＜0.05）；與模型組比較，不同劑量的人參皂苷Rg1 組大鼠逃避潛伏期均有縮短，高劑量組在第3 天以后縮短顯著（P＜0.05），其余各組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 各組大鼠定位巡航逃避潛伏期比較（s，）

表1 各組大鼠定位巡航逃避潛伏期比較（s，）

注：對照組為健康大鼠，給予生理鹽水；模型組大鼠給予10mg/kg 紅藻氨酸建立癲癇模型；人參皂苷Rg1 低劑量組大鼠給予人參皂苷Rg1 10mg/kg 組；人參皂苷Rg1 中劑量組大鼠給予人參皂苷Rg1 30mg/kg；人參皂苷Rg1 高劑量組大鼠給予人參皂苷Rg1 60mg/kg；與對照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01

3.2 各組大鼠空間探索實驗結(jié)果和大鼠海馬組織NRSF 蛋白表達(dá)量比較 探索實驗結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組大鼠在目的象限（原平臺象限）游泳時間百分比明顯減少（P＜0.01）；與模型組比較，人參皂苷Rg1 高劑量組游泳時間百分比明顯增加（P＜0.01）。與對照組比較，模型組大鼠海馬組織NRSF 蛋白表達(dá)明顯增多（P＜0.05）；不同劑量人參皂苷Rg1干預(yù)組較模型組均有減少，以高劑量組最顯著（P＜0.05）。見表2，圖1。

表2 各組大鼠目的象限游泳時間百分比和海馬NRSF 與β-actin 灰度比值比較（）

表2 各組大鼠目的象限游泳時間百分比和海馬NRSF 與β-actin 灰度比值比較（）

注：對照組為健康大鼠，給予生理鹽水；模型大鼠給予10mg/kg 紅藻氨酸（KA）建立癲癇模型；人參皂苷Rg1 低劑量組大鼠給予人參皂苷Rg1 10mg/kg 組；人參皂苷Rg1 中劑量組大鼠給予人參皂苷Rg1 30mg/kg；人參皂苷Rg1 高劑量組大鼠給予人參皂苷Rg1 60mg/kg；與對照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01

圖1 各組大鼠海馬NRSF 蛋白表達(dá)比較

3.3 各組大鼠海馬組織miR-124、NRSFmRNA 表達(dá)量比較 與對照組比較，模型組大鼠海馬組織miR-124 表達(dá)明顯增多（P＜0.05）；人參皂苷Rg1 高劑量組較模型組明顯增多（P＜0.05）。與對照組比較，模型組大鼠海馬組織NRSF 表達(dá)明顯增多（P＜0.05）；人參皂苷Rg1 高劑量組較模型組明顯減少（P＜0.05）。見表3。

表3 大鼠海馬組織miR-124 和NRSF mRNA 表達(dá)量比較（）

表3 大鼠海馬組織miR-124 和NRSF mRNA 表達(dá)量比較（）

注：對照組為健康大鼠，給予生理鹽水；模型大鼠給予10mg/kg 紅藻氨酸（KA）建立癲癇模型；人參皂苷Rg1 低劑量組大鼠給予人參皂苷Rg1 10mg/kg 組；人參皂苷Rg1 中劑量組大鼠給予人參皂苷Rg1 30mg/kg；人參皂苷Rg1 高劑量組大鼠給予人參皂苷Rg1 60mg/kg；與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

3.4 大鼠海馬CA3 區(qū)組織Nissl 染色結(jié)果 Nissl 染色結(jié)果顯示，對照組大鼠海馬CA3 區(qū)錐體細(xì)胞排列整齊、緊密，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)元內(nèi)布滿深藍(lán)色顆粒狀的尼氏小體；模型組大鼠海馬CA3 區(qū)錐體細(xì)胞排列疏松，部分神經(jīng)元胞體皺縮、碎裂，核固縮，胞質(zhì)內(nèi)尼氏小體大量脫失；不同劑量人參皂苷Rg1 組大鼠海馬CA3 區(qū)神經(jīng)元皺縮、碎裂、尼氏小體減少、脫失較模型組減輕，以高劑量組減輕明顯，見圖2。

圖2 大鼠海馬組織CA3 區(qū)Nissl 染色結(jié)果（×400）

4 討論

癲癇是兒童常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，且癲癇患兒更容易合并認(rèn)知功能障礙[9]。研究發(fā)現(xiàn)，有多種藥物能夠改善成年人的認(rèn)知記憶能力，包括腦循環(huán)改善藥物、膽堿酯酶抑制劑等，但這些藥物對于兒童癲癇患者來說缺少臨床應(yīng)用的證據(jù)[10-11]。本研究結(jié)果顯示，人參皂苷Rg1 可以改善SD 大鼠幼鼠癲癇所致的認(rèn)知功能障礙，而且可能與減少NRSF 的表達(dá)量及增加miR-124 的表達(dá)量有關(guān)，且高劑量組改善更明顯。

NRSF 參與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，維持神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的平衡，與多種神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常及相關(guān)疾病的發(fā)生密切相關(guān)[12]。癲癇發(fā)作后，海馬內(nèi)NRSF 表達(dá)上調(diào)，可以抑制神經(jīng)細(xì)胞過度增殖、分化[3]。近年研究發(fā)現(xiàn)，NRSF 可通過調(diào)控miR-124 表達(dá)，在神經(jīng)系統(tǒng)的協(xié)調(diào)發(fā)展中起到關(guān)鍵的作用，其相互作用為負(fù)反饋調(diào)控[12-13]。miR-124 已被證明參與腦神經(jīng)發(fā)育與認(rèn)知功能的調(diào)節(jié)，在癲癇發(fā)作時，多種神經(jīng)元特異性miRNA與靶基因間相互調(diào)控，在神經(jīng)和非神經(jīng)系統(tǒng)中起重要作用，被認(rèn)為可作為癲癇臨床生物標(biāo)志物[9，12]。有研究證實，在癲癇發(fā)作后海馬內(nèi)miR-124 表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖與分化[14-15]。

Morris 水迷宮是研究學(xué)習(xí)記憶最常用的實驗方法[16]。本研究通過KA 構(gòu)建發(fā)育期慢性癲癇模型模型，利用Morris 水迷宮觀察人參皂苷Rg1 對慢性癲癇模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能的影響。檢測各組實驗大鼠海馬內(nèi)NRSF 蛋白和miR-124 的表達(dá)情況。我們發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠逃避潛伏期較對照組延長，空間探索縮短，間接說明其伴有認(rèn)知功能障礙；人參皂苷Rg1 高劑量組較模型組的逃避潛伏期明顯縮短，空間探索延長，表明人參皂苷Rg1 可以改善癲癇所致的學(xué)習(xí)記憶損害，且呈劑量依賴性。模型組海馬內(nèi)NRSF、miR-124 較對照組明顯增加，這也證實癲癇發(fā)作后NRSF、miR-124 表達(dá)量是增加的，人參皂苷Rg1 高劑量組海馬內(nèi)NRSF 表達(dá)量較癲癇模型組減少，而miR-124 的表達(dá)量增加，提示人參皂苷Rg1可以通過減少NRSF 的表達(dá)量及增加miR-124 表達(dá)量，改善癲癇所致的認(rèn)知功能障礙。Nissl 染色結(jié)果也顯示，人參皂苷Rg1 可以減輕發(fā)育期癲癇大鼠海馬結(jié)構(gòu)的病理改變。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，人參皂苷Rg1 可以改善發(fā)育期大鼠癲癇所致的認(rèn)知功能障礙，這可能與減少NRSF 的表達(dá)量及增加miR-124 的表達(dá)量有關(guān)，且呈劑量依賴性。