□ 鄭佩華 蘇勝艷

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣東 廣州 510650；2.瑞辰星生物技術(shù)（廣州）有限公司，廣東 廣州 510650）

有機磷農(nóng)藥是目前我國使用最廣泛的殺蟲劑，長期大量的使用對生態(tài)環(huán)境和人類健康產(chǎn)生的負(fù)面影響越來越嚴(yán)重，尤其是在農(nóng)產(chǎn)品中產(chǎn)生的農(nóng)藥殘留引起人們的廣泛關(guān)注［1，2］。有機磷農(nóng)藥降解酶通過破壞分子中的磷酯鍵使農(nóng)藥失去或降低毒性［3］。通常一種有機磷農(nóng)藥降解酶可同時對多種有機磷農(nóng)藥起降解作用。生物降解法在農(nóng)殘降解領(lǐng)域具有極大的潛力［4］。本文選擇工程菌株實現(xiàn)有機磷農(nóng)藥降解酶opdA在大腸桿菌中的高效表達，通過高壓均質(zhì)破碎和高速離心分離胞內(nèi)酶opdA，分析opdA的酶學(xué)性質(zhì)，研究結(jié)果為opdA的后續(xù)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

一、材料和方法

（一）菌種和質(zhì)粒

E.coliBL21（DE3）/pET-28a-opdA為本實驗室構(gòu)建及保存。

（二）培養(yǎng)基和儀器

LB培養(yǎng)基：稱取氯化鈉10g、蛋白胨10g、葡萄糖1g、酵母提取物5g，溶解至1L蒸餾水中；再加入瓊脂15g/L即為固體培養(yǎng)基。

發(fā)酵培養(yǎng)基：磷酸二氫鉀72g/L，一水檸檬酸2.0g/L，檸檬酸鐵銨0.3g/L，七水硫酸鎂5.0g/L，甘油3.6g/L，濃硫酸0.02%，微量金屬溶液0.2%，pH調(diào)節(jié)到4.5～5.0。

UV-1900i分光光度計，日本島津；LYNX6000落地式離心機，ThermoScientific；C1000PCR儀，伯樂生命；SCIENTZ-ⅡD超聲波破碎儀，寧波生物。

（三）培養(yǎng)方法

將實驗室保藏的冷凍菌體取出解凍后，接入裝有LB液體培養(yǎng)基的250mL三角搖瓶，恒溫培養(yǎng)過夜復(fù)活菌體，取復(fù)活菌體稀釋涂布到LB固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至長出單菌落后，挑一環(huán)接入LB斜面上，37℃培養(yǎng)至長出菌落，這就是E.coli斜面，在生物安全柜的無菌環(huán)境中，挑一環(huán)接入LB培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)至菌體OD600為1.0～2.0，這就是種子液。

將準(zhǔn)備好的發(fā)酵培養(yǎng)基加入到發(fā)酵罐中，種子液按2%的量接入，設(shè)定發(fā)酵參數(shù)進行發(fā)酵培養(yǎng)。監(jiān)測相關(guān)參數(shù)。待菌量進入對數(shù)生長期時，以終濃度為1.0mmol/L的量加入誘導(dǎo)劑IPTG，間隔1小時取樣進行超聲破碎，檢測酶活及菌量，在28℃條件下誘導(dǎo)表達至菌量穩(wěn)定，酶活最高時，結(jié)束發(fā)酵。

（四）有機磷農(nóng)藥降解酶opdA的提取

按上述培養(yǎng)方法收集的菌體，加入勻質(zhì)緩沖液（60mL/L）和曲拉通TritonX-100（7mL/L），在4℃條件下進行高壓均質(zhì)破碎，完成破碎后加入終濃度為3mmol/L氯化鋅溶液以穩(wěn)定酶的結(jié)構(gòu)，破碎后的液料進一步進行離心分離，得到胞內(nèi)酶opdA，此為粗酶液。

（五）主要試劑

甲基對硫磷純品（北京中科質(zhì)檢）；蛋白質(zhì)Marker（Fermantas）；TEMED標(biāo)準(zhǔn)蛋白及其他相關(guān)試劑均購自上海麥克林生化科技公司。

（六）蛋白質(zhì)濃度測定

采用Bradford法［5］，配置系列濃度為0、10、20、40、60、80、100（單位：μg/mL）的牛血清蛋白溶液，加入考馬斯亮藍G-250，測定波長595nm位置處的吸光值，得到回歸方程y=0.0073x+0.0983，相關(guān)系數(shù)R2=0.9941，樣品蛋白含量通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算。

（七）SDS-PAGE電泳［6］

制備分離膠和濃縮膠，移取經(jīng)過適當(dāng)稀釋的粗酶液樣品和蛋白Marker加入到不同樣品槽中，將電泳槽放置到電泳儀上進行電泳。待電泳結(jié)束，用R250染色液對電泳凝膠進行染色，然后脫色至背景顏色為透明。估算出有機磷降解酶蛋白的分子量大小。

（八）酶活力的測定方法

1.酶活力測定步驟

準(zhǔn)確吸取960μL測試緩沖液于1.5mL離心管中，加入含有20μL濃度為3mmol/L甲基對硫磷-甲醇底物溶液，加入20μL經(jīng)過適當(dāng)稀釋的粗酶液，用分光光度計測定在400nm位置處0～5min的吸光度。計算水解產(chǎn)物PNP的含量和opdA酶活［7］。酶活單位定義：室溫下每分鐘水解底物產(chǎn)生1μmolPNP所需要的酶量。

2.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用測試緩沖溶配制濃度為0、5、10、20、40、60、80、100（單位：μmol/L）的硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，在400nm位置比色測得對應(yīng)的吸光值。得到回歸方程為y=0.017x+0.0085，相關(guān)系數(shù)R2=0.9998。

二、結(jié)果和討論

（一）酶的分離純化

1.硫酸銨的分級沉淀

在冰水浴中向粗酶液中加入占溶液總量的百分比為30%的硫酸銨固體，在0～4℃環(huán)境中平衡過夜后，轉(zhuǎn)移至離心管，超高速冷凍離心后，取出下層沉淀物，溶于少量0.05mmol/LTris-HCl緩沖液中，進一步透析后用聚乙二醇將酶液濃縮，裝瓶冷藏于4℃冰箱種備用。

2.純化結(jié)果（見表1）

表1 有機磷農(nóng)藥降解酶opdA的分離純化

（二）酶學(xué)性質(zhì)研究

后續(xù)測定所使用的酶液為高壓均質(zhì)破碎、高速離心后的粗酶液，測定中的底物均為3mmol/L甲基對硫磷，每個測定條件設(shè)置3個平行試驗。

1.酶的純度及分子量

將上述粗酶液分別稀釋10倍、100倍、1000倍，取樣進行凝膠電泳，結(jié)果如圖1所示。當(dāng)樣品稀釋10倍，100倍時，目的蛋白條帶明顯，大小約為35KDa，稀釋1000倍的條帶較淡看不清楚，可得知有機磷農(nóng)藥降解酶opdA的分子大小為35KDa。

圖1 重組opdA誘導(dǎo)表達的SDS-PAGE分析

2.酶的最適溫度及其穩(wěn)定性

在pH8.0，不同溫度條件下測定酶活，opdA的最適反應(yīng)溫度見圖2（a），隨著溫度的上升，opdA酶活先上升后下降。35℃為opdA酶的最適反應(yīng)溫度。將粗酶液在25～65℃條件下保存4h，期間每隔30min測定1次酶活力，以該酶在各溫度的初始酶活為100%，計算相對酶活。有機磷農(nóng)藥降解酶opdA在25～40℃酶活穩(wěn)定，見圖2（b），4h后酶活力仍保持在79%以上。45℃表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性，保溫4h酶活力后仍有48%。但溫度高于45℃后，有機磷農(nóng)藥降解酶opdA的穩(wěn)定性較差，4h后基本都失去了酶活。

圖2 反應(yīng)溫度對opdA的活力及穩(wěn)定性的影響

3.酶的最適pH及其穩(wěn)定性

在25℃、不同pH（4～10）的緩沖溶液中進行反應(yīng)，測定粗酶液的酶活，如圖3（a），當(dāng)pH在5.0～9.0時，酶活隨著pH的升高逐漸升高，最適pH為9.0；pH高于9.0后，酶活下降，但在pH為10.0時還保持80%左右的酶活力。將粗酶液保存在不同pH（4，5，6，7，8，9，10）緩沖液中，在室溫（25℃）下放置4h，期間每隔0.5h測定1次酶活，以該酶在各pH的初始酶活為100%，計算該酶各時間段所對應(yīng)的相對酶活。如圖3（b）所示，有機磷農(nóng)藥降解酶opdA在pH6～10都具有較好的穩(wěn)定性，4h后仍能保持90%以上的酶活，當(dāng)pH值為4～5時，酶活力快速下降。

圖3 反應(yīng)pH對opdA的活力及穩(wěn)定性影響4.金屬離子對酶活的影響

配置濃度不同金屬離子溶液，使稀釋后的待測粗酶液中金屬離子的終濃度為10mmol/L，室溫（25℃）保存30min，測定酶活。以去離子水稀釋的酶液作為空白對照，結(jié)果如圖4所示。Mg2+、Mn2+對opdA有一定促進的作用，F(xiàn)e2+、Al3+對opdA表現(xiàn)較強的抑制作用，K+、Na+等其他金屬離子對opdA活性影響不顯著。

圖4 不同金屬離子對opdA酶活力的影響

5.有機磷農(nóng)藥降解酶opdA廣譜性測試

選用甲基對硫磷、敵百蟲、敵敵畏、辛硫磷、毒死蜱等5種農(nóng)藥，利用膽堿酯酶抑制率法進行有機磷農(nóng)藥降解酶opdA對不同有機磷農(nóng)藥殘留降解效果的研究，在測試緩沖溶液中加入一定量的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)液，測試組分別加入50ppm有機磷農(nóng)藥降解酶opdA，對照組加入等量去離子水，靜置10min后取樣檢測農(nóng)殘，具體結(jié)果如圖5所示。加入有機磷農(nóng)藥降解酶opdA進行酶處理的所有組別中，膽堿酯酶抑制率均低于50%，為農(nóng)殘陰性；而對照組的膽堿酯酶抑制率均在93%以上，為陽性。實驗結(jié)果表明，有機磷農(nóng)藥降解酶opdA對本次實驗所選的5種不同的有機磷農(nóng)藥均有不同程度的降解能力，僅經(jīng)過10min時間處理即可使農(nóng)藥降解，測試結(jié)果由陽轉(zhuǎn)陰，降解酶opdA的廣譜性佳。進一步研究該酶的應(yīng)用，對消除環(huán)境或者農(nóng)產(chǎn)品中的農(nóng)藥污染具有廣泛的應(yīng)用前景。

圖5 有機磷農(nóng)藥降解酶opdA對不同有機磷農(nóng)藥降解效果圖