□ 鄭佩華 蘇勝艷
(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué),廣東 廣州 510650;2.瑞辰星生物技術(shù)(廣州)有限公司,廣東 廣州 510650)
有機磷農(nóng)藥是目前我國使用最廣泛的殺蟲劑,長期大量的使用對生態(tài)環(huán)境和人類健康產(chǎn)生的負(fù)面影響越來越嚴(yán)重,尤其是在農(nóng)產(chǎn)品中產(chǎn)生的農(nóng)藥殘留引起人們的廣泛關(guān)注[1,2]。有機磷農(nóng)藥降解酶通過破壞分子中的磷酯鍵使農(nóng)藥失去或降低毒性[3]。通常一種有機磷農(nóng)藥降解酶可同時對多種有機磷農(nóng)藥起降解作用。生物降解法在農(nóng)殘降解領(lǐng)域具有極大的潛力[4]。本文選擇工程菌株實現(xiàn)有機磷農(nóng)藥降解酶opdA在大腸桿菌中的高效表達,通過高壓均質(zhì)破碎和高速離心分離胞內(nèi)酶opdA,分析opdA的酶學(xué)性質(zhì),研究結(jié)果為opdA的后續(xù)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
E.coliBL21(DE3)/pET-28a-opdA為本實驗室構(gòu)建及保存。
LB培養(yǎng)基:稱取氯化鈉10g、蛋白胨10g、葡萄糖1g、酵母提取物5g,溶解至1L蒸餾水中;再加入瓊脂15g/L即為固體培養(yǎng)基。
發(fā)酵培養(yǎng)基:磷酸二氫鉀72g/L,一水檸檬酸2.0g/L,檸檬酸鐵銨0.3g/L,七水硫酸鎂5.0g/L,甘油3.6g/L,濃硫酸0.02%,微量金屬溶液0.2%,pH調(diào)節(jié)到4.5~5.0。
UV-1900i分光光度計,日本島津;LYNX6000落地式離心機,ThermoScientific;C1000PCR儀,伯樂生命;SCIENTZ-ⅡD超聲波破碎儀,寧波生物。
將實驗室保藏的冷凍菌體取出解凍后,接入裝有LB液體培養(yǎng)基的250mL三角搖瓶,恒溫培養(yǎng)過夜復(fù)活菌體,取復(fù)活菌體稀釋涂布到LB固體培養(yǎng)基上,培養(yǎng)至長出單菌落后,挑一環(huán)接入LB斜面上,37℃培養(yǎng)至長出菌落,這就是E.coli斜面,在生物安全柜的無菌環(huán)境中,挑一環(huán)接入LB培養(yǎng)基中,恒溫培養(yǎng)至菌體OD600為1.0~2.0,這就是種子液。
將準(zhǔn)備好的發(fā)酵培養(yǎng)基加入到發(fā)酵罐中,種子液按2%的量接入,設(shè)定發(fā)酵參數(shù)進行發(fā)酵培養(yǎng)。監(jiān)測相關(guān)參數(shù)。待菌量進入對數(shù)生長期時,以終濃度為1.0mmol/L的量加入誘導(dǎo)劑IPTG,間隔1小時取樣進行超聲破碎,檢測酶活及菌量,在28℃條件下誘導(dǎo)表達至菌量穩(wěn)定,酶活最高時,結(jié)束發(fā)酵。
按上述培養(yǎng)方法收集的菌體,加入勻質(zhì)緩沖液(60mL/L)和曲拉通TritonX-100(7mL/L),在4℃條件下進行高壓均質(zhì)破碎,完成破碎后加入終濃度為3mmol/L氯化鋅溶液以穩(wěn)定酶的結(jié)構(gòu),破碎后的液料進一步進行離心分離,得到胞內(nèi)酶opdA,此為粗酶液。
甲基對硫磷純品(北京中科質(zhì)檢);蛋白質(zhì)Marker(Fermantas);TEMED標(biāo)準(zhǔn)蛋白及其他相關(guān)試劑均購自上海麥克林生化科技公司。
采用Bradford法[5],配置系列濃度為0、10、20、40、60、80、100(單位:μg/mL)的牛血清蛋白溶液,加入考馬斯亮藍G-250,測定波長595nm位置處的吸光值,得到回歸方程y=0.0073x+0.0983,相關(guān)系數(shù)R2=0.9941,樣品蛋白含量通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算。
制備分離膠和濃縮膠,移取經(jīng)過適當(dāng)稀釋的粗酶液樣品和蛋白Marker加入到不同樣品槽中,將電泳槽放置到電泳儀上進行電泳。待電泳結(jié)束,用R250染色液對電泳凝膠進行染色,然后脫色至背景顏色為透明。估算出有機磷降解酶蛋白的分子量大小。
1.酶活力測定步驟
準(zhǔn)確吸取960μL測試緩沖液于1.5mL離心管中,加入含有20μL濃度為3mmol/L甲基對硫磷-甲醇底物溶液,加入20μL經(jīng)過適當(dāng)稀釋的粗酶液,用分光光度計測定在400nm位置處0~5min的吸光度。計算水解產(chǎn)物PNP的含量和opdA酶活[7]。酶活單位定義:室溫下每分鐘水解底物產(chǎn)生1μmolPNP所需要的酶量。
2.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
用測試緩沖溶配制濃度為0、5、10、20、40、60、80、100(單位:μmol/L)的硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)系列溶液,在400nm位置比色測得對應(yīng)的吸光值。得到回歸方程為y=0.017x+0.0085,相關(guān)系數(shù)R2=0.9998。
1.硫酸銨的分級沉淀
在冰水浴中向粗酶液中加入占溶液總量的百分比為30%的硫酸銨固體,在0~4℃環(huán)境中平衡過夜后,轉(zhuǎn)移至離心管,超高速冷凍離心后,取出下層沉淀物,溶于少量0.05mmol/LTris-HCl緩沖液中,進一步透析后用聚乙二醇將酶液濃縮,裝瓶冷藏于4℃冰箱種備用。
2.純化結(jié)果(見表1)
表1 有機磷農(nóng)藥降解酶opdA的分離純化
后續(xù)測定所使用的酶液為高壓均質(zhì)破碎、高速離心后的粗酶液,測定中的底物均為3mmol/L甲基對硫磷,每個測定條件設(shè)置3個平行試驗。
1.酶的純度及分子量
將上述粗酶液分別稀釋10倍、100倍、1000倍,取樣進行凝膠電泳,結(jié)果如圖1所示。當(dāng)樣品稀釋10倍,100倍時,目的蛋白條帶明顯,大小約為35KDa,稀釋1000倍的條帶較淡看不清楚,可得知有機磷農(nóng)藥降解酶opdA的分子大小為35KDa。
圖1 重組opdA誘導(dǎo)表達的SDS-PAGE分析
2.酶的最適溫度及其穩(wěn)定性
在pH8.0,不同溫度條件下測定酶活,opdA的最適反應(yīng)溫度見圖2(a),隨著溫度的上升,opdA酶活先上升后下降。35℃為opdA酶的最適反應(yīng)溫度。將粗酶液在25~65℃條件下保存4h,期間每隔30min測定1次酶活力,以該酶在各溫度的初始酶活為100%,計算相對酶活。有機磷農(nóng)藥降解酶opdA在25~40℃酶活穩(wěn)定,見圖2(b),4h后酶活力仍保持在79%以上。45℃表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性,保溫4h酶活力后仍有48%。但溫度高于45℃后,有機磷農(nóng)藥降解酶opdA的穩(wěn)定性較差,4h后基本都失去了酶活。
圖2 反應(yīng)溫度對opdA的活力及穩(wěn)定性的影響
3.酶的最適pH及其穩(wěn)定性
在25℃、不同pH(4~10)的緩沖溶液中進行反應(yīng),測定粗酶液的酶活,如圖3(a),當(dāng)pH在5.0~9.0時,酶活隨著pH的升高逐漸升高,最適pH為9.0;pH高于9.0后,酶活下降,但在pH為10.0時還保持80%左右的酶活力。將粗酶液保存在不同pH(4,5,6,7,8,9,10)緩沖液中,在室溫(25℃)下放置4h,期間每隔0.5h測定1次酶活,以該酶在各pH的初始酶活為100%,計算該酶各時間段所對應(yīng)的相對酶活。如圖3(b)所示,有機磷農(nóng)藥降解酶opdA在pH6~10都具有較好的穩(wěn)定性,4h后仍能保持90%以上的酶活,當(dāng)pH值為4~5時,酶活力快速下降。
圖3 反應(yīng)pH對opdA的活力及穩(wěn)定性影響4.金屬離子對酶活的影響
配置濃度不同金屬離子溶液,使稀釋后的待測粗酶液中金屬離子的終濃度為10mmol/L,室溫(25℃)保存30min,測定酶活。以去離子水稀釋的酶液作為空白對照,結(jié)果如圖4所示。Mg2+、Mn2+對opdA有一定促進的作用,F(xiàn)e2+、Al3+對opdA表現(xiàn)較強的抑制作用,K+、Na+等其他金屬離子對opdA活性影響不顯著。
圖4 不同金屬離子對opdA酶活力的影響
5.有機磷農(nóng)藥降解酶opdA廣譜性測試
選用甲基對硫磷、敵百蟲、敵敵畏、辛硫磷、毒死蜱等5種農(nóng)藥,利用膽堿酯酶抑制率法進行有機磷農(nóng)藥降解酶opdA對不同有機磷農(nóng)藥殘留降解效果的研究,在測試緩沖溶液中加入一定量的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)液,測試組分別加入50ppm有機磷農(nóng)藥降解酶opdA,對照組加入等量去離子水,靜置10min后取樣檢測農(nóng)殘,具體結(jié)果如圖5所示。加入有機磷農(nóng)藥降解酶opdA進行酶處理的所有組別中,膽堿酯酶抑制率均低于50%,為農(nóng)殘陰性;而對照組的膽堿酯酶抑制率均在93%以上,為陽性。實驗結(jié)果表明,有機磷農(nóng)藥降解酶opdA對本次實驗所選的5種不同的有機磷農(nóng)藥均有不同程度的降解能力,僅經(jīng)過10min時間處理即可使農(nóng)藥降解,測試結(jié)果由陽轉(zhuǎn)陰,降解酶opdA的廣譜性佳。進一步研究該酶的應(yīng)用,對消除環(huán)境或者農(nóng)產(chǎn)品中的農(nóng)藥污染具有廣泛的應(yīng)用前景。
圖5 有機磷農(nóng)藥降解酶opdA對不同有機磷農(nóng)藥降解效果圖